Para testar a capacidade de ligação de IFIT1 a mRNAs próprios, um ensaio de pulldown foi padronizado no qual o complexo trimérico IFIT1:IFIT2:IFIT3 caracterizado in vitro, foi incubado com mRNA de células HEK293Ts tratadas com IFN-I. Somente o mRNA de células tratadas foi utilizado, já que esse estímulo é suficiente para promover a formação do interatoma de IFITs em células (PICHLMAIR et al., 2011a).
Para diminuir a ocorrência de interações inespecíficas, isto é, interações dos mRNAs com outras regiões da proteína, que não o “binding pocket”, um RNA bloqueador foi utilizado em metade das amostras. Esse RNA OH-globina (descrito nos Materiais e métodos) foi previamente defosforilado, de forma que não interage com o binding pocket de IFIT1, mas pode interagir com outras regiões potencialmente carregadas. Além disso, um trímero contendo o mutante de IFIT1 (IFIT1-R38E:IFIT2:IFIT3) foi gerado e utilizado como controle. Essa mutação impede a ligação de mRNAs ao “binding pocket” de acordo com Kumar et al. (2013).
Para o experimento, células HEK293T foram tratadas com 1.000 UI/mL de IFNα 2a por 12 horas. Logo após, parte das células foram usadas para extração de proteína, e parte para extração do RNA total (Figura 22A). A indução de ISGs foi confirmada através de RT-qPCR e Western blot para IFIT1 (Figura 22B e C, respectivamente).
O mRNA das células tratadas foi purificado a partir do RNA total, usando microesferas magnéticas contendo oligo(dT)25 (Figura 22D, à esquerda). Já o RNA bloqueador foi produzido por transcrição in vitro e defosforilado pelo tratamento com uma fosfatase (Figura 22D, à direita).
71 Figura 22 - Tratamento das células HEK293Ts com IFN-I e preparação dos RNAs utilizados no
pulldown. (A) eletroforese em gel de agarose (1%) do RNA total de células tratadas (1.000 UI/mL,
12 horas) e não tratadas com IFNα2a. São apresentadas duas imagens do mesmo gel, em diferentes tempos de exposição, para evidenciar a presença de mRNAs celulares de tamanhos diversos. A indução de ISGs nessas células foi confirmada por RT-qPCR (B) e Western blot (C). (D) Eletroforese em gel de agarose (1%) de 1µg de mRNA (de células tratadas) e de RNA bloqueador (OH-globina) utilizados no pulldown. NT: células não tratadas; IFN: células tratadas com interferon.
Os trímeros, contendo IFIT1 selvagem ou mutante foram produzidos como descrito no item 4.6.8. Não houve diferença na formação do trímero quando utilizando o mutante (comparar Figura 23A e 23B). Os trímeros purificados, utilizados no experimento, foram avaliados por SDS-PAGE (Figura 23C).
Figura 23 - Produção dos trímeros para pulldown. Exemplos de cromatogramas de gel filtração para purificação do (A) trímero IFIT1:IFIT2:IFIT3 (pico com volume de retenção de 11,2 mL) ou (B) trímero IFIT1-R38E:IFIT2:IFIT3 (pico com volume de retenção de 11,19 mL). (C) As frações correspondentes aos trímeros IFIT1:IFI2:IFIT3 (a) ou IFIT1-R38E:IFIT2:IFIT3 (b) foram purificadas, concentradas e analisados por SDS-PAGE. mAU: mili Unidades de Absorbância.
Nos experimentos de otimização, foi observado que a quantidade de RNA nas amostras após o pulldown era muito pequena, até mesmo para quantificação por fluorimetria. No entanto, testes mostraram que era possível a preparação das bibliotecas e sequenciamento.
Para o RNAseq, as réplicas cada amostra (Tabela 8) foram divididas e sequenciadas em quatro lanes. Houve pouca variação na qualidade do sequenciamento entre as lanes e, em geral, a qualidade do sequenciamento base a base foi muito boa (pontuação acima de 20), como pode ser observado no exemplo da Figura 24A. Os adaptadores e as bases de baixa qualidade foram excluídos, sendo que após o processamento, todas as amostras (com exceção de 3A) resultaram em 89 a 93% de bases sobreviventes (3A: 85 a 88 %).
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O mapeamento das reads ao genoma humano (acrescido da sequência correspondente ao RNA de bloqueio) foi feito com o STAR. Entre 85 a 92 % das reads do transcriptoma total (amostra 7) e das amostras 1 e 2 (exceto 2C), mapearam no genoma em loci único. Já 2C, teve somente cerca de 5 % das reads mapeadas. A variação nessa porcentagem foi maior (45 a 89 %) nas amostras 3 e 4 (pulldowns com IFIT1-R38E). As amostras dos pulldowns sem trímero (5 e 6) tiveram entre 6 e 12 % de reads mapeadas. O resultado sumarizado do mapeamento pode ser observado na Figura 24B.
Tabela 8 - Descrição das amostras do RNAseq
Amostra e
replicatas Descrição
1A, 1B, 1C Pulldown IFIT1:IFIT2:IFIT3 + mRNA
2A, 2B, 2C Pulldown IFIT1:IFIT2:IFIT3 + mRNA + OH-globina 3A, 3B, 3C Pulldown IFIT1-R38E:IFIT2:IFIT3 + mRNA
4A, 4B, 4C Pulldown IFIT1-R38E:IFIT2:IFIT3 + mRNA + OH-globina
5 Pulldown sem trímero, com mRNA
6 Pulldown sem trímero, com mRNA e OH-globina
7 mRNA de células HEK293T, tratadas com IFN, utilizado nos pulldowns (transcriptoma total)
Após a contagem das reads que mapearam em cada posição do genoma, a variabilidade entre as lanes e réplicas foi avaliada. Como lanes da mesma amostra eram muito similares, seus dados foram agrupados em cada réplica. Já as réplicas de uma mesma amostra (principalmente aquelas contendo IFIT1-R38E) eram muito variáveis em conteúdo e não agrupavam, como observado na Figura 24C. Uma vez que, tal variabilidade poderia ser inerente ao experimento (as interações inespecíficas, que ocorrem fora do binding pocket, seriam aleatórias), as bibliotecas foram normalizadas somente pelo tamanho, e não pelo conteúdo.
Já normalizadas, as amostras foram comparadas conforme descrito no item 4.8.1 resultando numa de lista de 168 genes possivelmente enriquecidos para a ligação de IFIT1. A contagem desses mesmos genes foi avaliada em um heatmap (Figura 24D), onde observou-se um agrupamento melhor entre as réplicas das amostras e uma separação entre amostras contendo o trímero com IFIT1 selvagem versus o trímero de IFIT1-R38E.
73 Figura 24 - Análise RNAseq. (A) Exemplo do resultado da análise de qualidade do sequenciamento base a base usando fastQC (para a amostra representativa 2A, lane 002). (B) Resultado do mapeamento das reads ao genoma humano (acrescido da sequência correspondente ao RNA de bloqueio) com STAR. (C) Análise de componentes principais das bibliotecas das réplicas (r) das amostras 1, 2, 3, 4 e 7. A análise foi feita excluindo-se as contagens no gene correspondente ao RNA de bloqueio. Proporção da variância CP1: 23.89 % e CP2: 18.73 %. CP: componente principal. (D) Heatmap avaliando os 168 genes enriquecidos no pulldown com IFIT1 selvagem. As réplicas das amostras estão dispostas de acordo com a similaridade.
A análise de enriquecimento funcional dentre esses genes demonstrou um enriquecimento significativo (p<0,01) para processos biológicos relacionados ao citoesqueleto, resposta celular a citocinas, sinalização por citocinas, dentre outros (resultados apresentados no Anexo I). Baseado nos valores de expressão, da taxa de enriquecimento na amostra 2 e na análise de enriquecimento funcional, 19 genes foram escolhidos para validação dos dados obtidos no RNAseq, são eles: DAD1, CXCR4, PPARGC1A, STYK1, IKBKG, MYD88, NR1H3, ZNF584, LARP6, ENC1, TWF2, PIP4P1, CREB3, EGR1, CLU, FLT3, PELI3, FRS3, RAB26. Foram escolhidos também 3 genes que tiveram pouca variação no enriquecimento entre todas as amostras (UQCC1, TOP1, DDX58).
Esses genes foram avaliados quanto a estrutura secundária presente na extremidade 5’ UTR dos seus transcritos. No entanto, algumas dificuldades foram encontradas nessa análise: (1) um mesmo gene apresentava diversas isoformas com
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variações nos primeiros nucleotídeos da 5’ UTR; (2) o mFold geralmente produz mais de um dobramento possível para cada sequência de entrada. Somando esses dois pontos, um número grande de possíveis dobramentos era produzido para cada gene, e esses dobramentos apresentavam valores de variação de energia livre (delta G) diversos, dificultando a análise de correlação entre a estabilidade das estruturas próximo ao cap e a ligação por IFIT1. Exemplos de estruturas geradas para o gene IKBKG estão no Anexo II.
5.11.1 Validação dos resultados do RNAseq em células
Uma das estratégias de validação dos resultados encontrados no experimento de RNAseq, foi super-expressar IFIT1-Flag em células e, então, identificar os RNAs ligados à proteína após IP. Células HEK293 foram transfectadas com plasmídeo vazio ou para expressão de IFIT1 ou para IFIT1-R38E. Após 36 horas as células foram lisadas, e o lisado utilizado em uma IP anti-Flag. Uma porção do lisado total, fração não ligada e ligada foram avaliadas por WB (Figura 25A).
Como observado nas canaletas contendo lisado total (LT, Figura 25A), a proteína mutante foi ligeiramente mais expressa que a selvagem nas células transfectadas. Proporcionalmente, se observa menos proteína na fração ligada (Lig) da IP da proteína selvagem em comparação com a mutante. Ao avaliar essas bandas (Lig) quanto a intensidade, observou-se uma expressão 1,14 vezes maior do mutante em relação à IFIT1 selvagem.
Após a IP, os RNAs associados às frações ligadas foram extraídos com TRIzol (Thermo) e a presença de alvos pré-selecionados no experimento de RNAseq foi analisada por RT-qPCR. A taxa de ligação foi expressa de acordo com o aumento/redução de ligação em relação a amostra do vetor vazio (que representa as interações inespecíficas e ao qual foi atribuído o valor de 1). Os valores para cada gene estão organizados na Figura 25B e foram normalizados de acordo com a intensidade das bandas da fração ligada na Figura 25A. Todos os alvos testados ligaram mais em IFIT1 selvagem do que em IFIT1- R38E (coluna Selvagem/R38E na Figura 25B). Dos genes enriquecidos no RNAseq, pelo menos cinco (CXCR4, CLU, PELI3, IKBKG e DAD1) apresentaram o mesmo fenótipo (pelo menos duas vezes mais ligação na proteína selvagem versus a mutante) no experimento de IP. Os controles negativos escolhidos (transcritos que não variaram na
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ligação a IFIT1 selvagem versus R38E no experimento de RNAseq – TOP1 e UQQC1) foram enriquecidos no experimento de IP.
Figura 25 - Ligação de mRNAs próprios a IFIT1 em células. Células HEK293 foram transfectadas com igual concentração de plasmídeos para expressão de IFIT1-Flag selvagem ou R38E, ou vetor vazio. Após 36 horas as células foram lisadas, e o lisado utilizado em uma IP anti-Flag. (A) Alíquotas do lisado total (LT) e das frações da IP (não ligada (NL) e ligada (Lig)) das três amostras foram avaliadas por WB (conforme descrito em Materiais e métodos, anticorpo primário de camundongo anti-Flag, seguido de anticorpo anti-camundongo conjugado HRP). (B) O restante das frações ligadas foi utilizada para RT-qPCR. Na tabela estão apresentados os valores da taxa de ligação de cada transcrito a IFIT1 (selvagem ou R38E), relativos à amostra calibradora: amostra IP vetor vazio (a qual foi atribuído valor de 1 pelo método de ΔΔCt). A diferença entre a ligação dos mRNAs a cada proteína pode ser observada na coluna mais à direta, pela razão da taxa de ligação a IFIT1 selvagem, dividida pela taxa de ligação à R38E. Os valores apresentados para cada gene foram normalizados de acordo com a intensidade das bandas da fração ligada na Figura 25A.