Comparação entre os métodos microbiológicos e a PCR

Do total de 80 amostras de hambúrgueres crus analisado, todas devidamente inspecionadas pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF), 32 (40,0%) das amostras apresentaram-se contaminadas pelo microrganismo Salmonella spp., estando assim em condições sanitárias insatisfatórias e impróprias para o consumo humano, conforme preconizado na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 12 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) do Ministério da Saúde (MS) (BRASIL, 2001). Sendo que destas, 14 (17,5%) foram identificadas somente pelos métodos microbiológicos; 10 (12,5%) somente pelo método da PCR e oito (10,0%) por ambos os métodos (FIGURA 14).

FIGURA 14. Número de amostras positivas para Salmonella spp. a partir dos métodos microbiológicos (convencional+Salmosyst) e da PCR.

De uma forma mais específica, podem-se discriminar os números de amostras positivas para Salmonella spp. através da seguinte maneira, no método da microbiologia convencional foram identificadas 17 (21,25%) amostras de hambúrgueres crus positivas para Salmonella spp., enquanto que no método Salmosyst foram identificadas 11 (13,75%) e na PCR foram diagnosticadas 18 (22,5%) amostras positivas (TABELA 12). Apenas três (7,5%) amostras foram positivas para Salmonella spp. para os três métodos.

TABELA 12. Número de amostras positivas para Salmonella spp. detectadas pelos métodos microbiológicos (convencional e Salmosyst) e pela reação em cadeia da polimerase, de acordo com o tipo de hambúrguer.

Tipo de Hambúrguer

Microbiologia

Convencional Método Salmosyst P C R

Salmonella

(+) Salmonella (–) Salmonella (+) Salmonella (–) Salmonella (+) Salmonella (–)

Bovino 9 31 3 37 8 32

Misto 8 32 8 32 10 30

TOTAL 17 63 11 69 18 62

O valor do teste do Qui-quadrado (χ2_{) calculado para se observar se} houve associação entre o tipo de hambúrguer e a incidência de Salmonella spp. de acordo com os métodos escolhidos – microbiologia convencional; método Salmosyst e PCR – (GL=5) foi de 3,209, para p=0,6679. Sendo menor que os valores tabelados para o nível de significância α=0,01 (15,09) e α=0,05 (11,07), concluindo-se serem não-significativos os desvios observados, podendo ser atribuídos ao acaso, isto é, a frequência de hambúrgueres contaminados por Salmonella spp., tanto do tipo de carne bovina quanto o misto, não dependeram do método de análise utilizado.

Das 18 amostras identificadas pela PCR, oito (10,0%) foram detectadas somente a partir do Caldo de Pré-enriquecimento da microbiologia convencional (Solução Salina Peptonada Tamponada – SSPT), após 24 horas de incubação; oito (10,0%) a partir do Caldo Seletivo de Enriquecimento do método Salmosyst, também após 24 horas de incubação e duas (2,5%) a partir de ambos os caldos (TABELA 13).

TABELA 13. Número de amostras positivas para Salmonella spp. detectadas pelos métodos microbiológicos (convencional e Salmosyst) e pela reação em cadeia da polimerase.

RESULTADOS

MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE Microbiologia

Convencional Salmosyst Método

A partir do Caldo de Pré-enriquecimento da Microbiologia Convencional (24 h) A partir do Caldo de Pré- enriquecimento com Suplemento do Método Salmosyst (24 h) Nº de amostras positivas para Salmonella spp. 17 (21,25%) 11 (13,75%) 10 (12,5%) 10 (12,5%) Nº de amostras negativas para Salmonella spp. 63 (78,75%) 69 (86,25%) 70 (87,5%) 70 (87,5%) TOTAL 80 80 80 80

O valor do teste do Qui-quadrado (χ2_{) calculado para se observar se} houve associação entre os diferentes resultados de detecção de Salmonella spp. em hambúrgueres crus de acordo com os métodos escolhidos (microbiologia convencional; método Salmosyst; PCR a partir da SSPT; PCR a partir do Caldo de Pré-enriquecimento com Suplemento Salmosyst) (GL=3) foi de 3,333, para p=0,3430. Sendo menor que os valores tabelados para o nível de significância α=0,01 (11,34) e α=0,05 (7,81), concluindo-se serem não-significativos os desvios observados, podendo ser atribuídos ao acaso, isto é, a frequência de amostras de hambúrgueres crus contaminados por Salmonella spp., não dependeram do método utilizado.

O valor calculado pelo teste de McNemar foi de 1,7143 com p=0,1904 (para microbiologia convencional e PCR) foi de 0,0 com p=1,0 (método Salmosyst e PCR), sendo todos menores que os tabelados para o nível de significância α=0,01 (6,64) e α=0,05 (3,84), indicando que não há discordância nos resultados de pesquisa de Salmonella spp. em hambúrgueres crus analisados pelos diferentes métodos de investigação.

Os resultados obtidos, em relação aos testes diagnósticos, foram indicativos que os métodos microbiológicos para pesquisa de Salmonella spp. em hambúrgueres apresentaram baixo valor de sensibilidade (36,36%), podendo, assim, apresentar indivíduos falsos-negativos, e alto valor à especificidade (82,76%), apresentando-se bastante confiável o seu diagnóstico quanto aos indivíduos negativos. Já a metodologia da PCR apresentou baixo valor para a sensibilidade (44,44%) e médio valor para especificidade (77,42%). Em ambos os métodos a precisão foi de 70,0%.

Os métodos microbiológicos e a PCR foram semelhantes em relação à identificação dos verdadeiros positivos, porém nos métodos microbiológicos foi observada uma melhor capacidade de identificar os verdadeiros negativos. Quanto à precisão, os dois métodos foram considerados com resultados regulares quanto à pesquisa de Salmonella spp. em hambúrgueres crus.

A importância da fase de pré-enriquecimento para a PCR pode ser evidenciada, tal como no presente trabalho, pela pesquisa de Salmonella spp. realizada por Rissato et al. (2011), em carcaças de frango resfriadas, pela técnica da PCR, onde das 30 amostras analisadas cinco (16,7%) foram positivas. Sendo que observou-se que a sensibilidade da PCR após pré-enriquecimento com incubação de 24 horas foi de 3,3% (1/30) e quando realizada após 48 horas de

incubação a sensibilidade aumentou para 16,7% (5/30). Em trabalho semelhante Mynt et al. (2006) verificaram que a PCR, sem a etapa de pré-enriquecimento não houve detecção da Salmonella spp., porém quando esta foi utilizada a sensibilidade aumentou para 79%. Santos et al. (2001b) e Croci et al. (2004) também confirmaram que a sensibilidade da PCR aumenta após a etapa do pré- enriquecimento.

Stone et al. (1995) descreveram que a etapa de pré-enriquecimento possui vantagens para a técnica da PCR, pois os caldos de enriquecimento são baratos, requerem pouca manipulação, diluem substâncias que podem inibir a PCR e aumentam o número de células bacterianas viáveis. Segundo Cheung e Kam (2012), para aumentar o limite de detecção de Salmonella spp., torna-se necessário incluir um pré-enriquecimento para permitir a multiplicação das células bacterianas da amostra. Além disso, esta etapa pode também ajudar a reduzir o risco de amplificar sequências a partir de células mortas na amostra.

Os resultados apresentados neste trabalho corroboram os de Silva et al. (2011) que compararam o isolamento microbiológico convencional com a PCR no diagnóstico de salmonelose em bezerros infectados experimentalmente e concluíram que pelo teste de McNemar o método convencional foi superior à PCR na detecção de amostras positivas para Salmonella Typhimurium. Também Oliveira et al. (2003) afirmaram que a PCR utilizando o pré-enriquecimento não seletivo foi o método menos sensível, para a detecção genérica de Salmonella em comparação com o método convencional.

Em contrapartida, Rall et al. (2009) pesquisaram Salmonella spp. em 50 amostras de carne de frango e 75 amostras de linguiças frescais, encontrando 27 (54%) amostras de carne de frango positivas através da PCR e apenas quatro (8%) pela metodologia convencional e 42 (56%) amostras de linguiças frescais contaminadas pela Salmonella spp. utilizando a PCR contra apenas sete (9,3%) pela metodologia convencional. Neste trabalho ficou evidente que a PCR foi mais sensível que a metodologia microbiológica convencional.

Os percentuais de isolamento encontrados nesta pesquisa, quer seja pelos métodos microbiológicos ou pelo método da PCR não corroboraram com os achados de outros pesquisadores, tais como os de Dickel et al. (2005b) que verificaram, em análise comparativa entre microbiologia convencional e PCR para pesquisa de Salmonella spp., ao analisarem 300 amostras de carne de frango, que no método convencional foi encontrado 170 (56,6%) amostras positivas,

enquanto que a PCR verificou-se 225 (75%) amostras contaminadas. Em pesquisa realizada por Kawasaki et al. (2001), com 98 amostras de diversos alimentos, 37 (37,76%) amostras foram positivas para Salmonella spp. através da metodologia convencional, 42 (42,86%) pela PCR e 34 (34,69%) por ambos os métodos. E de um total de 268 amostras suínas, Castagna et al. (2005) detectaram que 54 (20,15%) foram positivas para Salmonella spp. utilizando PCR, 42 (15,67%) pela metodologia convencional e 39 (14,55%) por ambos os métodos. Porém, nenhum destes trabalhos o alimento analisado era de hambúrguer cru bovino ou misto (carne bovina e carne de frango).