Coleta das amostras e análise histológica e morfométrica

No G1 foram coletadas a amostra do nervo fibular comum direito (N1) e os músculos tibiais cranial direito e esquerdo (M). No G2 foram coletadas amostra do coto proximal (N2), amostra do nervo fibular comum distal à secção nervosa (N1) e os músculos tibiais craniais direito e esquerdo (M). De G3 a G7 foram coletados o segmento do coto proximal (N2), amostra do nervo fibular comum distal à neurorrafia látero-terminal (N1), o segmento correspondente à neurorrafia (N3), assim como os músculos tibiais craniais direito e esquerdo (M). Após a coleta das peças, os animais receberam dose letal de pentobarbital sódico, via intraperitoneal. As meças N1 e N3 tinham cerca de 0,5cm, N2 tinha cerca de 0,5cm incluindo tecido conjuntivo adjacente.

Processamento das amostras dos músculos: os músculos tibiais craniais foram congelados em nitrogênio líquido e submetidos a secções transversais de 7µm em criostato Leica CM 1850. As secções foram feitas na região central do músculo, em sentido transversal. Foram feitos quatro cortes para a escolha do melhor, os cortes foram corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina (HE).

Todas as lâminas foram escaneadas no scanner de Imagens Apério ScanScope, 2003, Leica Biosystems (versão V11.2.0.780) do Hospital AC Camargo em São Paulo. Após escaneadas, as lâminas (uma para cada animal) foram analisadas pelo programa do mesmo aparelho. Cinco campos foram escolhidos sob o aumento de 10 vezes, um em cada quadrante e um campo central, de cada corte histológico, todas as fibras desses campos foram analisadas. As imagens foram salvas e analisadas quanto às medidas de área e diâmetro mínimo das fibras musculares sob aumento de 20X.

Processamento das amostras de nervos: os fragmentos nervosos de N1 e N2 foram fixados em Karnovisk e preparados através do uso de historesinas no laboratório de patologia da UNIPEX (UNESP/Botucatu). O micrótomo fez secções transversais nos fragmentos N1 e longitudinais nos fragmentos de N2 com espessura de 0,5 micra.

Os fragmentos nervosos submetidos a cortes longitudinais (N2) foram corados com a coloração de prata de Bielschowsky. Os fragmentos nervosos submetidos a cortes transversais (N1), foram corados com azul de toluidina a 0,25%.

Todas as lâminas foram escaniadas pelo scanner de lâminas Pannoramic Viewer, 2012, 3DHISTECH Ltda. (versão 1.15.3) do laboratório de Patologia da UNESP. As lâminas foram analisadas pelo programa do mesmo equipamento.

Nas lâminas digitalizadas foi feita a contagem do número de fibras nervosas, medida de área das fibras nervosas, área do axônio e da bainha de mielina, diâmetro mínimo dos axônios e da fibra nervosa, espessura da bainha e razão G. Cinco campos foram analisados em cada lâmina, um em cada quadrante e um campo central, todas as fibras nervosas nesses campos foram analisadas, em um aumento de 400 vezes.

Os segmentos correspondentes a N3 foram fixados em formol 10% tamponado e encaminhados ao laboratório de histologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP onde foram emblocadas em parafina. Os cortes foram longitudinais de 0,3 micras.

Uma lâmina corada por hematoxilina e eosina (HE) foi feita do segmento N3 de cada animal dos grupos de 3 a 7 a fim de se observar o brotamento do nervo doador para o nervo receptor. Outras quatro lâminas foram destinadas ao estudo imunoistoquímico.

Estudo Imunoistoquimico

Cinco animais de cada grupo de 3 a 7 foram escolhidos aleatoriamente em cada grupo. Para cada um desses animais foram confeccionadas quatro lâminas, cujos cortes foram estendidos em lâminas siladas. Os anticorpos utilizados para o estudo imunoistoquímico foram: CD105 usado para avaliar a formação de rede de neovasos, CD34 para avaliar a vascularização existente, a proteína S100 para avaliar a presença de células de Schwann, CD90 usado para tentar identificar células-tronco mesenquimais. A técnica de imunoistoquímica foi automatizada. Protocolo da Reação de Imunoistoquimica:

1) Desparafinização em xilol, passagem em etanol e hidratação.

3) Recuperação antigênica em citrato de sódio 0,21% (pH 6.0) em câmara de pressão (PASCAL - DAKO) por 3 minutos.

4) Incubação com o anticorpo primários (CD34 1:50 BIOR BYT ORB27549), (CD105 1:100 BIOR BYT ORB10285), (S100 1:100 NOVUS BIOLOGICAL NB100-91955), (CD90- HIS51 1:50 NOVUS BIOLOGICAL NBP200312) por 30 minutos.

5) Incubação com os anticorpos secundários (Conjugado Anti-Mose/Anti-Rabbit) por 10 minutos e terciário utilizando-se o método de detecção por polímeros por 10 minutos (CELL MARQUE 954D).

6) Revelação com o cromógeno 3,3-diaminobenzidina por 5 minutos (CELL MARQUE 957D).

7) Contra-coloração com hematoxilina segundo Harris por 1 minuto.

8) desidratação em etanol, diafanização em xilol e montagem em resina sintética.

Quadro 4 - Especificações dos anticorpos utilizados:

AC Clone Diluição Fabricante Imunoexpressão

S100 Policlonal

de Coelho 1:100

Novus

Biologicals Células de Schwann

CD34 ORB27549 1:50 Biorbyt Endotélio

Vascularização

CD90 HIS51 1:50 Novus

Biologicals

Células-Tronco Mesenquimais CD105 ORB10285 1:100 Biorbyt Neovascularização

A leitura do Estudo Imunoistoquímico e lâminas coradas pela HE do segmento N3 foi realizada por dois pesquisadores simultaneamente: a pesquisadora principal e uma patologista (MACD), com microscópio binocular.

Escore de Leitura do Estudo Imunoistoquímico

Para leitura do estudo imunoistoquímico utilizou-se um escore da reação dos marcadores S100, CD34, CD90 e CD105. Para a intensidade a variação foi de 0 a 3. Para o resultado zero (0), não houve nenhuma reação. Para resultado um (1), a reação foi de fraca intensidade. Para dois (2), a reação foi de moderada intensidade. Para três (3) a reação foi de forte intensidade.

Quanto à extensão a variação foi de 0 a 3. Considerou-se zero (0) quando não houve reação. Resultado um (1) quando a extensão foi de até um terço da lâmina, resultado dois (2) quando a extensão foi de um a dois terços da lâmina e resultado três (3) se a extensão da reação foi vista acima de dois terços da lâmina.

Leitura das lâminas coradas em HE

Realizou-se avaliação morfológica semiquantitativa de 0 a 4 cruzes para os elementos avaliados: vasos, hemorragia, edema e reação inflamatória. Em que zero (0) foi a ausência dos elementos avaliados, um (1) quantidade discreta, dois (2) quantidade moderada e três (3) grande quantidade e (4) quantidade intensa dos elementos avaliados.

Avaliou-se o tipo de células presentes na reação inflamatória. E na observação do granuloma o critério adotado foi presença ou ausência.