Compostos bioativos derivados de metabólitos secundários de espécies vegetais

Os metabólitos secundários ou compostos secundários de vegetais são uma variedade de compostos orgânicos que não possuem uma distribuição universal no reino vegetal, ou seja, são restritos a uma espécie vegetal ou a um grupo de espécies relacionadas; ao contrário dos metabólitos primários, que se encontram distribuídos em todo o reino vegetal, desempenhando funções vitais, como a fotossíntese, respiração e transporte de solutos. São exemplos de metabólitos primários: carboidratos, lipídeos, aminoácidos, nucleotídeos e clorofila (BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006).

Os metabólitos secundários são derivados das vias metabólicas do ácido chiquímico, a principal, e mevalônico, de pouca importância para o metabolismo de vegetais (FIGURA 10).

FIGURA 10: Principais vias do metabolismo secundário de espécies vegetais.

Atuam na defesa do vegetal contra ataque de patógenos, mas durante muito tempo essa função era desconhecida; eles eram considerados apenas produtos finais do metabolismo ou resíduos sem qualquer função importante. São classificados em: terpenos, compostos nitrogenados e compostos fenólicos (ANJO, 2004; BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006; BERGAMASCHI, 2010; NATIVIDADE, 2010).

Os principais fatores que podem coordenar ou alterar a taxa de produção de metabólitos secundários são expostos a seguir e representados na Figura 11.

FIGURA 11: Principais fatores que podem influenciar o conteúdo de metabólitos secundários em espécies vegetais.

FONTE: Adaptado de Gobbo-Neto e Lopes (2007).

o _{Sazonalidade: A época em que uma planta é coletada é um fator de grande importância,} visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano todo. Segundo Gobbo-Neto e Lopes (2007), são relatados variações sazonais no conteúdo de praticamente todos os metabólitos secundários.

o _{Ritmo circadiano: A composição de metabólitos secundários de uma planta pode variar} apreciavelmente durante o ciclo dia/noite. Silva et al. (1999) relataram uma variação de mais de 80% na concentração de eugenol no óleo essencial da alfavaca (Ocimum gratissimum), o qual atingiu um máximo em torno do meio-dia, horário em que foi responsável por 98% do óleo essencial, em contraste com uma concentração de 11% em torno de 17h.

o _{Idade: Tecidos mais novos geralmente possuem maiores taxa biossintética de metabólitos} secundários, tais como óleos essenciais, ácidos fenólicos, alcalóides, flavonóides e estilbenos. Há uma correlação inversa entre alta atividade metabólica e produção de aleloquímicos, isto é, um decréscimo na produção de metabólitos secundários

(notadamente derivados fenólicos) em períodos de crescimento tecidual rápido (GOBBO- NETO e LOPES, 2007).

o _{Temperatura: A faixa em que ocorrem as variações anuais, mensais e diárias na} temperatura é um dos fatores que exerce maior influência em seu desenvolvimento, afetando, portanto, a produção de metabólitos secundários. No entanto, o fato da temperatura ser, de modo geral, uma consequência de outros fatores, como altitude e sazonalidade, a temperatura não deve ser considerada um fator isolado na produção de metabólitos secundários (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

o _{Disponibilidade Hídrica: Fatores fisiológicos críticos, tais como fotossíntese, mobilização} de reservas, expansão foliar e crescimento, podem ser alterados por estresse hídrico e, consequentemente, levar a alterações no metabolismo secundário. Em geral, o estresse hídrico, leva a um aumento na produção de vários tipos de metabólitos secundários, como glicosídeos cianogênicos, glucosinolatos, alguns terpenóides, antocianinas e alcalóides. O efeito da seca na concentração de metabólitos é, às vezes, dependente do grau de estresse e do período em que ocorre, sendo que efeitos a curto prazo parecem levar a uma produção aumentada, enquanto a longo prazo é observado um efeito oposto. Outro fator importante é que a chuva contínua pode resultar na perda de substâncias hidrossolúveis das folhas e raízes por lixiviação (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

o Radiação Ultravioleta: Existe uma correlação positiva bem estabelecida entre intensidade de radiação solar e produção de compostos fenólicos, tais como flavonóides, taninos e antocianinas. Isso pode ser explicado, principalmente no caso de flavonóides, pela proteção contra a foto-destruição proporcionada por estes metabólitos ao absorver e/ou dissipar a energia solar, dificultando assim a danificação dos tecidos mais internos pela radiação UV-B. No caso específico dos flavonóides, estes são acumulados principalmente em tecidos superficiais (tais como epiderme, subepiderme, pêlos, cutícula e material epicuticular) e utilizados pela planta como filtros UV, pois absorvem radiação UV-B sem alterar a radiação fotossinteticamente ativa. Além disso, também podem atuar como antioxidantes (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

o _{Nutrientes: Em solos pobres em nutrientes, paralelamente à menor taxa de crescimento,} geralmente se verifica maior produção de metabólitos secundários, particularmente derivados fenólicos. O estresse nutricional usualmente resulta em aumento nas concentrações de metabólitos secundários, exceto no caso da deficiência de nitrogênio e enxofre, em que a produção de metabólitos secundários contendo estes elementos é diminuída. Há evidências de que não é somente a disponibilidade ambiental de nitrogênio

em si que influencia o metabolismo secundário, mas sim a quantidade deste que é incorporada aos tecidos da planta. Em solos ácidos, devido a uma redução na taxa de conversão de amônio a nitrato, a incorporação de nitrogênio pode ser inibida, o que tem sido utilizado para explicar estudos que constataram altos níveis de produção de metabólitos secundários (especialmente compostos fenólicos) associados a plantas crescendo nesse tipo de solo. Os níveis de fósforo e potássio, apesar de relativamente pouco estudados, também podem ter efeitos na produção de metabólitos nitrogenados. Uma correlação bem estabelecida é que menores quantidades de metabólitos fenólicos são produzidas em condições de fornecimento abundante de nitrogênio. Os efeitos de nutrientes nos níveis de derivados do ácido chiquímico (especialmente ácidos cinâmicos simples e taninos hidrolisáveis e condensados) são bem documentados e deficiências em nitrogênio, fósforo, enxofre e potássio geralmente resultam em maiores concentrações destes metabólitos (GOBBO-NETO e LOPES, 2007). Em relação aos micronutrientes, a falta de boro reduz a produção de compostos fenólicos em palmeiras (RAJARATNAM e HOOK, 1975) e o fornecimento de estanho e bismuto aumenta a quantidade de taninos produzidos por Acacia catuchu (WATERMAN e MOLE, 1989).

o _{Altitude: De acordo com Gobbo-Neto e Lopes (2007), existe uma correlação positiva} entre o conteúdo total de flavonóides e a altitude; podendo ser explicada pela maior susceptibilidade à radiação UV em altitudes maiores.

o _{Estímulos Mecânicos e Ataques por Patógenos: Fatores mecânicos aos quais as plantas} estão susceptíveis, tais como ferimentos, ou mesmo meros estímulos, causados por chuva, granizo, vento, areia, invasão por patógenos e pastagem de herbívoros, também podem influenciar a expressão do metabolismo secundário. Uma forma de defesa induzida é a resposta a curto ou longo prazo à danificação de tecidos vegetais aumentando a produção e o acúmulo de metabólitos secundários já existentes na planta, levando à fuga dos animais. Este acréscimo é, às vezes, uma resposta restrita ao órgão danificado, e outras vezes uma resposta mais geral, podendo afetar a bioquímica vegetal como um todo (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

Além destes, outros fatores, tais como, condições de coleta, estabilização e estocagem podem afetar o conteúdo final de metabólitos secundários em plantas (GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

Visto que inúmeros fatores podem levar a variações no conteúdo de metabólitos secundários, fica clara a necessidade de estudos visando detectar as condições e épocas para cultivo e/ou coleta que conduzam a uma matéria-prima vegetal com concentrações desejáveis

de princípios ativos. Também se existe a necessidade de uma análise química detalhada, visando identificar e quantificar quais os principais constituintes bioativos presentes na espécie vegetal a ser pesquisada.

5.2.1.1 Compostos Fenólicos

Os compostos fenólicos são metabólicos secundários das plantas derivados principalmente da via metabólica do ácido chiquímico (FIGURA 12), a qual converte intermediários da glicólise e da via das pentoses fosfato (fosfoenolpiruvato e a eritrose-4- fostato) em aminoácidos aromáticos, cujo principal representante é a fenilalanina (NATIVIDADE, 2010).

FIGURA 12: Via do ácido chiqímico.

FONTE: Adaptado de Dantas (2010).

A enzima fenilalanina amônia liase (PAL) atua como reguladora do processo e dela originam-se a maioria dos compostos fenólicos, na forma livre ou ligados a açúcares e proteínas, englobando moléculas simples até compostos com alto grau de polimerização (FIGURA 13) (NATIVIDADE, 2010).

FIGURA 13: Principais compostos fenólicos derivados da enzima fenilalanina amônia liase (PAL).

FONTE: Adaptado de Dantas (2010). 5.2.1.1.1. Estrutura química dos compostos fenólicos

Os compostos fenólicos possuem uma ampla variedade de estruturas, variando de estruturas simples que contêm um único anel aromático a substâncias poliméricas altamente complexas, englobando mais de 10.000 compostos distintos, sendo o composto mais comum um fenol simples (FIGURA 14) (OLDONI, 2007; PRADO, 2009; ANASTASIADI et al., 2010; KATALINIC et al., 2010; SANTOS 2012). Mas apesar desta diversidade estrutural, o grupo de compostos é frequentemente referido como “polifenóis”.

FIGURA 14: Representação da estrutura química de um fenol simples.

FONTE: Bravo e Saura-Calixto (1998)

Podem ser encontrados na natureza sob a forma de ésteres ou heterosídeos, sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos polares. Apresentam intensa absorção na região do ultravioleta e são facilmente oxidáveis por enzimas, metais, luz, calor ou em meio

alcalino, acarretando em escurecimento de soluções ou compostos isolados. Por terem características de um ácido, podem ser isolados por solubilidade em soluções básicas alcalinas, como a solução de carbonato de sódio (OLDONI, 2007).

5.2.1.1.2 Classificação dos compostos fenólicos

Os compostos fenólicos podem ser classificados de acordo com sua estrutura química básica ou esqueleto principal e possíveis substituições nessa estrutura básica por associação com carboidratos e formas polimerizadas (TABELA 1) (FARAH e DONANGELO, 2006; OLDONI, 2007; BERGAMASCHI, 2010; SANTOS, 2012).

Podem também ser divididos em dois grupos: os flavonoides e os não-flavonóides. Os flavonoides podem subdividir-se em: flavonóis, flavonas, flavanóis, flavanonas, isoflavonas e antocianidinas/antocianinas. Já os compostos fenólicos não-flavonóides são representados pelos ácidos fenólicos e outros derivados fenólicos como os estilbenos, cumarinas e taninos (FIGURA 15) (ANASTASIADI et al., 2010; KATALINIC et al.,2010; RAVELLI, 2011).

TABELA 1: Classificação dos compostos fenólicos de acordo com sua estrutura química básica.

Estrutura Básica Compostos Fenólicos

C6 Fenóis simples

C6-C1 Ácidos Hidroxibenzóicos

C6-C2 Acetofenonas e Ácidos Fenilacéticos

C6-C3 Ácidos Hidroxicinâmicos (ácidos cinâmicos e compostos análogos, fenilpropenos, cumarinas, isocumarinas e cromonas)

C6-C4 Naftoquinonas

C6-C1-C6 Xantonas e Benzofenonas

C6-C2-C6 Estilbenos e Antraquinonas

C6-C3-C6 Flavonóides, Isoflavonóides e Chalconas

(C6-C3)2 Lignanas (C6-C3-C6)2 Diflavonóides (C6)n Melaninas vegetais (C6-C3)n Ligninas (C6-C1)n Taninos hidrolisáveis (C6-C3-C6)n Taninos condensados

FONTE: Adaptado de Oldoni (2007).

FIGURA 15: Classificação dos compostos fenólicos

FONTE: Adaptado de: Ferreira e Abreu (2007) o _Flavonóides

Os flavonóides foram descobertos em 1930, pelo ganhador do prêmio Nobel de Medicina, Szent-Gyrgy, que extraiu a citrina da casca do limão, possuindo esta substância a capacidade de regulação da permeabilidade dos capilares. Assim, esta classe de produtos foi inicialmente denominada vitamina P, e também por vitamina C2, visto que algumas substâncias pertencentes a esta classe apresentam propriedades semelhantes às da vitamina C. Porém, essas substâncias não foram confirmadas como vitaminas e esta classificação foi abandonada em 1950 (MARTÍNEZ-FLORES et al.,2002; SANTOS, 2009).

A estrutura básica dos flavonoides é um esqueleto de 15 átomos de carbono organizados em três anéis (C6-C3-C6), denominados A, B e C (FIGURA 16). É baseada no núcleo flavilium, o qual consiste de três anéis aromáticos. O benzeno do primeiro anel (A) é condensado com o sexto carbono do terceiro anel (C), que na posição 2 carrega um grupo fenila como substituinte. O anel C pode ser um pirano heterocíclico, gerando as estruturas básicas das leucoantocianinas (ou pró-antocianinas ou catequinas) e antocianidinas, e é denominado de núcleo flavana. As várias classes de flavonoides diferem quanto ao nível de substituição do anel C, enquanto compostos individuais dentro da mesma classe diferem no

padrão de substituição dos anéis B e C (BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006; SANTOS, 2009; HILGEMANN, 2010; SANTOS, 2012).

FIGURA 16: Representação da estrutura química geral de uma molécula de flavonóide.

FONTE: Balasundram, Sundram e Samman (2006)

Os flavonoides em plantas geralmente são acompanhados por açúcares, recebendo assim a denominação de glico-flavonoides ou flavonoides glicosilados. Estas substituições incluem D-glicose, L-ramnose, glicoramnose, galactose e arabinose. O resíduo de açúcar da molécula do flavonoide é provavelmente o principal fator determinante de sua absorção pelo organismo. Quando se apresenta isenta de glicídios (açúcares), a estrutura recebe o nome de aglicona. Esta forma é mais lipofílica, facilitando a interação com as membranas celulares (BIRT et al., 2001; NIELSEN et al., 2006; SALEM et al., 2010; ARAUJO, 2012).

É o grupo mais comum e amplamente distribuído de compostos fenólicos em plantas (FIGURA 17). São parte integral tanto da dieta de animais como de humanos. Os flavonoides geralmente ocorrem em plantas como derivados glicosilados, e contribuem para os tons azul, vermelho e laranja, em folhas, flores e frutas. Além de vários vegetais e frutas, os flavonoides são encontrados em sementes, nozes, grãos, condimentos, e diferentes plantas medicinais, assim como em bebidas, como vinho, chá e cerveja (HILGEMMAN, 2010).

Os flavonoides desempenham diferentes papéis na ecologia de plantas. Devido a suas cores atrativas, flavonas, flavonóis e antocianidinas podem agir como sinais visuais para a polinização de insetos. Em virtude de sua adstringência, catequinas e outros flavonóis podem representar um sistema de defesa contra insetos prejudiciais à planta. Além disso, protegem a planta da radiação UV solar devido à sua propriedade de absorver este tipo de radiação (HASSIMOTO, 2005; HILGEMMAN, 2010).

FIGURA 17: Representação da estrutura química geral das principais classes de flavonoides.

FONTE: Balasundram, Sundram e Samman (2006)

Grande parte das ações biológicas dos flavonóides pode ser atribuída às suas propriedades antioxidantes, seja através de sua capacidade redutora, seja por meio da influência que exercem no estado redox do meio intracelular (SANTOS, 2012). A atividade antioxidante de flavonóides é determinada pelo anel B, enquanto que o resto da estrutura apresenta apenas uma pequena contribuição. Isto se verifica devido uma maior capacidade eletro-doadora deste anel. Além disso, a presença de grupos hidroxila nas posições 3, 4 e 5 do anel B tem sido descrita como responsável por aumentar a atividade antioxidante dos flavonóides em comparação a outros compostos com apenas um grupo hidroxila (BALASUNDRAM, SUNDRAM e SAMMAN, 2006; SANTOS, 2009).

Os flavonóides possibilitam a inibição da oxidação das lipoproteínas de baixa densidade pelos macrófagos. Diversos flavonóides apresentaram a capacidade de inibir a formação de óxido nítrico em macrófagos e sequestrar os radicais peroxila, hidroxila e DPPH. Eles também podem inibir as enzimas responsáveis pela formação do ânion superóxido, além das enzimas ciclooxigenase, lipoxigenase, mono-oxigenase, succinoxidase mitocondrial, NADH oxidase (SANTOS, 2009).

Em alguns estudos, flavonóides como a catequina, quercetina e o kaempferol foram capazes de inibir a oxidação do ácido linoléico. A catequina também apresentou atividade antioxidante no retardamento da degradação endógena do α-tocoferol e do -caroteno, bem como, na inibição da oxidação de lipídios plasmáticos (SANTOS, 2009).

Devido a suas propriedades antioxidantes os flavonoídes estão envolvidos na prevenção de doenças como, alergias, inflamações, artrites, doenças cardiovasculares,

arteriosclerose, doenças degenerativas e câncer (SCHRAMM e GERMAN, 1998; ISHIGE et al., 2001; KATSUBE et al., 2003; ABDILLE et al., 2005; SANTOS, 2009)

De acordo com Santos (2012), os flavonóides são os polifenóis mais comuns na dieta, correspondendo a aproximadamente 1/3 da ingestão diária. Em um estudo citado por Horst e Lajolo (2007) sugeriu que a ingestão mínima total de flavonóides por dia seja de 1 g.

Fatores agronômicos e ambientais podem influenciar na quantidade e, em consequentemente, no perfil de flavonóis de uvas. A quantidade total de flavonóides nas uvas varia de 1 a 80 mg/Kg de baga fresca, nas cultivares vermelhas; muitas vezes sendo mais rica do que as de cor branca (MATTIVI et al., 2006; MAKRIS, KALLITHRAKA e KEFALAS, 2006; CASTILLO-MUÑOZ et al., 2010; FIGUEIREDO-GONZÁLEZ et al., 2012; FLAMINI et al., 2013).

 Flavonóis

Os flavonóis são uma das maiores subclasses de flavonoides e possuem no anel C, uma dupla ligação na posição C2-C3 (GRIS, 2010).

Possuem coloração branca ou amarela clara e geralmente acompanham as antocianinas em frutos, provavelmente porque apresentam rotas de biossíntese semelhantes, além de atuarem na copigmentação das antocianinas e função de foto-proteção (BATISTA, 2010; FLAMINI et al., 2013).

Estão localizados principalmente na epiderme externas da pele, uma vez que eles atuam como agentes de proteção UV. Em uvas, sua síntese começa nos botões florais, as maiores concentrações sendo encontradas algumas semanas depois do véraison (mudança de coloração da baga). É então estabilizada durante o desenvolvimento inicial dos frutos e diminui à medida que os bagos de uva aumentam de tamanho (FLAMINI et al., 2013).

O conteúdo total e padrão de flavonóis é altamente variável entre os genótipos e também pode ser modulada em certa medida por fatores bióticos e abióticos (FLAMINI et al. 2013).

Dentre os flavonóis, destacam-se a quercetina, rutina, kaempferol e miricetina. Os principais flavonóis da uva são a quercetina e a miricetina (GRIS, 2010).

A quercetina é encontrada em altas concentrações na cebola (284-486 mg/ kg), couve (100 mg/kg), vagem (32-45 mg/kg), brócolis (30 mg/kg), repolho (14 mg/kg) e tomate (8mg/ kg). Entre as frutas, grandes concentrações de quercetina são encontradas na maçã (21-72 mg/ kg). No vinho tinto, o teor de quercetina varia entre 4 -16 mg/ L. O chá preto é a bebida que apresenta maior concentração de quercetina, em torno de 10-25 mg/L (HERTOG et al., 1993; ARAÚJO, 2012). Abe et al. (2007), relataram valores de 0,72 mg.100g-1 em base úmida para

uvas da variedade Moscato Embrapa e de 2,57 mg.100g-1 em base úmida, para uvas da variedade Niágara Rosada.

Além de sua atividade antioxidante, a quercetina exerce um efeito próapoptótico direto em células tumorais, podendo efetivamente bloquear o crescimento de várias linhagens celulares de câncer em diferentes fases do ciclo celular. Estudos demonstram que a quercetina é capaz de regular o ciclo celular, interagir com os locais de ligação do estrógeno tipo II, diminuir a resistência às drogas e induzir a apoptose de células tumorais (YOSHIDA et al., 1990; XIAO et al., 1998; YANG et al., 2001; ARAÚJO, 2012).

A isoquercitrina (Q3G) é composta pela quercetina ligada a uma molécula de glicose. Como pode ser visto na Figura 18, existe uma similaridade estrutural entre a quercetina, a Q3G e a rutina, e por isso os três compostos exibem atividades biológicas em comum, incluindo os efeitos antiproliferativos em diversas linhagens tumorais, propriedades anti- inflamatórias e antialérgicas, atividade antioxidante e efeitos na prevenção de doenças ateroscleróticas (FERNANDEZ et al., 2005; WACH, PYRZYNSKA e BIESAGA, 2007; MOTOYAMA et al., 2009; ARAÚJO, 2012).

FIGURA 18: Representação da estrutura química das molécula de rutina, isoquercitrina e quercetina.

FONTE: Adaptado de Wang et al. (2011).

A rutina (quercetina-3-0-rutinosídeo) é um glicosídeo conjugado, pertencente à classe dos flavonóis, caracterizada pela forma aglicona, a quercetina (3, 5, 7, γ‟-4‟- pentahidroxiflavona) ligada na posição C2 do anel C a uma molécula dissacarídica, a rutinose (C12H22O10), que é composta por uma molécula de ramnose e uma de glicose (WILLIAMSON et al., 1996; ARAÚJO, 2012). A rutina e seus derivados representam cerca de 95% do total de flavonoides ingeridos, estando presentes em altas concentrações na cebola, na maçã, no brócolis, no vinho, no chá (HERTOG et al., 199γ), nos frutos de fava d‟anta (Dimorphandra sp.) (planta do cerrado brasileiro) (CHAVES e USBERTI, 2003), em cascas de frutas cítricas (laranja, limão, lima) (BILBAO et al., 2007).

De acordo com Jo et al. (2010), em um estudo a respeito das propriedades inibitórias da rutina, da quercetina e da QγG sobre as α-glicosidases, enzimas responsáveis pela hidrólise de carboidratos e, consequentemente, pela hiperglicemia pós-prandial que ocorre no diabetes mellitus não-dependente de insulina; a quercetina e seus derivados foram inibidores da isomaltase ainda mais potentes do que a acarbose, fármaco empregado regularmente como redutor da glicemia.

A alta atividade antioxidante exercida pela Q3G desempenha papel importante na proteção das células contra o dano oxidativo. Soundararajan et al. (2008) mostraram que essa atividade citoprotetora resulta da indução exercida pela Q3G sobre a expressão de genes associados à biossíntese de lipídeos e de colesterol, resultando na manutenção da integridade da membrana celular na presença de estresse oxidativo. No entanto, investigações in vitro a respeito do mecanismo protetor da quercetina e seus derivados sobre danos oxidativos em células C6 de glioma murinho mostraram que a quercetina, mas não a rutina e a Q3G, foi efetiva como protetor celular (CHEN et al., 2006).

Estudos relataram que a rutina possui várias propriedades farmacológicas, tais como: atividade antioxidante (BOYLE et al., 2000) com alto potencial de neutralização de radicais OH e O2-(METODIEWA, KOCHMAN e KAROLCZAK, 1997) e inibição da peroxidação lipídica (NEGRÉ-SALVAYRE et al., 1991), além das atividades citoprotetora (POTAPOVICH e KOSTYUK, 2003), vasoprotetora (IHME et al.,1996; LINDAHL e TAGESSON, 1997; TANG et al., 2011), antiproliferativa (SANTOS et al., 2011, KUNTZ et al., 1999), antitrombótica (SHEU et al., 2004) e cardioprotetora (ZIAEE et al., 2009).

A rutina é capaz de diminuir a permeabilidade capilar, exercendo efeito vasoconstritor sobre os vasos sanguíneos periféricos e inibindo o conteúdo de fator de ativação plaquetária