Complexos de paládio obtidos a partir da reação do dmpa (N,N-dimethyl- 1-phenethylamine) com derivados de diphenylphoshine (dppe) e dppf mostraram-se potenciais agentes antitumorais em ensaios pré-clínicos. Um dos complexos sintetizados com os derivados dppe [1,2- ethanebis(diphenylphosphine)] mostrou atividade antitumoral in vitro e in vivo contra o modelo singeneico e de baixa imunogenicidade do melanoma murino B16F10-Nex2, parecendo exercer seu efeito citotóxico sobre mitocôndrias, embora o mecanismo de ação não tenha sido completamente elucidado (Rodrigues et al, 2003). Um outro complexo ciclopaladado, sintetizado com o derivado dppf [1,1’-bis(diphenylphosphine)ferrocene] induziu a permeabilização de lisossomas em células leucêmicas humanas K562, o que levou as células à apoptose por via lisossomal (Barbosa et al, 2006). Esses resultados demonstram que a ação antitumoral dos complexos ciclopaladados é o resultado de uma atividade organela-específica, e que esses compostos não compartilham um único mecanismo de ação.
Neste trabalho nós elucidamos o mecanismo de ação do enantiômero S(-) do dppe-Ciclopaladado, denominado de Complexo Ciclopladado 7A, ou C7A.
Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram a eficácia antineoplásica in vitro e in vivo do Ciclopaladado 7A em células de melanoma murino B16F10-Nex2 (Rodrigues et al, 2003). Esse composto foi selecionado
pelo seu marcante efeito in vivo, dentre vários compostos ciclopaladados testados no modelo. Animais tratados com o C7A apresentaram um retardo no desenvolvimento tumoral e um aumento significativo na sobrevida. In vitro, o ciclopaladado 7A reduziu muito rapidamente a acidificação extracelular, que atingiu valores 80% menores após 40 minutos de incubação, e reduziu a acidificação extracelular em 100% após 110 minutos de incubação, o que mostra a inibição do metabolismo e também da geração de prótons na cadeia respiratória pelo composto. Foi também demonstrada degradação do DNA, e não foi observada ativação de caspases efetoras 1 e 3, o que sugeriu que o quimioterápico levasse as células à morte por indução de um processo apoptótico independente de caspases. Foi também demonstrada uma interação do C7A com um plasmídeo por dicroismo circular, sugerindo que o efeito do quimioterápico poderia ser semelhante ao efeito da Cisplatina, que interage com o DNA celular ativando a via apoptótica por ativação de p53 (Sedletska et
al, 2005)
Neste trabalho demonstramos que o ciclopaladado 7A também é ativo in
vitro contra diversas linhagens de células tumorais humanas. Quase todas as
células tumorais humanas testadas respondem muito bem ao tratamento com o C7A, com doses de IC50 relativamente baixa, abaixo de 500 nanomolar. A eficácia do quimioterápico em doses baixas é muito importante, pois isso pode indicar uma atenuação de possíveis efeitos colaterais, tão comuns em quimioterápicos antitumorais já utilizados. As doses efetivas de Cisplatina sobre essas mesmas células foram cerca de 200 a 1.300 vezes maiores.
Este efeito citotóxico acentuado in vitro não foi observado em linhagens tumorais de leucemia (HL60) e glioblastoma (U87) humanas, que mostraram
um IC50 para o quimioterápico de 1 e 3.5µM, respectivamente, sugerindo que alguns tipos tumorais podem ser mais resistentes ao C7A. Mesmo assim, as doses efetivas foram muito abaixo das doses efetivas de Cisplatina, que foram 70 e 43 vezes maiores para a linhagem HL-60 e U87, respectivamente.
Foi demonstrado anteriormente que o ciclopaladado 7A apresenta baixa toxicidade in vivo. Concentrações crescentes do complexo foram inoculadas em camundongos C57Bl/6, de 10 a 60µM, 3 doses em dias alternados para cada concentração, e ao final do experimento vários órgãos foram analisados histologicamente, não se observando alterações significativas (Rodrigues et al, 2003).
Complementando esse resultado, a incubação de macrófagos murinos e eritrócitos humanos na presença de várias concentrações relativamente elevadas do composto C7A, não levou essas células à morte. O fato do C7A não causar a lise dos eritrócitos humanos sugere que este composto não age diretamente sobre a membrana celular, mas em organelas essenciais para a manutenção da homeostase da célula.
A rápida redução na atividade respiratória observada após o tratamento das células tumorais humanas com o C7A sugere que o mecanismo de ação do quimioterápico seja o mesmo tanto em células tumorais murinas como humanas, envolvendo a participação da mitocôndria no processo de morte causado pelo composto.
Nossos resultados demonstraram que o C7A interage diretamente com proteínas contendo grupos tiol na membrana mitocondrial. A inibição, com o agente redutor DTT, do colapso no potencial de membrana mitocondrial e no
efeito citotóxico in vitro sobre as células tumorais causados pelo C7A comprovou a participação de proteínas contendo grupos tiol na permeabilização da membrana mitocondrial.
Esse mesmo efeito foi observado por Santana et al (2009) quando estudaram o efeito do C7A e do enantiômero R(+) do C7A, o complexo [Pd(C2,N-(R(+)dmpa)(dppe)].Cl, sobre mitocôndrias isoladas de hepatócitos de rato. Nesse estudo foi demonstrado que os paladociclos induziram inchaço da mitocôndria independente de cálcio, permeabilização mitocondrial, desligamento da fosforilação oxidativa e liberação de cálcio mitocondrial, efeitos totalmente prevenidos pelo tratamento com DTT. Foi observado um decréscimo na quantidade de grupos tiol reduzidos nas proteínas da membrana mitocondrial, e também presença de agregados proteicos na membrana da mitocôndria, possivelmente formados pela indução de pontes dissulfeto entre grupos tiol de proteínas de membrana vicinais, catalizadas pelo ciclopaladado. Esses efeitos levaram à liberação de citocromo C, demonstrando uma alta e específica reatividade do ciclopaladado com grupos tiol de proteínas da membrana mitocondrial, catalisando a formação de pontes dissulfeto que levam à permeabilização da mitocôndria, e a um efeito pró-apoptótico dos dppe- ciclopaladados. A reatividade dos ciclopaladados com grupos tiol presentes em proteínas foi também demonstrado para os complexos dppf-ciclopaladados, que mostram uma atividade inibitória sobre a Catepsina B, uma cisteíno- protease que contém um grupo tiol no seu sítio catalítico (Barbosa et al, 2006).
Nosso trabalho, realizado com células íntegras e viáveis, utilizando métodos microscópicos que mantém a viabilidade celular, portanto, em um
sistema extremamente complexo, corroboram esses resultados obtidos com a mitocôndria isolada.
Tanto C7A como seu enantiômero R(+) apresentaram efeitos semelhantes sobre mitocôndrias isoladas de hepatócitos de rato, mas o enantiômero R(+) foi o mais potente nas condições in vitro do estudo (Santana
et al, 2009). Interessante observar que o enantiômero R(+) não apresentou
efeito in vivo contra o melanoma murino B16F10-Nex2, embora tenha apresentado efeito citotóxico in vitro com IC50 semelhante ao C7A, abaixo de 1.25µM (Rodrigues et al, 2003), sugerindo que os enantiômeros possam ser absorvidos e apresentem biodisponibilidades diferentes in vivo.
Já foi demonstrado que a depleção de ATP causa uma rápida desfosforilação de proteínas próapoptóticas da família Bcl-2, translocação de Bax para a mitocôndria, permeabilização da membrana externa mitocondrial e subseqüente morte celular (Xu et al, 2005).
Não há dúvida de que as mitocôndrias desempenham um papel central na morte celular programada. Alguns parâmetros de desregulação mitocondrial têm sido descritos como características próprias de um processo apoptótico: perda do potencial de membrana mitocondrial, a interrupção do transporte de elétrons e fosforilação oxidativa, a geração de espécies reativas de oxigênio e liberação de fatores próapoptóticos, que desencadeiam a ativação de caspases. Já que tal organela desempenha um papel fundamental no desencadeamento de apoptose, há um grande interesse em explorar as suas funções próapoptóticas para interferir no crescimento de células tumorais. (Dias & Bailly, 2005).
Nossos resultados demonstram que o ciclopaladado 7A causou uma rápida queda no potencial de membrana mitocondrial, alterando assim a permeabilidade da membrana desta organela, comprovada pela imagem da microscopia eletrônica, que mostra um claro inchaço das estruturas mitocondriais nas células tumorais de melanoma murino B16F10-Nex2 tratadas com o C7A. Existe uma série de compostos antitumorais que agem dessa mesma maneira são descritos na literatura. A Lonidamina é um agente antitumoral derivado do ácido indazol-3 carboxílico, que atua na mitocôndria, inibindo o consumo de oxigênio e bloqueando o metabolismo energético. A Lonidamina causa perda do potencial de membrana mitocondrial e liberação de citocromo C em mitocôndrias isoladas (Stryker & Gerweck, 1988)
A superexpressão de proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2 em diversas linhagens tumorais pode inibir a permeabilização da membrana mitocondrial externa e formação de póros mediada pelas proteínas Bax/Bak. O efeito antitumoral próapoptótico de alguns tratamentos convencionais (p.ex., radiação ionizante) é baseado na habilidade de estimular a produção de espécies reativas de oxigênio (Gogvadze et al, 2009). Drogas antitumorais que induzem a formação de um póro de transição de permeabilidade na membrana mitocondrial podem induzir modificações nesta organela mediada pelo acúmulo de reativos de oxigênio. Por exemplo, com altas doses do agente quimioterápico trióxido de arsênico, observou-se uma modificação oxidativa em grupos tiol e conseqüente liberação de citocromo C através da indução do poro de transição de permeabilidade. Entretanto, em concentrações aceitáceis para o uso clínico, esta droga estimula liberação de citocromo C e apoptose através de mecanismos dependentes das proteínas Bax/Bak (Larochette et al, 1999).
Bax é um membro pró-apoptótico da família Bcl-2 localizado predominantemente no compartimento citosólico, na forma monomérica, em células viáveis. Após um estímulo apoptótico, uma fração significativa desta proteína formam dímeros e se transloca para a membrana externa mitocondrial formando poros (Wolker et al, 1997).
A translocação da proteína Bax para as mitocôndrias foi observada em células de melanoma murino B16F10-Nex2 transfectadas com uma proteína quimérica Bax-GFP e tratadas com o C7A. Além das alterações mitocondriais já descritas anteriormente, a translocação de Bax forma póros que liberam o citocromo C, que por sua vez ativa caspases. A ativação de caspases foi observada nas células de melanoma murino tratadas com o C7A. Verificou-se um expressivo aumento na atividade das caspases efetoras 3 e 6.
Estudos têm demonstrado que Bax e outras proteínas pró-apoptóticas podem modular estoques de cálcio no retículo endoplasmático e nas mitocôndrias (Nutt et al, 2001). Foi também demonstrado que a integridade da membrana mitocondrial pode ser alterada pela captação excessiva de cálcio (Andreyev et al, 1998). Em condições fisiológicas, o aumento do cálcio citosólico estimula a captação deste íon pela mitocôndria, provocando assim um aumento de cálcio mitocondrial (Robb-Gaspers et al, 1998). Alterações no cálcio citosólico podem ativar a via de apoptose. Algumas destas alterações incluem mudanças na captação do cálcio mitocondrial, o que aumenta a probabilidade de ativação do póro de transição de permeabilidade (Pacher et
al, 2002). A depleção dos estoques de cálcio intracelular também está
Nossos resultados demonstram que o C7A provoca o acúmulo de grande quantidade de cálcio intracelular, liberado do interior das organelas. Ensaios preliminares demonstraram que o C7A provoca liberação de cálcio tanto do retículo endoplasmático como das mitocôndrias (dados não mostrados). Além do C7A causar uma importante liberação do cálcio intracelular, também observou-se uma entrada de cálcio proveniente do meio extracelular. Este cálcio em excesso não consegue ser captado totalmente pelas organelas responsáveis pelo estoque deste íon, colaborando assim com mais um estímulo apoptótico.
A condensação nuclear e a degradação de DNA observadas em células de melanoma murino tratadas com o ciclopaladado 7A é mais uma forte indicação de que as células tumorais estão morrendo por um processo apoptótico. Diversos compostos metálicos, como por exemplo, drogas derivadas de platina, em geral tem como alvo predominante o DNA (Brabec & Kasparkova, 2005), embora estudos recentes sugiram que existam também outros alvos (Gourdier et al, 2004; Cullen et al, 2007).
Um complexo dppf-ciclopaladado, denominado BCP (Biphosphinic Palladacycle Complex), foi testado in vitro contra as linhagens celulares de leucemia humana K562, HL-60 e Jurkat, e para todas elas o IC50 foi menor do que 8µM. O ciclopaladado acumulou-se nos lisossomas celulares, levando à permeabilização dessa organela com a liberação de catepsina B, que foi responsável pela ativação das caspases 3 e 6, como demonstrado pela inibição da ativação dessas enzimas efetoras da apoptose por um inibidor seletivo de catepsina B (CA074) (Bincoletto et al, 2005; Barbosa et al, 2006; Oliveira et al, 2009). Nesse modelo, os autores levantam a hipótese de que a catepsina
liberada pelos lisossomas pode agir sobre outras organelas, principalmente mitocôndrias e núcleo, o que levaria as células a um processo de morte por apoptose (Oliveira et al, 2009).
Com o objetivo de verificarmos a possível participação de catepsinas no efeito citotóxico causado pelo C7A em células de melanoma murino, células B16F10-Nex2 foram tratadas com o ciclopaladado 7A, na presença de CA074- Me, inibidor seletivo de catepsina B metilado, o que permite sua entrada na célula. O mesmo procedimento foi realizado com o inibidor seletivo de cisteíno- proteases E-64. Os resultados mostraram que a inibição da catepsina B e de cisteíno-proteases em geral não foi capaz de impedir a morte celular causada pelo C7A, sugerindo que não há participação dessas enzimas no processo de morte celular causado pelo composto.
No início do desenvolvimento deste projeto, tínhamos como hipótese de mecanismo de ação do C7A a indução de morte celular por necrose, uma vez que observamos uma queda abrupta no pH extracelular, sugerindo a parada na respiração celular e queda na produção de ATP, degradação nuclear e ausência de ativação das caspases efetoras 1 e 3 (Rodrigues et al, 2003). Concentrações muito baixas de ATP estão relacionadas à indução de processo necrótico (Smaili et al, 2009). Além disso, o resultado da microscopia eletrônica de transmissão com células de melanoma murino mostrou um inchaço das mitocôndrias após tratamento com o C7A, e alterações mitocondriais são encontradas tanto no processo apoptótico como no necrótico (Kroemer et al, 2009).
Golstein & Kroemer (2007) analisando seis diferentes sistemas experimentais observaram que a necrose celular se caracteriza por uma sequência de eventos bioquímicos intracelulares, que incluem alterações mitocondriais como inchaço, depleção de ATP, falha na manutenção da homeostase de cálcio, ativação de algumas proteases, como calpaínas e catepsinas, entre outros eventos, que acumulados de uma forma programada e organizada podem definir a necrose. Várias características observadas após o tratamento com o ciclopaladado 7A eram similares às descritas como indicativas de necrose, e testamos então, se essa via poderia estar implicada na morte celular causada pelo C7A.
Ensaios pré-clínicos indicam que a inibição de várias moléculas implicadas no processo de necrose apresenta efeitos benéficos, como por exemplo, a inibição de PARP, RIP1,CypD, calpaínas e catepsinas que inibiu a morte celular por necrose in vivo em modelos de perda aguda de células (Kroemer & Martin, 2005). Em um ensaio para screening de novas drogas foram identificadas as Necrostatinas, que inibiram in vitro a morte celular em células Jurkat deficientes em FADD, e apresentaram efeitos benéficos em modelo experimental de isquemia (Degterev et al, 2005). Necrostatina-1 inibe quimicamente a quinase RIP1, envolvida na necrose mediada pelos receptores TNFR1, Fas/CD95, TRAILR e TLR3 (Degterev et al, 2005; Degterev et al, 2008). Embora não haja um consenso, alguns grupos propuseram a utilização do termo “necroptosis” para indicar um processo necrótico regulado, ao contrário de um processo acidental. Em nível bioquímico, a necroptosis pode ser definida como um processo que pode ser evitado pela inibição da quinase RIP1 (Kroemer et al, 2009)
Necrostatina-1 (Sigma Aldrich) foi utilizada como inibidor da atividade do C7A sobre células tumorais, sendo incubada em várias concentrações com as células previamente ao tratamento com o quimioterápico, ou alternativamente em associação com o C7A. Não foi observado efeito da necrostatina-1 nessas condições (dados não apresentados).
Uma característica marcante das células tumorais é a produção de ATP predominantemente através da via glicolítica, mesmo em condições aeróbias, conhecido como "efeito Warburg". Devido a esta peculiaridade, mitocôndrias das células tumorais desempenham papel fundamental na sobrevivência e morte celular, o que torna essa organela um alvo importante para quimioterápicos antitumorais. A exploração do efeito Warburg pode representar uma nova e promissora abordagem para complementar os tratamentos convencionais, que tem outros alvos na célula tumoral (Gogvadze et al, 2009), e evidências sugerem que terapias antitumorais que tem a mitocôndria como alvo podem tornar as células tumorais mais sensíveis a outros quimioterápicos (Gogvadze et al, 2008).
A terapia sistêmica do melanoma metastático tem apresentado efeitos muito aquém do esperado. Os quimioterápicos disponíveis poderiam, em teoria, agir também sobre sítios metastáticos, mas com frequência metástases não são responsivas aos tratamentos (Lowe e Soengas, 2003).
A atividade do C7A contra metástases pulmonares do melanoma murino também foi avaliada. Observou-se uma redução significativa no número de nódulos pulmonares dos animais tratados. Este é um achado importante pois além do ciclopaladado mostrar eficácia no tratamento de tumores primários,
como observado por Rodrigues et al (2003), também poderia ser utilizado no tratamento de tumores em estadios metastáticos mais avançados.
Como as terapias convencionais frequentemente apresentam baixa eficácia no tratamento do melanoma, diferentes abordagens terapêuticas têm sido avaliadas para o tratamento desse tumor, principalmente a associação da quimioterapia com agentes imunoterápicos, denominada de bioquimioterapia (Sun & Schuchter, 2001).
Recentemente foi demonstrado. pelo nosso grupo, que a neutralização da interleucina 13, uma interleucina imunosupressora, com um receptor decoy,
in vivo, aumentou significativamente a sobrevida dos animais tratados. Mais
importante, a associação da neutralização da IL-13 com o ciclopaladado 7A levou a um significativo retardo no desenvolvimento do melanoma murino subcutâneo, com impressionantes 30% de animais tratados livres de tumor por um tempo prolongado (Hebeler-Barbosa et al, 2008). Esses resultados mostram que o C7A também pode ser usado com sucesso em associação a outros tipos de terapias antineoplásicas.
Além da atividade direta antitumoral observada com o C7A, é possível que o composto interfira também em outros processos importantes para o desenvolvimento tumoral in vivo. Um dos eventos essenciais para o crescimento do tumor é a formação de novos vasos sanguíneos, que tem como função principal nutrir a população de células tumorais em crescente proliferação (Bonavida et al, 2006)).
Nossos resultados demonstram que o ciclopaladado 7A apresenta uma atividade citotóxica direta sobre uma linhagem de células endoteliais humanas,
e também foi capaz de inibir a formação de estruturas pré-angiogênicas em ensaio in vitro, estruturas estas que se relacionam à capacidade de formação de neovasos in vivo.
6.2 Compostos de Rutênio
Neste trabalho, além da determinação do mecanismo de ação de um composto ciclopaladado com atividade antitumoral, avaliamos também o efeito antitumoral de compostos tetraamina rutênio, doadores de óxido nítrico. Estes compostos foram previamente testados in vitro e in vivo em diferentes modelos experimentais, como na vasodilatação e no tratamento de parasitoses (Leishmaniose e Doença de Chagas), e a atividade demonstrada foi dependente do óxido nítrico liberado pelo composto (Zanichelli et al, 2007; Silva et al, 2009)
Os complexos nitrosil-tetraamina-rutênio foram avaliados no relaxamento de anéis aórticos desprovidos de endotélio e pré-contraídos com noradrenalina. Observou-se que o NO liberado dos complexos reduzidos foi o responsável pelo relaxamento, e que esse efeito pode ser modulado pela adição de diferentes ligantes estabilizadores, que determinam a velocidade de liberação do íon (Zanichelli et al, 2007).
A avaliação destes compostos no tratamento da doença de Chagas experimental mostrou uma elevada atividade antiproliferativa e tripanocida in
vitro, mais efetiva do que Violeta Genciana, usada atualmente na profilaxia da
transmissão de Doença de Chagas em bancos de sangue. Em testes in vivo, dois compostos, trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3 e trans-
Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, eliminaram as formas extracelular e intracelular do Trypanosoma cruzi no sangue e miocárdio, e aumentaram a sobrevida de até
80% dos camundongos infectados por um período superior a cinqüenta dias (Silva et al, 2009).
O desenvolvimento de resistência das células tumorais a vários agentes citotóxicos continua a ser um grande desafio na área da oncologia e novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessárias (Huerta et al, 2009). Entre os novos agentes que surgiram recentemente, estão os que induzem produção endógena de óxido nítrico ou agem como doadores desta molécula. O óxido nítrico é um mensageiro intracelular produzido pelo organismo de forma endógena a partir de reações catalisadas por uma família de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), que convertem o aminoácido L- arginina em NO e L-citrulina. Há pelo menos quatro diferentes isoformas conhecidas dessa enzima, duas delas são constitutivas, eNOS e cNOS (com níveis de NO produzido comumente ao redor de µmol.l-1), e uma induzível, iNOS, que é ativada após estímulo, que pode ser, por exemplo, durante uma resposta inflamatória, quando NO é secretado em concentrações de mmol.L-1 por macrófagos ativados, e que pode ter uma função protetora. Uma quarta enzima foi recentemente descoberta, mtNOS ou NOS mitocondrial, identificada como uma isoforma da nNOS, e está envolvida na inibição da respiração mitocondrial (Elfering et al, 2002).
Nos últimos anos, o papel do óxido nítrico no desenvolvimento tumoral tem sido foco de numerosos estudos. A transfecção do gene que codifica iNOS em células de melanoma murino induz apoptose, suprime a tumorigênese e elimina a formação de metástases (Xie et al, 1995.; Xie et al, 1997). Altos
níveis de iNOS tem sido encontrados em metástases de melanoma não- progressivo comparativamente à melanomas progressivos (Tschugguel et al,