A coleta de sangue foi realizada com o voluntário em jejum de 12-14 h, preferencialmente por meio da punção da veia antecubital. Para tanto, o voluntário permaneceu sentado, com o braço a ser puncionado apoiado (um pouco abaixo da linha do ombro) sobre uma mesa, com o cotovelo levemente fletido. Nos casos em que não foi possível a punção da veia antecubital, o procedimento para a retirada do sangue foi realizado na veia do dorso da mão.
O sangue foi coletado em dois tubos a vácuo devidamente identificados, cada um no volume de 2 ml. Um dos tubos foi destinado à extração do material genético e outro para a quantificação do perfil lipídico.
Todo o material utilizado para a coleta sanguínea foi descartado em recipiente adequado, no caso uma caixa descartex, marca descarpack®, com capacidade para 13 litros. Depois de atingida a capacidade máxima do recipiente, o mesmo foi destinado a uma lixeira hospitalar.
5.5.1 Lipemia sérica
O sangue destinado à análise da lipemia sérica foi coletado em tubo com acelerador de coagulação (tampa vermelha). Após a coagulação, o sangue foi centrifugado em uma centrifuga (CELM®) a 3000 rotações por 15 minutos, afim de que o soro fosse separado da porção celular. Logo em seguida, por meio de uma pipeta (Gilson ), com® capacidade de 1ml, o soro foi transferido para um microtubo (eppendorf®) e armazenado sob refrigeração até ser transportado ao laboratório particular na cidade de Chapecó – SC, 65 km do município de Saudades. Para o transporte o soro foi previamente acondicionado em caixas térmicas contendo gelo reciclável.
No laboratório, o colesterol total, as VLDL e a HDL, bem como os triglicerídeos foram quantificados por meio de um espectrofotômetro automático, modelo Cobas Mira Plus
Roche®, utilizando-se reagentes bioquímicos Labtest®.
As LDLs foram estimadas por meio da fórmula de Friedewald, Levy e Fredrickson (1972), em que a LDL = [(Triglicerídeos÷5)+HDL]–CT. Aqueles indivíduos que apresentaram triglicerídeos maior que 400 mg/dL tiveram as concentrações de LDL obtidas por meio de dosagem direta.
A lipemia sérica foi avaliada considerando os valores de referências propostos pela I Diretriz de Prevenção da Aterosclerose na Infância e na Adolescência (2005) (Quadro 4). Os sujeitos foram classificados em dois grupos, para cada componente da lipemia sérica. Os voluntários com lipemia sérica dentro dos intervalos limítrofes ou aumentados foram alocados no grupo alterado. Aqueles com concentrações fora desses intervalos foram alocados no grupo normal.
Classificação Lipídeos Desejáveis (mg/dL) Limítrofes (mg/dL) Aumentados (mg/dL) Colesterol total < 150 150 -169 ≥ 170
Lipoproteína de baixa densidade (LDL) < 100 100 -129 ≥ 130
Lipoproteína de alta densidade (HDL) ≥ 45 - -
Triglicerídeos < 100 100 -129 ≥ 130
Quadro 4 - Valores de referência lipídica para a faixa etária de 2 a 19 anos.
Fonte: adaptado da I Diretriz de Prevenção da Aterosclerose na Infância e na Adolescência (2005).
5.5.2 Obtenção do DNA genômico
O sangue destinado à analise gênica foi coletado em tubos contendo o anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Após a coleta, as amostras foram congeladas em sua forma total e posteriormente transportadas ao laboratório de Imunogerontologia da Universidade Católica de Brasília. Para o transporte, o sangue foi mantido acondicionado em caixas térmicas contendo gelo reciclável.
Da amostra de sangue, especificamente dos leucócitos, foi extraído o DNA genômico por meio do método Salting Out do protocolo modificado de Miller; Dykes; Polesky (1988). Para a lise dos leucócitos e a remoção das membranas lipídicas, uma amostra (750 µl) de sangue foi colocada em um microtubo de 1,5 ml, sendo adicionado ao mesmo 750 µl de Tampão A [sacarose (0,32M), Tris-HCl (10mM, pH 7,6), cloreto de magnésio (5mM) e detergente não iônico Triton X-100 (1%)]. Em seguida, o conteúdo do microtubo foi homogeneizado e em seguida centrifugado a 5000 rpm por 15 min.
O sobrenadante formado foi desprezado e o precipitado no fundo do tubo foi suspenso em 350 µl de Tampão B [EDTA (25mM) e cloreto de sódio (75mM) no pH 8,0]. Além desse, foi adicionado 35 µl de dodecil sulfato de sódio (10%) e 5,5 µl proteinase K (10 mg/ml). Em seguida, o conteúdo do microtubo foi homogeneizado e exposto a uma temperatura de 55°C, por 1h. Ao término desse período, foi adicionado ao microtubo 100 µl de cloreto de sódio (35,06%) para que os resíduos celulares e protéicos se precipitassem Em seguida, foi realizada uma nova centrifugação a 3000 rpm, durante 15 minutos para que os resíduos precipitados se condensassem no fundo do tubo e o sobrenadante fosse novamente formado.
O sobrenadante formado foi transferido para um novo microtubo devidamente identificado, onde foi adicionado etanol a 95% na proporção de duas vezes o volume contido no tubo. Em seguida, o conteúdo do microtubo foi homogeneizado por meio de leves
inversões. Com a precipitação do DNA, uma nova centrifugação, a 2500 rpm por 5 minutos, foi realizada para que o DNA fixa-se no fundo do tubo e o etanol pudesse ser descartado. Com o objetivo de conservar o DNA, após a evaporação do etanol foi adicionado ao tubo 100µl de tampão TE (Tris + EDTA). Em seguida, o tubo foi exposto a uma temperatura de 37ºC, durante 1h, e posteriormente armazenado sob refrigeração.
5.5.3 Quantificação do DNA
Por meio de inspeção visual, as concentrações de DNA foram estimadas. Para tanto, 8µl do DNA extraído foram misturados a 2µl de tampão de carregamento (glicerol, EDTA e azul de bromofenol). Em seguida, essa mistura foi aplicada em um dos poços formados no gel de agarose a 1%, o qual foi corado com 1,5µL de brometo de etídio. Como padrão para a quantificação, o padrão lambda em concentrações de 20, 40, 100, 200 e 400 ng/µL também foi aplicado no gel. Em seguida, o gel foi submetido à eletroforese a 60V por 30 minutos. Após a eletroforese, o gel (Figura 5) foi visualizado sob luz ultravioleta e as “bandas” de DNA comparadas com o padrão lambda. Em seguida, o gel foi fotodocumentado e descartado.
Figura 4. Foto do gel de agarose visualizado sob luz ultravioleta, após a eletroforese (escritas brancas – DNA das amostras / escritas vermelhas – padrão lambda).
5.5.4 Amplificação do DNA
Os segmentos polimórficos do gene APOE foram amplificados de acordo com o método descrito por Donohoe et al (1999), com modificações (PAULA et al., 2010). Para tanto, foram desenvolvidas duas reações em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reactions – PCR) independentes com base no sistema de amplificação refratária a mutações (amplication refractory mutation system - ARMS). Segundo este sistema, primers foram desenhados de modo que cada nucleotídeo da extremidade 3’ do respectivo primer pareasse com A ou G codantes dos aminoácidos arginina ou cisteína respectivamente ocupantes das posições 112 e 158 do gene. Assim, foram desenhados os primers Cys158 (5’ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3’), Arg158 (5’ATGCCGATGACCTGCAGAATC-
3’), Cys112 (5’CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’) e Arg112 (5’CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’), de modo que os dois primeiros fossem capazes de
amplificar as variações da posição 158, enquanto os dois últimos, a região do códon polimórfico 112. Adicionalmente, foi utilizado o primer comum ApoEr (5’- GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3’) para compor par com os primers Arg/Cys158 ou Arg/Cys112 e produzir produtos de amplificação de 588 e 451 pares de base (pb) respectivamente.
Cada genótipo foi determinado pela realização simultânea de duas reações de PCR, no qual a primeira (Mix A) era constituída pelos primers Cys158 (25µM) Cys112 (25µM) e ApoEr (25µM). Similarmente, a segunda reação (MixB) continha a combinação de primers Arg158 (25µM), Arg112 (25µM) e ApoEr (25µM). Assim, cada amostra foi representada por duas reações.
Cada reação utilizou 50 ng de DNA genômico, 200 mmol/L de cada desoxinucleotídeo, 10 mM de tampão Tris-HCl [pH 9,2], 1,5mM de MgCl2, 25mM de KCl,
80 g/L de dimetilsulfóxido (DMSO). 1 U de Taq Platinum, 10 mg/ml de ovalbumina e água Milli Q qsq compondo um volume final de 25µL de reação.
Após o preparo de cada reação de PCR, as amostras foram colocadas em um termociclador da marca Biocycler®, modelo MJ96+. Para a desnaturação inicial do DNA na amplificação do PCR, foi utilizado “hot start” a 80 °C por 1 minuto, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 96 °C por 45 segundos, anelamento a 66 °C por 45 segundos, e extensão a 72 °C por 45 segundos, seguido por um ciclo final de extensão a 72 °C por 5 min.
5.5.5 Identificação dos genótipos
Para a identificação dos genótipos os fragmentos de DNA amplificados na PCR foram separados por meio de eletroforese. Para tanto, 8 µl de cada reação (Mix A e B) foram misturados a 2 µl de tampão de carregamento (glicerol, EDTA e azul de bromofenol). Após a homogeneização, a mistura foi aplicada em gel de agarose a 1,6%, corado com 1,5 µl de brometo de etídio. A duas reações de cada amostra (Mix A e B) foram aplicadas lado a lado. Como padrão para os tamanhos dos fragmentos de DNA, um marcador ladder, com peso molecular de 100 pares de bases, também foi aplicado ao gel. Em seguida, esse foi submetido à eletroforese a 60V por aproximadamente 37 minutos. Finalizado esse processo, o gel foi visualizado sob luz ultravioleta, em transluminador, e os fragmentos de DNA identificados.
Cada amostra foi classificada em seis diferentes genótipos (Figura 5), de acordo com os seguintes critérios:
¾ ε2/2 - presença de um fragmento de 588 e de um de 451 pares de base no mix A;
¾ ε3/3 - presença de um fragmento de 588 pares de base no mix A e um de 451 no mix B;
¾ ε4/4 - presença de um fragmento de 588 e de um de 451 pares de base no mix B;
¾ ε2/3 - presença de um fragmento de 588 e de um de 451 pares de base no mix A, bem como a
presença de um fragmento de 451 pares de base no mix B;
¾ ε2/4 - presença de um fragmento de 588 e de um de 451 pares de base no mix A e no mix B;
¾ ε3/4 - presença de um fragmento de 588 pares de base no mix A, bem como a presença de um
fragmento de 588 e de 451 pares de base no mix B.
Figura 5. Modelo de genotipagem da APOE.
Para as análises subsequentes, a amostra foi categorizada em três grupos genotípicos, a saber: grupo ε2 (genótipos ε2/3 e ε2/2), ε3 (genótipo ε3/3) e ε4 (genótipos ε3/4 e ε4/4). Os
portadores do genótipo ε2/4 (n=8), devido à presença simultânea de alelos com efeitos antagônicos sobre a lipemia, não foram considerados nas comparações entre os alelos e nas análises de associação.