Células HEK293 foram transfectadas com cloreto de cálcio conforme descrito no item 4.10. Uma placa de 6 poços foi transfectada com o vetor vazio (vv, pCDNA3.1), uma com o vetor para expressão de IFIT1 selvagem e uma com o vetor para IFIT1-R38E. Após 36 horas de transfecção, as células foram soltas da placa por pipetagem, homogeneizadas no sobrenadante e coletadas (todos os 6 poços de uma mesma amostra)
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em um tudo de centrífuga de 15 mL. As células foram centrifugadas (420 x g, por 5 minutos a temperatura ambiente), e o sobrenadante descartado. As células foram homogeneizadas em 1 mL de salina, transferidas para um microtubo de 1,5 mL e centrifugadas (420 x g, por 5 minutos a 4º C). O sobrenadante foi descartado e as células lavadas novamente com 1 mL de salina, seguido de centrifugação e descarte do sobrenadante.
As células foram então homogeneizadas em 1 mL de tampão de lise gelado (50 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 % de Triton X-100, contendo 100U RNaseOUT/mL (Thermo) e inibidores de protease (Merck)), e incubadas a 4º C, sob rotação lenta, por uma hora. O lisado foi então centrifugado (12.000 x g, 4º C, por 10 minutos) e o sobrenadante coletado e mantido a 4º C até a imunoprecipitação. Alíquotas do lisado total (LT) foram coletadas para Western blot.
4.12.1 Imunoprecipitação
A imunoprecipitação (IP) de IFIT1-FLAG foi feita usando microesferas de agarose conjugadas a anticorpo anti-FLAG M2 (ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel, Sigma, A2220), seguindo as orientações do fabricante, com adaptações.
Resumidamente, 40 µL de microesferas (volume líquido) foram utilizados para cada reação de IP. As microesferas foram lavadas duas vezes com TBS (Tris HCl 50 mM e NaCl 150 mM, pH 7,4), uma vez com solução de glicina-HCl 0,1M (pH 3,5) para remoção de anticorpos não ligados, e novamente lavadas três vezes com TBS. Exatamente 1 mL de cada lisado (proveniente de uma placa de 6 poços de células transfectadas) foi adicionado às microesferas e estas permaneceram incubadas a 4º C, sob rotação lenta, durante 12 horas para ligação. Depois as microesferas foram sedimentadas por centrifugação e o sobrenadante recolhido. Uma alíquota de sobrenadante foi coletada para western blot (fração não ligada, “NL”). As microesferas, por sua vez, foram lavadas cinco vezes com 1 mL de TBS.
Após as lavagens, a eluição da proteína ligada às microesferas se deu pela adição de uma solução de eluição contendo 150 ng/µL de peptídeo 3X FLAG, em TBS. A solução de eluição permaneceu em contato com as microesferas durante 30 minutos, a 4º C e sob rotação lenta e constante. As microesferas foram então sedimentadas por centrifugação e o sobrenadante coletado. Parte do sobrenadante foi coletada para western blot (fração ligada, “Lig”), e o restante utilizado para extração de RNA e RT-qPCR.
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Para o western blot das frações provenientes da IP (Figura 25B e C), a concentração proteica não foi mensurada. Ao invés disso, foram aplicados no gel volumes iguais de cada fração, permitindo observar caso houvesse quantidades diferentes das proteínas (selvagem ou mutante) nas respectivas IPs. Foram utilizados 20 µL de lisado total (LT), 20 µL da fração não ligada (NL) e 10 µL da fração ligada (L) (os dois primeiros correspondendo a 2% do volume total/ IP, e o último a 10% respectivamente). Em geral, o protocolo utilizado foi aquele descrito no item 4.11. As bandas resultantes das frações ligadas de IFIT1 selvagem e IFIT1-R38E foram avaliadas quanto a intensidade com o programa ImageJ.
4.12.3 Extração do RNA
Alíquotas da fração ligada das IPs foram utilizadas para extração de RNA. Para servir como controle endógeno do processo de extração, foi adicionado 1 µL de norovírus murino (titulação 6,75 x 106 unidades formadoras de placa/mL) às amostras. A extração foi feita com TRIzol (Thermo) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras de RNA extraídas foram homogeneizadas em água e a quantidade e qualidade mensuradas no NanoDrop (Thermo Fischer). O RNA total obtido foi armazenado a -80 °C.
4.12.4 Síntese do DNA complementar (cDNA)
Para cada reação de transcrição reversa (RT) das frações ligadas, foram utilizados 11,5 µL de RNA, sem normalização pela concentração.
Às amostras de RNA foram adicionados 8,5 µL de uma solução de RT, contendo na sua concentração final: tampão M-MLV caseira 1X, 0,625 mM de dNTPs, 10 mM de DTT, 100 ng de iniciadores randômicos e 0,25 µL de enzima transcriptase reversa M- MLV purificada no laboratório. As amostras foram submetidas a um ciclo de incubação tempo/temperatura em termociclador, conforme segue: 25º C por 10 minutos, 37º C por duas horas e 87º C por cinco minutos. Ao final da RT, as amostras foram diluídas duas vezes, em água livre de nucleases, e mantidas a -20 °C.
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Todas as reações foram preparadas em placas do tipo MicroAmp® Optical 96- Well Reaction Plate (Applied Biosystems). Cada reação de PCR foi preparada com 2 µL de cDNA diluído (conforme item 4.12.4) 0,1 µM de cada iniciador (concentração final, ou 0,25 µM para os iniciadores de norovírus), 5 µL de 2x GoTaq® qPCR Master Mix (Promega) e água livre de nucleases para completar 10 µL. Os iniciadores utilizados podem ser observados na tabela a seguir.
Tabela 6 - Iniciadores utilizados na qPCR
Gene Par de iniciadores
hCXCR4 5´ CTCCTCTTTGTCATCACGCTTCC 3´ 5´ GGATGAGGACACTGCTGTAGAG 3´ hDAD1 5´ CAGTTCGGTTACTGTCTCCTCG 3´ 5´ GGAGATGCCTTGGAAATCCGCT 3´ hZNF584 5´ TGTGACTCCAGTCAGCAGAGCA 3´ 5´ TGAGTGTCCTGGTGCTGGATGA 3´ hCLU 5´ ACGAAGAGCGCAAGACACTG 3´ 5´ ATGGTCTCATTGCACACTCCT 3´ hLARP6 5´ TGAAAACCTGGAGAAGGACGCC 3´ 5´ ATGTGCTGTGGTTCTCCAGTCC 3´ hIKBKG (NEMO) 5´ GCACCTGCCTTCAGAACAGG 3´
5´ ATCTGGTTGCTCTGCCGG 3´ hFRS3 5´ CTATGGCTACGACTCCAACCTC 3´ 5´ GCACTGCATCAGATCCTGAAGG 3´ hPELI3 5´ CATCTATGCCGCTGGCTTCGAT 3´ 5´ GTGCATCACCAGGACTCCATTG 3´ hTOP1 5´ GAACAAGCAGCCCGAGGATGAT 3´ 5´ TGCTGTAGCGTGATGGAGGCAT 3´ hUQCC1 5´ CCGAGCATGTGGTGGATCAGAA 3´ 5´ ACCTTCTCCTCAACAGGCTGTG 3´ Norovírus murino 5´ CAC GCC ACC GAT CTG TTC TG 3´
5´ GCG CTG CGC CAT CAC TC 3´
A PCR foi realizada no StepOnePlus PCR system (Applied Biosystems), de acordo com as condições de amplificação descritas na Tabela 7, seguida da curva de dissociação dos iniciadores. Os dados de threshold, baseline e Ct, foram obtidos e analisados inicialmente através do programa StepOne Software v2.3.
51 Tabela 7 - Condições de amplificação da qPCR (StepOnePlus)
A amplificação do gene do norovírus murinho foi utilizada como controle interno da eficiência de extração e RT-qPCR. A análise da expressão relativa dos genes foi feita pelo método do ΔΔCt, sendo os resultados apresentados de acordo com a expressão relativa do norovírus (gene de referência) na amostra transfectada com o vetor vazio (amostra calibradora), ao qual foi atribuído o valor de 1. Os resultados da fração ligada (taxa de ligação) foram normalizados de acordo com a quantidade de proteína (intensidade da banda) no lisado total das respectivas amostras.