Conclusões

A administração de bST aumenta o desenvolvimento parenquimal através do estímulo de diversos genes positivamente relacionados a proliferação celular e desenvolvimento tecidual e da inibição da expressão de genes negativamente relacionados a esse processo.

Aparentemente, a dieta com níveis protéicos e energéticos elevados não causou alterações em genes relacionados a desenvolvimento parenquimal e de acordo com os resultados obtidos no presente trabalho não pode ser considerado efeito negativo no desenvolvimento parenquimal na fase pré-púbere.

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CAPÍTULO 3 –EXPRESSÃO GÊNICA DE LEPTINA E SEU RECEPTOR (OB-RB) NO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE NOVILHAS LEITEIRAS SUPLEMENTADAS COM BST E ALIMENTADAS COM CONCENTRADOS CONTENDO NÍVEIS PROTÉICOS E ENERGÉTICOS ELEVADOS

RESUMO – O aumento na taxa de crescimento de novilhas pré-púberes diminuiu

a idade a puberdade e causou diminuição na produção leiteira subseqüente. A administração de bST antes da puberdade aumentou a quantidade de parênquima e diminuiu o tecido adiposo no úbere. O presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos de níveis energéticos e protéicos da dieta e do bST na expressão gênica da leptina e seu receptor (Ob-Rb) no parênquima mamário. O tecido utilizado foi coletado num experimento prévio, com delineamento experimental em fatorial 2 X 2 com 4 tratamentos (duas dietas, com ou sem administração de bST). O RNA total foi extraído do tecido de 32 animais (8/tratamento) e os níveis de expressão gênica testados em qRT-PCR. O método de delta-delta Ct (ǻǻCt) foi aplicado para determinar as variações entre os tratamentos e os níveis de significância testados com o procedimento GLM. Dietas com níveis protéicos e energéticos elevados proporcionaram aumento no mRNA de leptina em 56% (P<0,03) e diminuição do mRNA de Ob-Rb em 18% (P<0,03) enquanto que bST diminuiu o mRNA de leptina em 74% (P<0,01) e de Ob-Rb em 23% (P<0,01). A interação dieta X bST não foi significativa nos genes testados. Dietas com níveis protéicos e energéticos elevados aumentou a expressão de leptina na glândula mamária enquanto que o bST diminuiu a mesma, consistentemente com um possível papel inibitório da leptina no desenvolvimento mamário.

1. INTRODUÇÃO

O estabelecimento do potencial de produção de leite é criticamente determinado durante a fase pré-púbere do desenvolvimento mamário (SEJRSEN & PURUP, 1997). Um processo complexo envolvendo fatores ambientais (fotoperíodo e dieta), o sistema endócrino, além de inúmeros fatores localmente produzidos regula o desenvolvimento e crescimento da glândula mamária (OKA & YOSHIMURA, 1986; FORSYTH, 1989).

Os efeitos nutricionais no desenvolvimento mamário foram amplamente estudados. Diversos trabalhos mostraram que a alimentação com níveis energéticos elevados durante a fase pré-púbere pode causar um efeito prejudicial no desenvolvimento mamário (GARDNER, 1977; SEJRSEN, 1978). RADCLIFF et al., (1997) encontraram aumento de gordura na glândula mamária sem diminuição da massa parenquimal total quando os níveis energéticos altos foram combinados com níveis protéicos igualmente elevados. Em um trabalho subseqüente, animais recebendo essa dieta tiveram uma diminuição na produção leiteira de 14% durante a primeira lactação, quando comparados a animais que receberam uma dieta padrão (RADCLIFF et al., 2000), sugerindo efeito nutricional no desenvolvimento mamário pré-púbere.

Os efeitos deletérios do desenvolvimento mamário de animais em crescimento rápido foi correlacionado ao excesso de depósito de gordura na glândula mamária dos mesmos (SWANSON, 1960). O aumento de gordura corporal causou aumento nas concentrações de leptina no soro sangüíneo (DELAVAUD et al., 2000). Desde sua descoberta em 1994 (ZHANG et al., 1994) a leptina, uma proteína semelhante a citocina que foi principalmente sintetizada nos adipócitos foi relacionada a diversos processos metabólicos, regulando funções orgânicas básicas como ingestão de energia e divisão celular (HOUSEKNECHT et al., 1998). A adição de tecido adiposo à cultura de células epiteliais mamárias diminuiu a proliferação celular (MCFADDEN & COCKRELL, 1993), reforçando a suposição de um possível prejuízo do acúmulo de gordura no úbere durante o desenvolvimento mamário. Além disso, SILVA et al. (2002) demonstraram que a adição de leptina ao meio de cultura de linhagens de células MAC-T, exerceu um

efeito antagônico ao IGF-1 e FBS (soro fetal bovino), causando um decréscimo na síntese de DNA das células.

A administração de somatotropina bovina recombinante (bST) durante a fase pré-púbere aumentou as taxas de crescimento e diminuiu a quantidade de gordura na carcaça (VESTERGAARD, et al., 1993). Além disso, injeção de bST em novilhas leiteiras aumentou a massa de parênquima total (SEJRSEN et al., 1986), a quantidade de DNA e RNA total no parênquima e o número de células epiteliais (RADCLIFF et al., 1997) e diminuiu o tecido adiposo mamário (SEJRSEN et al., 1986).

A ação lipolítica da somatotropina (ST) promovendo a redução da deposição de gordura foi bem estabelecida (FAIN et al., 1965; GOODMAN, 1968). Indivíduos deficientes em ST, apresentaram aumento na massa de gordura corporal e o tratamento com ST atenuou essa característica (DEOER et al., 1995). Os níveis de leptina foram associados a massa de gordura corporal (CONSIDINE et al., 1996) e indivíduos deficientes em ST apresentaram níveis séricos de leptina elevados (KRISTENSEN et al., 1998). Além disso, ISOZAKI et al (1999) encontraram uma diminuição nos níveis de mRNA de leptina na gordura visceral de ratos Zucker obesos, geneticamente modificados para expressão de leptina, tratados com ST.

Esses fatos somados sugerem que a ST exerceu funções nos níveis de leptina e a interação entre essas duas moléculas poderia estar relacionada ao estímulo do bST no desenvolvimento mamário. Uma vez que o receptor de leptina estivesse presente no tecido mamário de animais em crescimento, haveria possibilidade de participação da leptina no desenvolvimento mamário, a mesma poderia estar também envolvida nos efeitos deletérios causados pelo excesso de deposição de gordura na glândula já que a adição dessa molécula à cultura de células MAC-T causou diminuição na proliferação celular in vitro (SILVA et al., 2002)

O presente trabalho teve por objetivo determinar os possíveis efeitos da administração de bST e da dieta com altos níveis energéticos e protéicos na expressão gênica de leptina e seu receptor (Ob-Rb) no parênquima mamário de novilhas leiteiras.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Animais Utilizados e Coleta de Tecidos

No presente trabalho utilizou-se tecidos de 32 novilhas da raça Holandesa de um experimento prévio conduzido em 1994 no Dept. de Ciências Animais da Michigan State Unversity (MSU) (RADCLIFF et al., 1997). Os animais com peso médio de 126 kg foram divididos em 4 grupos, em um delineamento experimental em fatorial 2 X 2 e os tratamentos tiveram início quando as novilhas atingiram 120 dias de idade.

No grupo controle (LC) os animais receberam alimentação ad libitum com uma ração completa, formulada para proporcionar ganho de 0,8 kg/dia. No segundo grupo (LB) os animais foram alimentados ad llibitum com a dieta controle e injetados diariamente com somatotropina bovina recombinante – bST (25 µg/kg de peso corporal, Pharmacia and Upjohn Inc., Kalamazoo, MI.; grupo LC + bST = LB). No terceiro grupo (HC = dieta elevada sem administração de bST), as novilhas foram alimentadas com uma ração completa contendo níveis energéticos e protéicos elevados formulada para produção de 1,2 kg/dia. Por fim, o quarto grupo experimental (HB = dieta elevada e suplementados com bST) compreendeu animais alimentados com a dieta elevada e injetados diariamente via intra-muscular com bST. Os animais foram abatidos conforme atingissem a idade fisiológica correspondente a fase luteal inicial do 5o. ciclo estral, ou seja em média 71 dias após o início da puberdade, tendo as novilhas dos grupos LC e LB atingido essa idade fisiológica aproximadamente 276 dias após o início do experimento com ganho de peso médio diário de aproximadamente 0,8 kg e as dos grupos HC e HB após 218 dias, com ganho de peso médio diário de 1,23 kg (RADCLIFF et al., 1997).

No presente trabalho, grupo dieta controle “L” compreende os grupos dieta controle suplementados ou não bST (L = LC + LB), enquanto que grupo dieta elevada “H”, refere-se as novilhas em dieta elevada, independente da administração de bST (H = HB + HC). No tocante aos efeitos principais de bST, dois grupos são considerados: grupo controle para bST “C”, que compreende animais que não receberam

administração de bST, independentemente da dieta (C = LC + HC) e grupo “B, que compreende animais recebendo bST em ambas as dietas (B = LB + HB). A composição detalhada da dieta é apresentada na Tabela 01 do Capítulo 02.

Extração de RNA

O RNA total foi extraído utilizando-se o Ribopure Kit (Ambion) a partir de 100 mg de tecido parenquimático de 32 animais (8/tratamento). Após extração, o RNA foi ressuspenso em água MiliQ livre de RNAse em quantidade suficiente para atingir uma concentração mínima de 1,25 mg/mL, as amostras foram então analisadas em espectrofotômetro, para determinação da concentração e a pureza do RNA avaliada pela relação entre a absorbância em 260 e 280 nm.

Para verificar a qualidade do RNA, 1,0 µL da solução contendo de 100 – 500 ng de RNA foi analisada no Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), o qual elimina a necessidade da realização de gel eletroforese com brometo de etídeo. As amostras foram consideradas de boa qualidade quando a relação entre os picos 28 S e 18 S foi • 0,9. Armazenaram-se as amostras a - 80°C até a realização dos experimentos de PCR em tempo real (qRT-PCR).

Determinação da Expressão Gênica de Leptina e OB-Rb em qRT-PCR

A síntese de cDNA para realização de qRT-PCr foi realizada com RNAse H- Superscript II, 10 nM dNTP mix, 0,1 M DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 100 uM dT18 primer. Um microlitro da solução foi então empregada para determinação de quantidade e qualidade de cDNA em um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc., Rockland, DE). Os “primers” para os genes testados e controle foram desenhados com auxílio do programa de informática Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA), as seqüência de “primers” reverso e “forward” utilizados nos experimentos são apresentados na Tabela 01.

Antes da realização dos experimentos testou-se a eficiência dos “primers” através da realização de curvas padrões contendo diferentes concentrações da amostra de cDNA (0,1 – 100 ng). Além disso, realizou-se experimentos prévios com os primers em diferentes concentrações (150; 300; 600 e 900 nM) afim de determinar a melhor concentração de “primer” a ser utilizada. A quantidade ótima determinada para todos os “primers” foi de 300 nM (150 nM de reverso misturados a 150 nM de “forward”).

Tabela 01. Seqüências dos “Primers” Utilizados em qRT-PCR: Controle: Glucoronidase ß (GUS); Leptina e Ob-Rb

Gene e “primer” Seqüência

GUS “Forward” TGTCATCGCACACAGAGCAA Reverso CACAAAATCCAGGTGAGAAGCTT Leptina “Forward” GGGTGATTTCAGAGCCTTTGG Reverso CCATCGTATGTTGTGTGGGAAT Ob-Rb “Forward” GGGCACATCCAAGCATTAAAA Reverso GGCCGGCATCAAAGCTTT

Utilizou-se duas placas de reação MicroAmp Optical 96-Well (Applied Biosystems, Foster City, CA) para cada um dos genes testado sendo que cada placa consistiu de 16 diferentes amostras (4/tratamento), com 3 repetições para o gene testado e controle, totalizando 48 poços para o gene e os 48 restantes para o controle.

Em cada um dos poços foi adicionado 300 nM de primer “reverse e forward” (150 nM de cada), 30 ng da amostra de cDNA, 12,5 µL de SYBR Green PCR Máster Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) e quantidade suficiente de água “RNAse-free” para completar 25 µL de volume nas reações. As placas foram cuidadosamente fechadas com uma cobertura adesiva MicroAmp (Applied Biosystems, Foster City, CA). Utilizou-se o Applied Biosystems 7000 DNA sequence detection system (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) para realização dos experimentos. Obtiveram-se os valores de CT (quantidade de ciclos necessários para amplificação do gene em questão) com o auxílio do software ABI Prism 7000 version 1.1 (Applied Biosystems).

Normalização dos Dados Obtidos em qRT-PCR e Análise Estatística

Para identificação do melhor gene controle, cinco diferentes genes foram testados (glucoronidase ß – GUS; ribosomal protein, large – P0; phosphoglycerate kinase 2 – PGK; Cyclophilin – CYC e 18S ribosomal RNA – 18S) e as médias geométricas comparadas através das médias de valores de Ct obtidas de 4 diferentes amostras para cada tratamento, de acordo com VANDESOMPELE et al. (2003). GUS foi considerado o gene expresso mais estável entre os diferentes tratamentos e utilizado para normalização dos dados já que o Ct (ciclos de amplificação) do mesmo foi o que apresentou menor variação entre os diferentes tratamentos. Na Tabela 02 encontram-se os valore médios de Ct nos quatro diferentes tratamentos para o gene controle GUS.

Tabela 02. Variação de Ct para o gene controle “GUS” entre os 4 diferentes tratamentos Tratamento Variação de Ct5 _{Desvio Padrão Erro Padrão}

LC1 24,22 0,56 0,19

LB2 24,28 0,76 0,27

HC3 _{24,37 0,48 0,17}

HB4 _{24,19 0,67 0,23}

1_{LC = animais alimentados com a dieta controle;}

2_{LB = animais alimentados com dieta controle e suplementados com bST;}

3_{HC = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados;}

4_{HB = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados e supplementados com}

bST.

5_{Ct = número de ciclos necessários para amplificação do cDNA testado.}

Os valores de CT para o gene testado foram normalizados utilizando as diferenças das médias das 3 repetições de cada amostra contra o controle. O método de 2-ǻǻCT foi então utilizado para verificar possíveis variações entre os diferentes tratamentos, de acordo com a equação abaixo (LIVAK & SCHMITTGEN, 2001).

ǻǻCT = (CTGTESTE – CTGCGUS)TX – (CTGTESTE – CTGCGUS)TY; onde: CTGTESTE = ciclo de amplificação do cDNA do gene testado (média das três repetições),

CTGCGUS = ciclo de amplificação do cDNA do gene controle (GUS) (média das três repetições),

TX = tratamento testado X, TY = tratamento testado Y.

Vale ressaltar que o resultado da fórmula será inverso já que, os genes com maior quantidade de cDNA amplificarão antes do que os com menor quantidade e portanto, afim de calcular a variação de expressão gênica entre os tratamentos de interesse é necessário elevar-se o valor negativo do resultado obtido ao exponencial 2 (2-ǻǻCT).

A análise de dados para avaliação dos efeitos de bST ou seja, B (compreende os animais dos grupos HB e LB) avaliado contra C (compreende os animais dos grupos HC e LC) e dieta ou seja H (compreende os animais dos grupos HC e HB) testado contra L (compreende os animais dos grupos LB e LC) em fatorial 2X2 foi realizada em análise de variância utilizando-se o procedimento de modelo linear (PROC GLM, SAS, 2000). Para esse procedimento, os quatro grupos foram normalizados contra o grupo controle “HC”.

3. RESULTADOS

Após a normalização contra o gene controle GUS, os tratamentos foram normalizados contra o grupo controle (LC). Os resultados obtidos para o gene leptina encontram-se na Figura 01 e para o receptor de leptina (OB-Rb) nas Figuras 02.

A dieta com níveis protéicos e energéticos elevados (HC + HB = grupo H) causou um aumento de 56% na expressão de leptina (P<0,03) e diminuição de 18% para Ob- Rb (P>0,03) no parênquima mamário quando comparada aos animais recebendo dieta controle (LC + LB = grupo “L”). (Tabela 03 e Figuras 01 e 02).

Por sua vez, a administração de bST, em ambas as dietas (LB + HB = grupo “B”) diminuiu em 74% a expressão gênica de leptina (P<0,01) e em 23% a expressão de

Ob-Rb (P<0,01) no parênquima mamário, quando comparados aos animais que não receberam bST (HC + LC = grupo “C”) (Tabela 03 e Figuras 01 e 02).

Figura 01. Variação na expressão gênica de leptina baseada nas médias lineares transformadas pelo método de ǻǻCt entre os quatro diferentes tratamentos, normalizados contra o grupo dieta controle (LC). LB = animais recebendo dieta controle e suplementados com bST; HC = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados; HB = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados e supplementados com bST. Os erros foram calculados com base nos erros padrões das médias.

Figura 02. Variação na expressão gênica do receptor de leptina (OB-Rb) baseada nas médias lineares transformadas pelo método de ǻǻCt entre os quatro diferentes tratamentos, normalizados contra o grupo dieta controle (LC). LB = animais recebendo dieta controle e suplementados com bST; HC = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados; HB = animais alimentados com dietas contendo níveis protéicos e energéticos elevados e supplementados com bST. Os erros foram calculados com base nos erros padrões das médias.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 LC LB HC HB M éd ia s Lin eares tra n sf o rm adas em ∆∆ C T 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 LC LB HC HB M édias L ineares transfo rmadas em ǻǻ CT

A interação entre os tratamentos dieta e bST (H*B) não foi significativa para expressão gênica em nenhum dos genes testados, leptina (P>0,44) ou Ob-Rb (P>0,28) (Tabelas 03).

Quando comparados ao grupo dieta controle, sem administração de bST (LC), os animais recebendo dietas elevadas (HC) tiveram um aumento de 80% (P<0,04) na expressão gênica de leptina. Esse tratamento não alterou a expressão gênica do receptor Ob-Rb (Tabela 04).

Não foram encontradas diferenças significativas quando da administração de bST nos animais que receberam a dieta controle (LB_LC) para expressão gênica em nenhum dos genes testados (Tabela 04) .

A administração de bST em animais em dieta alta (HB) causou diminuição de mais de duas vezes (P<0,02) na expressão gênica de leptina e de 32% (P<0,01) na expressão gênica de Ob-Rb em relação ao grupo alimentados com níveis protéicos e energéticos sem administração de bST (HC) (Tabela 04).

Animais alimentados com níveis energéticos e protéicos elevados, recebendo