Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido

O conceito de partículas peliculares ou superficialmente porosas, constituídas por um núcleo sólido e uma fina camada porosa, foi inicialmente sugerido por Hórvath e Lipsky, na década de 60, e foi aplicado a colunas de cromatografia de troca iônica, um tipo de cromatografia líquido-sólido. O desenvolvimento dessas partículas foi realizado considerando o princípio de que o menor caminho de difusão presente nas partículas peliculares, comparado ao presente nas partículas totalmente porosas, poderia propiciar uma difusão mais rápida do analito, aumentando a eficiência cromatográfica. Apesar da excelente capacidade de separação apresentada por essas partículas, elas não foram adotadas pela comunidade científica pelo fato de a cromatografia de troca iônica apresentar aplicação limitada. Na época, o interesse maior era pela cromatografia líquido-líquido [14].

Também na década de 60 e pelo mesmo motivo, Kirkland e colaboradores desenvolveram as chamadas shell particles, constituídas por um núcleo sólido e por uma camada porosa mais espessa do que a sugerida por Hórvath e Lipsky. Kirkland foi o primeiro pesquisador a desenvolver partículas desse tipo aplicadas à cromatografia líquido-líquido. Na década de 70, colunas como Corasil® I e II, da Waters, empacotadas com shell particles, foram comercializadas. Entre 5 e 10% do volume dessas partículas era ocupado pela camada porosa. Apesar do sucesso inicial, com o passar do tempo percebeu-se que essas colunas eram instáveis: rapidamente perdiam fase estacionária, arrastada pela fase móvel, gerando análises de baixa reprodutibilidade. Além disso, constatou-se a baixa capacidade de amostra em consequência da menor superfície porosa desse tipo de partícula [14].

Ao mesmo tempo em que as limitações das shell particles foram evidenciadas, eram produzidas partículas totalmente porosas com diâmetros cada vez menores, capazes de gerar análises extremamente eficientes. A redução do tamanho das partículas totalmente porosas passou a ser o foco das pesquisas e os estudos envolvendo as shell particles foram temporariamente interrompidos [14].

Recentemente, a necessidade de desenvolver colunas eficientes que pudessem operar em equipamentos de HPLC levou ao desenvolvimento de novas gerações de

colunas empacotadas com shell particles. As colunas empacotadas com partículas totalmente porosas de tamanho muito reduzido, apesar de eficientes, geram pressões acima de 400 bar, sendo compatíveis com equipamentos de UHPLC. Pensando nisso, em 1992 a Agilent desenvolveu a coluna Poroshell 300®_,

constituída por partículas de 7 μm de diâmetro, envolvidas por camada porosa de 1 μm. Entretanto, o real sucesso dessas partículas ocorreu em 2006, com a introdução da coluna Halo core-shell® pela Advanced Material Technologies. Essa coluna é constituída por shell particles, de 2,7 μm de diâmetro, envolvida por 0,5 μm de camada porosa. A camada porosa, agora estável quimicamente, ocupa 75% do volume da partícula, e não apenas 10% como nas shell particles desenvolvidas na década de 60, solucionando o problema da baixa capacidade de amostra [14].

Procedimento típico de preparo das shell particles envolve a suspensão de partículas de sílica não porosas em uma mistura de etanol e água. Uma solução concentrada de hidróxido de amônio deve ser vertida sobre a suspensão, fazendo com que os grupos silanóis presentes na superfície da sílica fiquem carregados negativamente. Em seguida adiciona-se uma solução de surfactante orgânico catiônico (C18TABr+) e as moléculas desse surfactante, carregadas positivamente, são adsorvidas às partículas de sílica, que estão carregadas negativamente. Por último adiciona-se tetraetilortosilicato, que tem como função construir a estrutura de sílica porosa em torno das moléculas de surfactante adsorvidas. Finalmente, as novas partículas formadas são centrifugadas e o mesmo processo é repetido até que a espessura da camada porosa desejada seja alcançada [14].

As shell particles também têm sido chamadas fused core, core shell e porous shell. Em português, o termo mais empregado é partículas de núcleo fundido. As colunas com partículas de núcleo fundido (Figura 2.3), ao contrário das monolíticas, não são um sistema contínuo. São constituídas por um núcleo sólido de sílica fundida não poroso (core), normalmente de 1,6 ou 1,7 µm de diâmetro, revestido por uma parte externa porosa (shell) com espessura geralmente de 0,5 µm. Sendo assim, essas partículas possuem um diâmetro total de 2,6 ou 2,7 µm (Figura 2.4) [15]. Já há no mercado, entretanto, partículas de núcleo fundido com diâmetro total de 1,7 µm (núcleo de 1,25 µm de diâmetro e a parte externa de 0,23 µm de espessura),

1,3 µm, assim como partículas de 2,6 µm de diâmetro total com parte externa porosa de 0,35 µm e núcleo de 1,9 µm.

Figura 2.3 - Micrografia de partícula de núcleo fundido [16]

Figura 2.4 - Esquema de partícula de núcleo fundido [17]

As colunas de núcleo fundido possuem porosidade (_{ε) entre 50% e 60%. Na} literatura encontram-se descritos valores de _{ε iguais a 56% (Poroshell}® _{2,7 μm), 55%}

(Kinetex® 2,6 μm) e 51% (Halo® _{2,7 μm) [18, 19].A permeabilidade (K}

v0) desse tipo de coluna é inferior à observada em colunas monolíticas. Valores de Kv0 iguais a 1,18 x 10-14 m2 (Kinetex® 2,6 μm), 1,02 x 10-14 _m2 _(Halo® _{2,7 μm) e 0,99 x 10}-14 _m2

(Poroshell® 2,7 μm) foram descritos na literatura [20]. Observa-se que a retenção dos analitos em colunas com partículas de núcleo fundido é inferior à observada em colunas convencionais empacotadas com partíclas totalmente porosas. A explicação está no fato de o volume de fase estacionária presente em partículas de núcleo fundido ser inferior ao presente em partículas totalmente porosas [14].

O maior benefício de colunas com partículas de núcleo fundido é a possibilidade de redução do tempo de análise, com eficiência cromatográficacomparável à propiciada por colunas com partículas porosas sub 2 µm e manutenção da pressão em níveis compatíveis com os requeridos por um instrumento de HPLC (400 bar) [21].

Apesar das vantagens, de modo similar às colunas monolíticas há um número limitado de fabricantes (exemplos: Phenomenex, Agilent, Advanced Materials Technologies, Supelco) e de grupos químicos ligantes disponíveis, o que é um fator que contribui para a baixa utilização desse tipo de coluna [10]. Em cotação realizada no primeiro semestre de 2011, a coluna de núcleo fundido da marca Phenomenex (Kinetex® _{C18, 100 x 2,1mm, 2,6 µm) foi cotada em R$ 1490,00. Já a coluna da}

marca Agilent (Poroshell® C18, 100 x 2,1mm, 2.7 µm) foi cotada em R$ 975,00, preço próximo ao cobrado pelas tradicionais colunas convencionais.

Apesar de ainda pouco utilizada, há várias publicações empregando coluna de núcleo fundido. Exemplo é o trabalho publicado em 2011 por Kirkland e colaboradores, no qual é descrita a separação de nove proteínas, em menos de dois minutos, com resolução mínima de 1,5, utilizando-se coluna de núcleo fundido [22].