Composição fenólica

4.3.1. Obtenção dos extratos

Os extratos das amostras foram obtidos em triplicata por dois métodos de extração, com solvente único (hidroetanólica 90%) e sequencial.

4.3.1.1. Extração única

A extração única foi realizada de acordo com o proposto por Côrrea (2010), com modificações. As amostras frescas (0,5 g) foram agitadas em shaker New Brunswick Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) a 180 rpm por 30 minutos em ambiente escuro e gelado com 3 mL de solvente etanol a 90% (10:90, v.v-1, água destilada:etanol) depois centrifugadas em centrífuga Hettich Zentrifugen (modelo Rotanta 460R, Germany) por 15 minutos a 4750 rpm e 4ºC. O resíduo foi re-extraído nas mesmas condições, totalizando 60 minutos de extração. Os sobrenadantes resultantes foram combinados e o volume ajustado para 10 mL. Os extratos (EE – extrato em solvente hidroetanólica) acondicionados em

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frasco âmbar foram armazenados a 4ºC por aproximadamente um mês até às análises subsequentes.

4.3.1.2. Extração sequencial

A extração sequencial foi realizada de acordo com a sugerida por Sun et al. (2002) e Dewanto, Wu, Liu (2002), com modificações, permitindo a obtenção de três frações. Os compostos solúveis fenólicos livres (fração 1/ECFL) foram extraídos utilizando 50 g de peso fresco das amostras homogeneizados com 100 mL de solução hidroacetônica 80% (v/v) em liquidificador industrial Skymsen (modelo LI-1,5-N, Brasil) durante 5 minutos e mais 3 minutos em ultra-turrax Poly Tron (modelo PT – MR 2100, Switzerland), sendo posteriormente centrifugadas a 5°C por 15 minutos a uma velocidade de 5000 rpm. Os sobrenadantes, compostos por agliconas livres e conjugados solúveis (formas glicosiladas), foram evaporados em rotaevaporador Büchi (modelo R-210) acoplado em Chiller Büchi (modelo F108) 45°C até evaporação de cerca de 90% do sobrenadante e ressuspendidos em água deionizada para um volume final de 50 mL. Nos resíduos obtidos da centrifugação das amostras foram adicionados 20 mL de solução NaOH 2 N e homogeneizados em shaker à temperatura ambiente durante 1 hora (200 rpm) para hidrólise das ligações dos compostos conjugados. Os meios foram acidificados com HCl concentrado até pH 2 e lavados com 25 mL de hexano para remoção da gordura, centrifugados e os sobrenadantes recolhidos para as análises (fração 2/ECFSH). Os resíduos, obtidos na segunda centrifugação, foram lavados seis vezes com acetato de etila, centrifugado, evaporado a 45°C até evaporação completa do solvente e ressuspendidos em água deionizada para um volume final de 10 mL (fração 3/ECFC – extratos fitoquímicos conjugados). Os extratos foram armazenados em freezer por aproximadamente um mês até à suas utilizações para as análises.

4.3.2. Determinação de fenólicos totais

A concentração dos compostos fenólicos totais foi determinada em Fluorímetro NOVOstar (modelo S/N 700-0120, Switzerland) a 760 nm, utilizando reagente Folin- Ciocalteau, segundo a metodologia descrita por Roesler et al. (2007), com modificações. O método colorimétrico Folin-Ciocalteau envolve a redução do reagente pelos compostos

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fenólicos das amostras com concomitante formação de um complexo azul cuja intensidade aumenta linearmente.

Uma curva de referência nas concentrações de 10 a 70 µg.mL-1 em metanol 50% foi construída utilizando-se como padrão o ácido gálico (Sigma Aldrich, USA) 100 µg.mL-1. Para a determinação de compostos fenólicos, os extratos com concentrações conhecidas (mg.mL-1) em metanol 50%, foram homogeneizados em banho ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) por 30 minutos e a partir deles, diluições seriadas em solução de metanol 50% foram realizadas e, assim, determinada a melhor concentração para se obter o teor de compostos fenólicos nos extratos (localizada na faixa mediana ao centro da curva analítica).

Para a reação colorimétrica, uma alíquota 30 µL da solução metanólica de extrato foi homogeneizada em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) por 2 minutos com 120 µL de solução Folin Ciocalteau, posteriormente homogeneizada com 130 µL de solução de carbonato de sódio 5% e mantida em incubação a 50ºC por 5 minutos em banho- maria New Brunswick Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) para desenvolvimento de cor. O sistema foi resfriado rapidamente em banho de gelo e realizado a leitura em Fluorímetro a 760 nm a temperatura ambiente (25ºC±2). Um branco foi realizado substituindo a solução metanólica de extrato por 30 µL de hidrometanólica 50% (v/v). A quantificação de compostos fenólicos nos extratos foi determinada por meio da curva analítica e os resultados foram expressos em equivalente de ácido gálico (EAG) - mg de ácido gálico por g de fruta fresca.

4.3.3. Quantificação de flavonoides

A quantificação dos flavonoides foi realizada pelo método colorimétrico descrito por Zhishen, Mengcheng e Jianming (1999), com modificações em Fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120, Switzerland) a 510 nm. A curva de referência foi construída utilizando-se o padrão catequina (Sigma Aldrich, USA) 500 µM nas concentrações de 10 a 200 μmol.

Para a determinação dos flavonoides, extratos com concentrações conhecidas (mg.mL-1) em água destilada foram homogeneizados por 30 minutos em banho ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) e a partir deles, diluições seriadas em

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água deionizada (Milipori Bedford, modelo CT Q3UV, USA) foram realizadas e, assim determinada a melhor concentração para se obter o teor de flavonoides nos extratos.

A reação colorimétrica ocorreu com a homogeneização de 28 µL do extrato com 110 µL de água destilada em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) por 30 segundos a 500 rpm, posteriormente outras séries de homogeneização com soluções foram realizadas – 8 µL de NaNO2 por 2 minutos, 8 µL de AlCl3 por 3 minutos e 56 µL de NaOH mais 67 µL de água destilada por 30 segundos. Para o branco o extrato foi substituído por 28 µL de água destilada. As leituras das absorbâncias foram realizadas em fluorímetro a 510 nm a temperatura ambiente (25ºC±2) e os resultados expressos em equivalente de catequina - mg de catequina por g de fruta fresca.

4.3.4. Determinação de taninos condensados

A quantificação dos taninos condensados foi realizada pelo método colorimétrico vanilina descrito por Price, Van Scoyoc e Butler (1978), com modificações em fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120, Switzerland) a 510 nm. A curva de referência foi construída utilizando-se o padrão catequina (Sigma Aldrich, USA) nas concentrações de 0,02 a 1,2 mg.mL-1.

Para a determinação dos taninos condensados, os extratos com concentrações conhecidas (mg.mL-1) em metanol foram homogeneizados por 30 minutos em banho ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) e a partir deles, diluições seriadas em metanol foram realizadas e, assim determinada a melhor concentração para se obter o teor de taninos condensados nos extratos.

A reação colorimétrica ocorreu com a homogeneização de 50 µL do extrato com 250 µL de reagente vanilina (1% de vanilina + HCl 4% em metanol, 1:1 v/v) em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) por 30 segundos a 500 rpm. Para o branco o extrato foi substituído por 50 µL de metanol em 250 µL de HCl 4%. A microplaca foi mantida em incubação a 30ºC por 20 minutos em banho-maria New Brunswick Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) para desenvolvimento de cor. As leituras das absorbâncias foram realizadas em fluorímetro a 510 nm a temperatura ambiente (25ºC±2) e os resultados expressos em equivalente de catequina - mg de catequina por g de fruta fresca.

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