EXPRESSÃO GÊNICA NO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE
NOVILHAS LEITEIRAS
Betina Joyce Lew
Zootecnista
EXPRESSÃO GÊNICA NO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE
NOVILHAS LEITEIRAS
Betina Joyce Lew
Orientador: Prof. Dr. Mauro Dal Secco de Oliveira
Co-Orientador: Prof. Dr. Michael J. VanDeHaar
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Zootecnia.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2005
Orientador: Mauro dal Secco de Oliveira
Banca examinadora: Luis Felipe Prada e Silva, Maria Lucia Pereira Lima, Renato Luis Furlan, Paulo de Figueiredo Vieira
Bibliografia
1. Expressão gênica. 2. Glândula mamária. 3. Bovinocultura leiteira. I. Título. II. Jaboticabal - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 636.2
quase humanos, exibiam-se e brincavam conosco, como se tudo que mais desejassem, era arrancar-nos um sorriso. Naquele instante tive a certeza de que havia feito a escolha certa. Em silêncio, quase
acadêmica, o ensinamento, a cultura, e por terem me mostrado o quanto a vida pode ser bela, sendo simples, respeitando o próximo independentemente da cor da pele, da crença, da posição social, das diferenças culturais, por estarem sempre próximos mesmo quando distantes, por terem sido a base de toda minha construção, dedico;
Aos meus irmãos, Paulo, Denise e Débora, simplesmente por estarem sempre por perto mesmo que milhas e milhas distantes, ofereço;
A minha sobrinha Odaya, por me lembrar a importância da pureza e beleza de ser criança, ofereço;
Ao Ryan Wehner, amigo e companheiro, por estar ao meu lado em todos os momentos de minha jornada nos Estados Unidos, ofereço/
Ao Prof. Dr. Mauro Dal Secco de Oliveira, meu orientador, pela orientação, apoio, amizade, respeito com que sempre me tratou e principalmente, pelo voto de confiança em mim depositado.
Ao Prof. Dr Michael J. VanDeHaar, meu supervisor na Michigan State University (MSU) e co-orientador, pelo financiamento do projeto de pesquisa, orientação, carinho e respeito com que me recebeu em seu departamento, e finalmente pela amizade que se formou em tão pouco tempo de relacionamento.
Ao Sr. James Liesman (Jim), técnico do laboratório de bovinocultura leiteira da MSU, pelo auxílio no desenvolvimento do projeto e principalmente nas análises estatísticas, palavras e gestos de apoio, amizade e carinho durante toda a minha estadia na Michigan State University.
Ao Prof. Dr. Paul Coussens, diretor do Center for Animal Functional Genomics da MSU por ter aberto o seu laboratório para realização dos experimentos de microarray e real time RT-PCR.
A Sra. Sue S. Sipkovsky, técnica do Center for Animal Functional Genomics da MSU pelo ensinamento da técnica de Microarray e pela amizade e carinho.
Ao Prof. Dr. Guilherme J. M. Rosa, pela realização das análises estatíscas dos experimentos de Microarray.
Ao Dr Roy Radcliff, quem realizou os experimentos originais com as novilhas cujos tecidos foram utilizados no presente trabalho.
A todos os meus amigos da UNESP de Jaboticabal, em especial Julio Cezar Franco de Oliveira, Cristina Lima Sá Fortes, Cintia Loureiro e Eneida Almeida, pela amizade, carinho, compreensão, por estarem sempre prontos a escutar nos momentos difíceis e a celebrar nos momentos felizes.
necessário.
A família Matricarti que foram minha família durante o período que estive em Michigan. A todos os Professores da UNESP de Jaboticabal, especialmente os do Departamento de Zootecnia, de Fisiologia e de Tecnologia.
A todos os funcionários da UNESP de Jaboticabal, especialmente os do setor de bovinocultura leiteira, do departamento de Zootecnia, e da seção de pós-graduação da UNESP de Jaboticabal.
Com respeito e carinho agradeço as novilhas cujos tecidos foram utilizados nos experimentos do presente trabalho.
Ao CNPq pela bolsa de estudos durante o período de realização do doutorado no Brasil.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS...III
RESUMO... IV
SUMMARY... V
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS...1
1. Justificativa...1
2. Revisão da Literatura ...3
3. Objetivos ...12
4. Metodologia Aplicada ...13
5. Referências ...29
CAPÍTULO 2 – EXPRESSÃO GÊNICA DO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE NOVILHAS LEITEIRAS SUPLEMENTADAS COM BST E ALIMENTADAS COM DIETAS CONTENDO NÍVEIS PROTÉICOS E ENERGÉTICOS ALTOS...38
1. Introdução...39
2. Material e Métodos ...40
3. Resultados e Discussão ...48
4. Conclusões ...62
CAPÍTULO 3 –EXPRESSÃO GÊNICA DE LEPTINA E SEU RECEPTOR (OB-RB) NO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE NOVILHAS LEITEIRAS SUPLEMENTADAS COM BST E ALIMENTADAS COM CONCENTRADOS CONTENDO NÍVEIS PROTÉICOS E
ENERGÉTICOS ELEVADOS...67
1. Introdução...68
2. Material e Métodos ...70
3. Resultados ...74
4. Discussão ...77
5. Conclusões ...80
6. Referências ...81
CAPÍTULO 4 –ATIVIDADE MITOGÊNICA DE CÉLULAS MAMÁRIAS (MAC-T) CULTIVADAS COM IGF-1, FBS E IL-6 ...85
1. Introdução...86
2. Material e Métodos ...87
3. Resultados e Discussão ...90
4. Conclusões ...93
5. Referências ...95
LISTA DE ABREVIATURAS
bST – Somatotropina Bovina Recombinante
Cy3 – Fluoróforo de marcação verde em “microarray”
Cy5 – Fluoróforo de marcação vermelha em “microarray”
EST – Etiqueta de sequencia expressa (“Expressed Sequence Tags”)
FBS – Soro Fetal Bovino
GUS – ȕ-Glucuronidase
IGF – Fator de Crescimento Semelhante à Insulina (“Insuline-like Growth Factor”)
IGFBP – Proteínas ligantes de IGF (“IGF - Binding Protein”)
IL – Interleucina
MAC-T – Linhagens de células epiteliais mamária imortalizadas
NBFGC – “National Bovine Functional Genomics Consortium”
OB-R – Receptor de leptina
OB-Rb – Isoforma longa do receptor de leptina
PCR– Reação de polimerase em cadeia (“Polymerase Chain Reaction”)
PECAM – 1 – Molécula de adesão celular plaquetário-endotelial (“Platelet Endotelial
Cell-Adhesion Molecule)
qRT-PCR – PCR quantitativo em tempo real (“Quantitative Real time PCR”)
SPH– Serina Protease Hepsina
EXPRESSÃO GÊNICA NO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE NOVILHAS LEITEIRAS
RESUMO – Dietas com níveis energéticos elevados e suplementação com bST a novilhas pré-púberes diminuem a idade ao primeiro mas podem causar alterações de móleculas envolvidas no processo de desenvolvimento mamário. No presente trabalho objetivou-se examinar a expressão diferencial de genes relacionados ao desenvolvimento parenquimal de novilhas em crescimento acelerado e suplementadas com bST. Conduziu-se dois experimentos em fatorial 2x2, com 32 amostras de tecidos coletados de novilhas abatidas na fase pós-púbere inicial. Num experimento, aplicou-se a técnica de microarranjos com uma biblioteca de cDNA específica para bovinos (NBFGC) aonde avaliou-se simultaneamente a expressão de 18.263 diferentes ESTs. O segundo experimento analisou a expressão gênica de leptina e seu receptor no parênquima com a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Adicionalmente, foi realizado um experimento in vitro com linhagem de células mamárias MAC-T para verificação de possíveis interações entre a IL-6 e IGF-1 na proliferação celular. A administração de bST estimulou a expressão de diversos genes positivamente relacionados ao desenvolvimento parenquimal e inibiu a expressão de genes negativamente relacionados a esse processo, inclusive da leptina. A dieta causou poucas alterações nesses genes, mas aumentou a expressão de leptina no parênquima. A IL-6 diminuiu a proliferação celular induzida pelo IGF-1. Os resultados obtidos demonstraram alterações na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento tecidual em ambos os tratamentos, sendo que o bST atenuou os efeitos da dieta em genes negativamente relacionados a esse processo.
GENE EXPRESSION PROFILE IN DAIRY HEIFER MAMMARY PARENCHYMA
SUMMARY – High-energy diet and bST administration during pre-pubertal phase decrease age at first calving. However, these managements modify mammary development altering the expression of several genes related to parenchyma development. The objective of the present study was to analyze the effects of a high-energy diet and bST administration in the expression of genes related to tissue development in heifer mammary parenchyma. Two experiments were conducted in a 2X2 factorial, with 32 samples collected from animals killed during early post-pubertal phase. In the first experiment, the microarray technique was performed with a bovine specific cDNA library containing 18.263 ESTs. The second experiment focused in the expression of leptin and leptin-receptor in mammary parenchyma, using the qRT-PCR technique. Additionally, an in vitro experiment was conducted using an immortalized mammary epithelial cell line (MAC-T) to check possible interactions between IL-6 and IGF-1 in cell proliferation. bST administration stimulated the expression of several genes positive related to tissue development and inhibited the expression of genes negative related to this process, including leptin. High-energy diet altered the expression of few genes, but increased the expression of leptin in mammary parenchyma. IL-6 decreased IGF-1 induced cell-proliferation. The results point to alteration in expression of genes related to tissue development in both treatments and suggest that bST administration attenuates the effects of high-energy diet in genes negative related to tissue development.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1. JUSTIFICATIVA
A reorganização do mercado internacional, a formação de blocos econômicos, a inserção do Brasil no Mercado Comum do Sul (MERCOSUL) e a implantação da ALCA (Área de Livre Comércio das Américas) prevista para o ano de 2005, induz o mercado produtivo como um todo a adotar novas técnicas, a fim de proporcionar um produto final economicamente viável e competitivo, tanto em termos de qualidade como de quantidade e preço.
Apesar do aumento da produção e produtividade do leite no Brasil, o atual estágio deste setor encontra-se abaixo do seu potencial (GOMES, 1997; SANTOS, 2005). DERESZ (1992) sugeriu como uma das causas da baixa produtividade de leite no Brasil a avançada idade ao primeiro parto das novilhas. Tal fato ocasiona atraso no início da produção leiteira além de diminuição da taxa de natalidade do rebanho, reduzindo a taxa de descarte de vacas velhas e/ou de baixo potencial de produção, podendo causar um atraso em programas de melhoramento genético do rebanho, levando esses fatos em conjunto a redução na renda dessa indústria.
Em novilhas submetidas a taxas de ganho de peso diário elevado, foi observado diminuição nos níveis séricos de somatotropina (SEJRSEN et al., 1983; SEJRSEN & PURUP, 1997) esse hormônio diretamente relacionado a mamogênese. A aplicação de somatotropina bovina recombinante (bST) em novilhas pré-púberes diminuiu a quantidade de gordura no tecido mamário e aumentou a massa de tecido parenquimal (RADCLIFF et al, 1997), portanto a adoção desse tipo de manejo pode atenuar os efeitos deletérios da dieta no desenvolvimento mamário de novilhas em crescimento rápido na fase pré-púbere.
O desenvolvimento e crescimento da glândula mamária é um processo complexo de proliferação celular, diferenciação e morfogênese, regulado por proteínas e hormônios circulantes, que interagem localmente com fatores de crescimento (CUNHA & HOM, 1996), fatores de comunicação inter-celulares e compostos da matriz extra-celular (MATITASHVILI et al., 1997).
Diversos experimentos foram conduzidos com o objetivo de elucidar os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos no desenvolvimento da glândula mamária de novilhas submetidas a ganhos elevados de peso e injeção de bST (WEBER et al., 1999; BERRY et. al., 2001), no entanto esses mecanismos ainda continuam obscuros e a cada dia novas moléculas são implicadas nos ciclos bioquímicos envolvidos nos mesmos.
2. REVISÃO DA LITERATURA
O Desenvolvimento Mamário Na Fase Pré-Púbere
A glândula mamária é um órgão único e dinâmico já que a maior parte de seu desenvolvimento ocorre após o nascimento e apresenta mudanças cíclicas durante toda a vida produtiva do animal. Pode-se dividir as fases de desenvolvimento mamário em embrionário, pré-púbere, gestacional, lactante, e involução (processo que ocorre ao final da lactação). A glândula mamária apresenta basicamente dois tipos de tecidos: o epitelial ou parênquima mamário e o tecido adiposo ou tecido estromático. A Figura 01 representa esquematicamente o desenvolvimento dos tecidos mamários nas diferentes fases da vida do ruminante.
Figura 01 Representação esquemática do desenvolvimento da glândula mamária do ruminante do nascimento até a fase de involução ao final da lactação. O tecido epitelial é representado pela cor escura e o tecido adiposo pela cor clara. O tecido epitelial encontra-se presente em pequena quantidade ao nascimento, expandindo-se até atingir a puberdade, dando-se o desenvolvimento final e mais extenso durante a gestação e lactação. A glândula sofrerá involução após a lactação (adaptado de BERRY, 2002).
estroma que o circunda. O tecido epitelial de bovinos nessa fase consiste de botões primários e secundários que originam a cisterna da glândula e uma linha de ductos principal delineada por uma camada dupla de epitélio (ANDERSON, 1978).
Durante os 3 primeiros meses, o desenvolvimento da glândula é isométrico, (taxa de crescimento proporcional ao do corpo). Em roedores, o desenvolvimento da glândula nessa fase foi bem delineado, entre 3 e 4 semanas os botões terminais reapareceram, sinalizando o início da arborização dos ductos e direcionando a sua extensão ao perímetro do tecido adiposo. Os botões terminais abrangem então células corporais que dão origem ao ducto luminal e células epiteliais mamárias. Os ductos são mantidos enquanto que as células dos botões terminais proliferaram formando o estroma do tecido adiposo (FAULKIN & DEOME, 1960). Nos ruminantes, esse desenvolvimento é bem menos delineado. Em ovinos, por exemplo, a glândula pré-púbere não exibiu botões terminais e os ductos mamários foram circundados por tecido conjuntivo (AKERS & SEJRSEN, 1998). A figura 02 representa um corte longitudinal de glândula mamária de ovino com nove semanas de desenvolvimento, aonde pode-se notar a massa parenquimal circundada pelo tecido adiposo.
Figura 02. Corte longitudinal de glândula mamária de ovinos em fase de desenvolvimento inicial após o nascimento. Nota-se o parênquima mamário circundado pelo tecido adiposo nessa fase. TA representa o tecido adiposo e a flecha indica a massa parenquimática (extraído de BERRY, 2002)
1997). Nessa fase o desenvolvimento da glândula passa de isométrico a alométrico, ou seja, a taxa de crescimento da glândula é mais rápida que a do corpo do animal. O tecido adiposo (basicamente formado por adipócitos e tecido conjuntivo) e os ductos primários, composto do tecido parenquimal, que virá a constituir o sistema secretor da glândula no animal adulto, crescem rapidamente. A presença do tecido adiposo é essencial para o parênquima, contribuindo para seu desenvolvimento e diferenciação das células epiteliais (CUNHA & HOM, 1996). As extremidades dos ductos se alongam e crescem em direção ao tecido adiposo. Ductos bem desenvolvidos e arborescentes permitirão melhor desenvolvimento de um maior número de células secretoras durante a gestação (Figura 03). Portanto, apesar de a maior parte do crescimento mamário dar-se durante a gestação, a formação da rede de ductos durante o primeiro ano de vida determinaram a extensão do desenvolvimento lóbulo-alveolar na vida produtiva do animal (SEJRSEN et al., 1992).
Da puberdade até a gestação o desenvolvimento da glândula mamária é bem menos acentuado que nas fases anteriores. Durante o início do período pós-púbere inicial (peri-púbere) a proliferação celular mamária varia de acordo com a fase do ciclo estral. A maior concentração de DNA mamário em ratos ocorreu primeiramente durante os três primeiros ciclos estrais e manteve esse nível até a concepção (SINHA & TUCKER, 1969). Em geral, o nível máximo de desenvolvimento morfológico da glândula ocorreu durante o estro, enquanto que o pico mitótico deu-se ao diestro (IMAGAWA et al., 1994). Em novilhas, a concentração de DNA mamário foi maior no estro do que nas outras fases do ciclo (SINHA & TUCKER, 1969).
Figura 03. Corte histológico de glândula mamária de novilha pré-púbere. Pode-se notar a arborização da unidade de ductos terminais constituídos de tecido parenquimal em direção ao tecido adiposo (estroma) (adaptado de CAPUCO et al., 2000).
A Somatotropina e o Desenvolvimento Mamário– Controle Sistêmico e Local
O desenvolvimento e diferenciação da glândula mamária seria governado por hormônios de origem hipofisária e ovariana, uma extensa gama de fatores localmente produzidos pelo tecido adiposo e pelo tecido parenquimal (HOVEY et al., 1999) além de fatores de comunicação inter-celulares e interações entre diferentes células e compostos da matriz extra-celular (MATITASHIVILI et al., 1997). As interações que ocorrem entre esses diferentes fatores tornam ainda maior a complexidade do processo de desenvolvimento desse órgão (Figura 04).
ductos nas fases púberes enquanto que a sincronicidade entre produção de prolactina, estrógeno e progesterona foi implicada no enlongamento final dos ductos e formação lóbulo-alveolar após a concepção (LYONS, 1958; FORSYTH, 1994).
Figura 04. Representação esquemática da atuação dos hormônios sistêmicos e fatores localmente produzidos no desenvolvimento mamário. Fatores de crescimento (FC), compostos da matriz extra-celular (EMC), citocinas, entre outros inúmeros fatores produzidos tanto no tecido estromático como no próprio parênquima atuam autócrina e paracrinamente no desenvolvimento da glândula (adaptado de HOVEY et al., 1999).
A produção de bST em escala comercial permitiu a realização de diversos trabalhos evidenciando o envolvimento desse hormônio no estímulo do desenvolvimento mamário, tendo a sua administração aumentado a quantidade de tecido parenquimal (SEJRSEN et al., 1986; PURUP et al., 1993; RADCLIFF et al., 1997), de conteúdo de DNA e quantidade de células epiteliais e diminuído a quantidade de gordura no úbere de novilhas pré-púberes (RADCLIFF et al, 1997).
epiteliais (HOVEY et al., 1998). Além disso, apesar de ter sido detectado a presença tanto da proteína como do mRNA de receptores para somatotropina (ST) nas porções epitelial e estromática da glândula mamária (SINOWATZ et al., 2000), ligação específica do hormônio não pode ser demonstrada (PURUP et al., 1995). Uma vez que a administração de bST em novilhas aumentou os níveis do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) no soro sanguíneo (PURUP et al., 1993; COHICK et al, 1998; RADCLIFF et al., 2004) e IGF-1 seria um potente fator mitogênico das células epiteliais in vitro (WEBER et al., 1998; WEBER et al., 1999), portanto postulado como um dos mediadores dos efeitos da somatotropina no desenvolvimento mamário (AKERS et al., 2000).
Além disso, a administração de ST (somatotropina) exógena aumentou a expressão gênica de IGF-1 na glândula mamária (KLEINBERG; 1998). O IGF-1 foi produzido localmente na porção estromática da glândula mamária de roedores, humanos e ovinos, (HOVEY et al., 1998). HOVEY et al. (1999) sugeriram que o IGF-1 produzido na porção estromática da glândula mamária atuou paracrinamente em “feedback” positivo com o parênquima aumentando a proliferação das células epiteliais. Em novilhas pré-púberes a expressão gênica de IGF-1 também foi encontrada no estroma mamário e aumentou após administração de bST (WEBER, 1998).
As interações entre IGF-1 e ST no entanto são mais complexas do que o exposto já que em novilhas em taxas de crescimento acelerado há diminuição do ST e aumento do IGF-1 circulante. Extratos mamários obtidos de novilhas em crescimento rápido foram menos responsivos às ações do estímulo do IGF-1 na proliferação celular (SEJRSEN et al., 1998). Essa diminuição na responsividade ao IGF-1 em novilhas em crescimento rápido pode estar relacionada a modificações nas proporções de fatores localmente produzidos, como por exemplo as proteínas ligantes de IGF (IGFBP).
células primárias (WEBER et al., 1999) e aumentado os efeitos do IGF-1 em linhagens de células epiteliais mamárias - MAC-T (COHICK et al., 1998).
A produção de IGF-1 e IGFBP-3 na glândula mamária foi modulada por hormônios endócrinos. A ovariectomia diminuiu a expressão gênica mamária de IGF-1 em novilhas (AKERS et al., 2000) e a administração de estrógeno aumentou os efeitos da somatotropina na expressão gênica de IGF-1 mamário em roedores (RUAN et al., 1995). BERRY et al. (2001), em trabalho conduzido com novilhas pré-púberes, encontraram um aumento no IGF-1 quando da administração de estrógeno, não tendo o bST alterado a sua concentração, enquanto que a quantidade de IGFBP-3 diminuiu em resposta a ambos, estrógeno, bST e combinação dos dois hormônios. O aumento na proporção IGF-1:IGFBP-3 foi positivamente correlacionado a um aumento na proliferação celular (BERRY et al., 2001).
O mecanismo pelo qual o IGFBP-3 modulou as ações mitogênicas do IGF-1 ainda não foi completamente esclarecido, no entanto, essa proteína provavelmente ligar-se-ia ao IGF-1 tornando-o menos disponível a proliferação celular (BERRY et al., 2001). Existiria ainda a teoria de que o IGFBP-3 diminuiu a proliferação celular através de mecanismos independentes do IGF-1 (AKERS et al., 2000).
Apesar de IGF-1 ter sido postulado diversas vezes como mediador dos efeitos da somatotropina no desenvolvimento mamário, muito provavelmente existiriam mecanismos de ação que independeriam do IGF-1, uma vez que esse fator atuando sozinho, não foi capaz de substituir a somatotropina no estímulo do desenvolvimento alveolar na glândula mamária de roedores (PLAUT et al., 1993).
Além disso, fatores da matriz extra-celular seriam capazes de mediar a ação dos fatores de crescimento no desenvolvimento da glândula mamária, tornando todo o processo ainda mais complexo e difícil de ser decifrado (AKERS et al., 2000).
A maior parte dos trabalhos realizados mostrando os efeitos da administração de somatotropina exógena no processo de desenvolvimento mamário foram voltados ao envolvimento do mesmo nas ações da família dos IGFs (WEBER et al., 1999, AKERS et al., 2000; BERRY et al, 2001). Dada a complexidade do processo de desenvolvimento mamário, existe grande possibilidade de que o bST esteja envolvido em outros ciclos bioquímicos de ocorrência local ou sistêmica.
A Participação das Citocinas e Leptina no Desenvolvimento Mamário
A leptina, uma proteína semelhante as citocinas, foi relacionada quando da sua descoberta, à ingestão energética e regulação de peso e posteriormente implicada em diversas funções orgânicas, entre elas a divisão celular (HOUSEKNECHT et al., 1998). O seu receptor pertenceria a família dos receptores de citocina (ZHANG et al., 1997) e atuaria estimulando a tirosina-quinase janus intracelular (JAK) que foi ativada pelas proteínas ativadoras de transcrição e tradução (STAT). A forma longa do receptor de leptina (OB-Rb) foi identificado em diversos tecidos do organismo, inclusive nas células epiteliais mamárias de novilhas (SILVA et al., 2002).
As citocinas seriam mediadores solúveis que apresentaram variadas funções biológicas, dentre elas a proliferação celular (VAN DEUREN et al., 1992).Assim como a leptina, a presença de mRNA para diversas citocinas como a IL-1 Į e ȕ, IL-6, IL-10, TNF- foi identificada em células mamárias epiteliais normais de novilhas (OKADA ET AL., 1997).
Os efeitos das citocinas sobre o desenvolvimento e proliferação celular da glândula mamária foram reportados por diversos autores. Por um lado citocinas como a IL-1 e IL-6 inibiram a proliferação de células epiteliais mamárias de bovinos (OKADA et al., 1999) enquanto que a TNF-Į estimulou a proliferação de células epiteliais normais de ratos (IP et al., 1992) e foi apontada como um importante regulador do desenvolvimento mamário estimulando a proliferação das células epiteliais e a morfogênese dos ductos mamários (SHEA-EATON, et al., 2001).
Os efeitos da suplementação com bST e dieta contendo níveis energéticos elevados a novilhas pré-púberes na expressão gênica de leptina e citocinas no parênquima mamário não foram estudados e essas moléculas podem estar envolvidas no desenvolvimento da glândula mamária, atuando tanto paracrinamente como autocrinamente no desenvolvimento parenquimal.
3. OBJETIVOS
O presente trabalho teve por objetivo geral traçar o perfil gênico da glândula mamária de novilhas leiteiras submetidos a dietas com níveis energéticos e protéico elevados e suplementadas com bST.
Objetivos específicos
a. para promover uma maior compreensão dos mecanismos moleculares de desenvolvimento mamário, identificar fatores de crescimento, hormônios, fatores da matriz extra-celular e outros tipos de moléculas que possam estar envolvidos no desenvolvimento parenquimal e proliferação de células epiteliais de animais submetidos a alimentação com dietas com níveis protéicos e energéticos elevados e suplementadas com bST.
b. sendo a leptina um dos fatores produzidos localmente e implicado anteriormente na proliferação de células mamárias, avaliar os efeitos da dieta elevada e da administração de bST na expressão gênica de leptina e seu receptor Ob-Rb no parênquima mamário.
4. METODOLOGIA APLICADA
Técnica de Expressão Gênica em Larga Escala: Microarranjos
O organismo é uma máquina bioquímica complexa capaz de produzir as mais diversas proteínas a partir de diferentes estímulos internos e externos. Para tanto, a informação gênica contida nos cromossomos (DNA), deve expressar-se em moléculas de RNA (transcrição), para finalmente traduzir-se em proteína. Uma vez que a exposição a diferentes fatores externos como nutrição, drogas, estresse, adaptação a ambientes, patógenos ou mudanças fisiológicas propriamente ditas (crescimento e desenvolvimento, diferentes fases da vida reprodutiva), pudesse levar o organismo a reagir adversamente. A análise da expressão gênica em uma determinada situação de interesse passou a ser um indicativo do potencial de uma célula em produzir a proteína codificada pelo gene diferencialmente expresso naquela determinada situação (BRAZMA et al., 2001).
enquanto que fluoróforos (Cy3 e Cy5) são utilizados na detecção de sinais no microarranjo (KOZIAN & KIRSCHBAUM; 1999).
Experimentos conduzidos utilizando-se a técnica de microarranjos combinam pelo menos cinco diferentes componentes: 1. o “chip” propriamente dito, que seria uma superfície especial de vidro ou silício, muito similar a uma lâmina de microscópio comum em sua conformação, com as mesmas dimensões da mesma; 2. a biblioteca de genes para a produção dos microarranjos através de impressão robotizada dos ácidos nucléicos ao chip; 3. a sonda, obtida através da preparação dos tecidos ou células que se deseja analisar pela extração de RNA, amplificação e produção de cDNA da amostra de RNA, ligação com os marcadores (Cy3 e Cy5) e combinação das duas amostras, para posterior hibridação da amostra no microarranjos; 4. o “scanner”, que lê os chips após hibridação da sonda com as seqüências contidas no chip, através de emissão de raios laser; 5. um programa de informática para quantificação e interpretação das imagens obtidas (BLOHM & GUISEPPI-ELIE, 2001) A Figura 04 representou-se as diferentes etapas da técnica de microarranjos.
Figura 04. Representação esquemática das diversas etapas compreendidas na realização da técnica de microarranjos (adaptado de DUGGAN, et al., 1999).
laser 2 clones de DNA
amplificação em PCR e purificação
tratamento
transcrição ligação com: Cy5 Cy3
Impressão
hibridização
laser 1
análise
computacional
controle
Fabricação do Chip
A produção dos arranjos teria início com a seleção dos transcritos a serem impressos. Em arranjos de cDNA poderiam ser utilizadas seqüências completas ou seqüências parciais de cDNA (também conhecidos como ESTs, “Expressed Sequence Tags”). A seleção poderia ser feita com base em dados contidos nos diversos bancos de dados como GenBank, dbEST, Unigene, entre outros, assim como nas diferentes bibliotecas de genes disponíveis (DUGGAN et al., 1999).
Os bancos de genes conteriam informações que nos permitiriam avaliar as seqüências existentes e assim criar a biblioteca mais adequada à pesquisa a ser realizada. Além disso, existiria no mercado diversas bibliotecas prontas para o uso que pudessem ser adquiridas, tanto em centros de pesquisa e ensino como comercialmente em centros especializados (BLOHM & GIUSEPPI-ELIE, 2001).
Os arranjos de cDNA seriam produzidos a partir da impressão robotizada dos produtos do PCR que em geral utilizariam clones, inteiros ou parciais, contendo de 600 a 3000 pares de bases. Esses arranjos poderiam conter desde algumas centenas até dezenas de milhares de seqüências de genes transcritos (DAHIA, 2002).
É comum, durante a realização de um ensaio de “microarray” perder-se um ou vários pontos de hibridação por diferentes motivos (bolhas que se formam ao colocar-se a sonda para hibridar, falhas na impressão dos clones e tantos outros erros que podem ocorrer nas diferentes fases do processo), nesses casos, quando da utilização de bibliotecas de alta densidade, contendo um grande número de ESTs com apenas umas repetição, perde-se a possibilidade de avaliar essa determinada seqüência, ou seja, o gene em questão na lâmina em análise.
Levando-se em consideração que a técnica de microarranjos seria bastante onerosa (cada ensaio custa por volta de 300 dólares), não se deveria realizar muitas repetições biológicas para cada tratamento avaliado e esse continuaria sendo um dos prováveis fatores de erros nas análises estatísticas finais do experimento (comunicações pessoais durante as reuniões realizadas com o objetivo de produção de um novo chip de microarranjos, Dept. of Animal Science, MSU, 2004).
Após a impressão e dependendo do caso, lavagem e secagem dos chips, os mesmos devem ser mantidos em lugares livres de luz até utilização. Algumas bibliotecas específicas, como por exemplo a “National Bovine Functional Genomics Consortium” (NBFGC), utilizada no presente trabalho, lava-se a lâmina no máximo 24 horas que precedem sua utilização.
Métodos Experimentais
Outra etapa importante na realização da técnica de microarranjos é a definição do melhor delineamento experimental a ser utilizado no experimento. Essa escolha deve obrigatoriamente ser realizada com o auxílio de pessoas especializadas na área de bioinformática e geneticistas.
injetada para hibridação foi sempre um conjunto de mRNA das duas amostras (YANG & SPEED, 2002).
Em uma descrição breve, os métodos que podem ser utilizados nos delineamentos experimentais de microarranjos são diretos ou seja, dentro de um mesmo arranjo ou indireto, comparando-se os resultados entre os diferentes arranjos.
No método indireto usa-se referências em cada um dos ensaios conduzidos. A referência escolhida pode ser universal, ou seja um “pool” de mRNA obtido de várias amostras de um tecido qualquer de vários indivíduos, ou de vários tecidos diferentes. Poderíamos optar também pela utilização de uma referência controle, por exemplo, quando se quisesse testar um tecido cancerígeno de vários pacientes diferentes deveria utilizar como referência um “pool” de mRNA do mesmo tecido de vários indivíduos não-portadores de câncer, um exemplo gráfico desse tipo de método foi demonstrado na Figura 05 (YANG & SPEED, 2002).
Figura 05. Representação gráfica do uso do delineamento experimental com referências. O gráfico “A” representa a utilização de uma referência controle enquanto que “B” representa a utilização de referência universal (adaptado de YANG & SPEED, 2002).
O método de comparação direta poderia ser muito bem ilustrado através do desenho de “dye-swap replication” no qual cada hibridação foi feita duas vezes, sendo o marcador utilizado no primeiro experimento, invertido no seguinte, isto é a amostra marcada com Cy3 em um determinado arranjo seria então marcada com Cy5 no próximo, nesse método não se utilizaria referências e cada tratamento passaria a ser ao
mesmo tempo “controle” e “tratamento” (KERR & CHURCHILL 2001), esse tipo de desenho é esquematizado na Figura 06 e foi o método utilizado pára realização dos experimentos de microarranjos no presente trabalho.
Figura 06. Representação gráfica da utilização do método de comparação direta “dye-swap replications”, no qual o marcador utilizado é invertido na Segunda hibridação (“a” e “b”). Em “b” um exemplo de desenho de “loop” utilizado (adaptado de YANG & SPEED, 2002).
Dentro desses dois métodos utilizados existem pequenas variações em função do número de tratamentos envolvidos e do desenho experimental utilizado (fatorial simples, fatorial 2X2, dentre outras). Revisões detalhadas do assunto podem ser obtidas em diversos jornais especializados (YANG & SPEED, 2002; CHURCHILL, 2002; CHUAQUI, et al., 2002).
Marcação das Amostras e Hibridação
As sondas utilizadas para hibridação em microarranjos seriam na realidade uma mistura das amostras de RNA de dois tratamentos (ou tratamento e controle) que se desejasse avaliar (DUGGAN et al, 1999).
Biosciences, http://www.bdbiosciences.com/) protocolos completos de marcação e preparação das amostras para hibridação.
Como em todas as fases de um ensaio de microarranjos, a extração do RNA do tecido ou células, é extremamente crítica para obtenção de boa hibridação e conseqüentemente bons resultados. Outro ponto limitante é a grande quantidade de RNA a ser utilizada. Na literatura encontra-se citações de utilização de 2 – 5 µg de RNA nas análises (DUGGAN et al., 1999), no entanto é comum utilizar-se até 10 µg de RNA por amostra (LEW et al., 2004).
A qualidade do RNA utilizado também é um fator limitante na hibridação, pode-se lançar mão da utilização de “kits” para extração de RNA que a facilitam e fornecem um maior rendimento da amostra (Ambion, Ribopure Kit). Além disso, há aparelhos para determinação de pureza do RNA, como o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), que elimina a necessidade de utilização de gel eletroforese. A Figura 07 representa as imagens obtidas nas análises de qualidade do RNA no Bioanalyzer 2100.
Após extração de RNA total, transcrição reversa, marcação das amostras com os fluoróforos, lavagem e posterior mistura, a sonda é então injetada na estação de hibridação de microarranjos (HybStation, Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) contendo a lâmina com o chip previamente preparado (Figura 08). A hibridação ocorre pela ligação de cDNA das sondas com seus cDNAs complementares presentes no chip. Após a hibridação que ocorre durante 18 horas, as lâminas são imediatamente lavadas, secas por centrifugação e escaneadas para leitura e posterior processamento das imagens.
Figura 08. Estação de hibridação de microarranjos. A direita pode-se notar detalhe da porta de injeção das amostras para hibridação (extraído de “HybStation User Manual”, GENOMICS SOLUTION, 2003)
Processamento das Imagens
A análise das imagens obtidas nos experimentos de microarranjos compreende quatro etapas fundamentais: 1. escaneamento das lâminas e obtenção das imagens propriamente dita através de um programa de informática especialmente desenvolvido para essa finalidade; 2. “gridding” (endereçamento) ou seja, gradear a imagem em linhas auxiliares com a finalidade de alinhar os pontos presentes; 3. segmentação, um processo no qual se diferencia os “pixels” dentro das regiões que contém os pontos
separando-a posteriormente em “foreground” (sinal verdadeiro) e “background” (imagem de fundo); e 4. extração da informação, essa análise dará informação sobre a intensidade do ponto e a intensidade do fundo, a primeira se refere ao cálculo do sinal de fluorescência do primeiro plano no processo de segmentação, enquanto que a segunda utiliza diferentes alogaritmos para estimar-se o sinal de fundo, uma vez que o mesmo se refere a hibridações não específicas que ocorreram na lâmina (http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/arraysoft_image.html#Definition).
Escaneamento: Após a hibridação competitiva entre as amostras estudadas, as lâminas foram escaneadas e as imagens obtidas através de um escaner que mediu a fluorescência de cada um dos marcadores (Cy3 e Cy5). A relação da intensidade de fluorescência em cada um dos pontos impressos indicou a abundância relativa da seqüência correspondente de DNA nas duas amostras analisadas (YANG et al., 2000).
Um dos métodos de aquisição de fluorescência é através do uso de um escaner projetado para essa finalidade. O escaner leu cada área da lâmina, e produziu para cada um dos marcadores uma imagem separada, criando para cada uma delas um mapa digital, contendo a intensidade de fluorescência de cada “pixel” (YANG et al., 2001).
Em geral, após esse escaneamento seriam obtidas duas imagens separadas do tipo 16-bit TIFF (tagged image file format). Os diferentes marcadores absorveriam e emitiriam luz em diferentes comprimentos de onda. No caso dos ensaios de microarranjos, geralmente, Cy3 seria examinado em comprimentos de luz que variaram de 510 – 550 nm, enquanto que Cy5 em 630 – 660 nm. Um escaner seqüencial realizaria a varredura separadamente em cada um dos comprimentos, enquanto que um escaner do tipo laser dual realizaria ambas as varreduras simultaneamente (SOILE, 1999).
Figura 09. Representação de uma das lâminas da biblioteca “National Bovine Functional Genomics Consortium” (NBFGC) utilizada no presente trabalho. No caso específico desta lâmina, os pontos vermelhos representam genes super-expressos na glândula mamária pela administração de bST, pontos verdes representam genes inibidos pelo bST e os pontos amarelos são genes igualmente expressos em animais recebendo ou não bST. Há uma gama de variação de cores entre o vermelho e o verde (LEW et al., 2004)
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Análise das imagens: Existem diversos programas de informática especializados nas análises de imagens de microarranjos (uma extensa lista pode ser encontrada em: http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/Definition). Os próprios programas ajustam o fundo e determinam em cada ponto a abundância de transcritos em cada uma das amostras utilizadas. A análise de imagens compreende basicamente três etapas: “gridding” (endereçamento), segmentação e extração das informações.
“Gridding”: A estrutura básica da imagem de cada uma das bibliotecas existentes é determinada e conhecida. A Figura 09 ilustra uma dessas estruturas. Nesse exemplo o arranjo (NBFGC) é formado por 4 colunas e 12 linhas e cada “grid” ou “patch” é formado por 20 linhas e 20 colunas de pontos, totalizando 400 pontos por “patch” e 19200 genes por arranjo. Existem informações no programa de leitura sobre cada um desses pontos (SUCHYTA et al., 2003). Assim, ao estabelecer o “gridding” e alinhamento dos pontos, informa-se ao software sobre a existência daquele gene específico (Figura 10).
Asegmentação da imagem poderia ser definida como a compartimentalização da imagem em diferentes regiões, cada uma delas com propriedades específicas (SOILE, 1999). Num experimento de microarranjos a segmentação nos permite classificar os “pixels” em primeiro plano (que corresponde ao ponto de interesse) e fundo, assim, pela diferença deles, a intensidade de fluorescência poderá ser calculada a abundância relativa dos transcritos no determinado ponto (YANG et al., 2000).
ressaltar que em um ensaio típico de microarranjos as lâminas geralmente apresentaram intensidade de fundo heterogênea, assim como tamanho e forma dos pontos, levando a certa dificuldade no alinhamento das mesmas.
Figura 10 Exemplo de “gridding” e alinhamento dos pontos em ensaio realizado com a biblioteca NBFGC. No exemplo acima, o método de segmentação utilizado é o de círculo fixo (figura extraída de anotações particulares durante a realização dos experimentos).
calcular-se as medidas de intensidade de primeiro plano e fundo e a qualidade dos pontos. A maior parte dos programas de análise definiriam a intensidade de primeiro plano baseado na média ou mediana dos valores de “pixel” dos pontos segmentados. Existiu uma variação maior no cálculo de fundo dentre os diversos programas, sendo mais comumente utilizado a tomada de valores a partir da média das regiões que circundariam os pontos (GENEPIX, 1999; SCANANALYZE, 1999; QUANTARRAY, 1999) (Figura 11).
Figura 11. Representação dos diferentes tipos de métodos de ajuste de fundo. A região dentro do círculo vermelho representa o “spot” enquanto que as regiões demarcadas pelas outras cores de linha representam os diferentes métodos utilizados para cálculo de fundo. A linha verde é a utilizada no “QUANTARRAY” (1999), a azul, no “SCANALYZE” (1999) e a pink representa a demarcação utilizada pelo método “SPOT” (BUCKLEY, 2000). (imagem extraída de YANG, et al, 2000).
Após o processamento das imagens, correção de fundo e normalização, um relatório final seria gerado, aonde os dados não processados representariam as intensidades dos pontos. Esse relatório seria compatível com softwares de análise estatística Microsoft Excel e SAS (2000).
Modelos In Vitro para Estudo do Desenvolvimento Mamário
Os sistemas de cultura in vitro tornaram-se extremamente importantes na pesquisa contemporânea pois ofereceriam um potencial de manipulação do crescimento e diferenciação de células em cultura através de estímulos hormonais e condições ambientais, permitindo avaliações de resultados encontrados em experimentos in vivo rapidamente e a um baixo custo. Além disso, a crescente preocupação da sociedade com a utilização de animais vivos em pesquisas estimulou o desenvolvimento de novos sistemas in vitro baseados em culturas celulares derivadas de tecido mamário, bem como de outros tecidos (MATITASHVILI et al., 1997).
No decorrer dos últimos anos diversos sistemas de cultura in vitro foram desenvolvidos com o intuito de prover melhores esclarecimentos da regulação do crescimento da glândula mamária e morfogênese durante os diferentes estágios fisiológicos e de desenvolvimento. Nesses estudos os efeitos da comunicação celular, inter-relação entre diferentes tipos celulares que compõem a glândula, influências do estroma no desenvolvimento mamário, hormônios e fatores de crescimento estimulantes e inibidores foram examinados (MATITASHVILI et al., 1997)
Dentre os diferentes métodos de cultura in vitro utilizados para estudos de desenvolvimento de glândula mamária em ruminantes destacam-se: 1. cultura de tecidos; 2. cultura de células primárias e; 3. cultura de linhagens de células imortalizadas.
Apesar de largamente utilizada em roedores, poucos pesquisadores obtiveram sucesso com cultura de tecidos em ruminantes (KEYS et al., 1994; SKARDA & URBANOVA, 1989; THOMAS et al., 1992).
permitindo um estudo muito similar ao realizado in vivo. No entanto, a interpretação dos resultados obtidos nesses estudos é complicada pois há possibilidade de infecção da cultura com elementos do próprio tecido; há dificuldade de determinação do tipo de célula que está sendo afetado por um determinado tratamento; há dificuldade de determinação do número de células, se um efeito mitogênico estiver sendo testado. Além disso outro fator limitante nesse tipo de estudo seria o tempo em que os tecidos puderam ser mantidos em cultura (MATITASHVILI et al., 1997).
MACKENZIE et al. (1982) desenvolveram métodos de isolamento e manutenção de células epiteliais mamárias em cultura, desde então, diversas pesquisas foram realizadas utilizando-se esse tipo de célula isoladas de bovinos (CIFRIAN et al., 1994; MCGRATH et al., 1991; TALHOUK et al., 1993). Células primárias foram empregadas largamente em estudos dos mecanismos moleculares da ação de diversos hormônios e fatores de crescimento (SHAMAY et al., 1988; WAKSMAN et al., 1991), diferenciação e proliferação celular (CIFRIAN et al., 1994; TALHOUK et al, 1993) entre outros.
Um dos maiores limites da cultura de células epiteliais mamárias primária foi que por estar contida em uma população heterogênea no tecido, durante o processo de isolamento poderia trazer consigo a presença de outras células consideradas como contaminantes da cultura, as células mesenquimais que representavam somente 10% da população (SHAMAY et al., 1988) e principalmente o crescimento de fibroblastos (MATITASHVILI et al., 1997). No entanto, o maior problema nesse tipo de cultura de células foi que após um número pequeno de ciclos celulares elas se diferenciaram e perderam suas características originais (MATITASHVILI et al., 1997).
Para obtenção de melhores respostas experimentais com esse tipo de células, seria necessário o desenvolvimento de complexos sistemas de cultura que se aproximasse melhor do ambiente natural da glândula mamária (MATITASHVILI et al., 1997).
Essas células mantiveram as características morfológicas das células mamárias epiteliais e seriam capazes de diferenciar-se além de secretar produtos relacionados ao leite (HUYNH et al., 1991). Essa linhagem de células vem sendo largamente utilizada principalmente com duas finalidades: 1. caracterização da participação de diferentes hormônios e fatores estimulantes e inibidores do crescimento na proliferação celular epitelial mamária e; 2. interação de bactérias patogênicas com as células epiteliais mamárias (MATITASHVILI et al., 1997).
Os principais problemas na utilização dessa linhagem de células e que podem levar a erros nas interpretações dos resultados experimentais são, em primeiro lugar que existe uma certa heterogeneidade entre os três diferentes subclones das linhas. Os mesmos teriam discrepâncias entre si em tamanho, padrões de crescimento e características citogenéticas (ZAVIZION et al., 1995). Além disso, o fator de crescimento epidérmico (EGF) afetou o crescimento e funções de células epiteliais mamárias (AKERS, 1990) e não teve efeito sobre a proliferação celular de MAC-T, mesmo quando combinado com a adição de IGF-1 (ROMAGNOLO et al., 1993; WOODWARD et al., 1994).
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CAPÍTULO 2 – EXPRESSÃO GÊNICA DO PARÊNQUIMA MAMÁRIO DE NOVILHAS LEITEIRAS SUPLEMENTADAS COM bST E ALIMENTADAS COM DIETAS
CONTENDO NÍVEIS PROTÉICOS E ENERGÉTICOS ALTOS
RESUMO - O desenvolvimento da glândula mamária é um processo complexo que envolve, além de fatores sistêmicos, a participação de inúmeros fatores localmente produzidos. O presente trabalho teve por objetivo examinar os efeitos da dieta e administração de bST na expressão gênica do parênquima mamário e identificar genes envolvidos no processo de mamogênese. O tecido utilizado foi coletado em um experimento prévio conduzido em 1994, em delineamento experimental de fatorial 2 X 2 (4 tratamentos, sendo, duas diferentes dietas, com ou sem administração de bST). Extraiu-se o RNA total de 32 amostras (8/tratamento) que foram combinadas (2 amostras/”pool”), antes de submetidas à transcrição reversa e marcação com Cy3 ou Cy5. Para realização dos microarranjos utilizou-se um delineamento experimental do tipo “loop”, em uma biblioteca de cDNA específica para bovinos (National Bovine Functional Genomics Consortium Library, NBFGC) contendo 18.263 seqüências (“ESTs”). Posteriormente validou-se os resultados com PCR em tempo real (RT-PCR). Obteve-se os níveis de significância dos genes diferencialmente expressos a partir de análise com modelo misto. A administração de bST alterou a expressão de 620 genes, enquanto que a dieta, afetou 463 genes, tendo os efeitos principais modificado um total de 1083 genes. Dentre os genes relacionados ao desenvolvimento parenquimal, 11,8% foram alterados pelo bST e 5,7% pela dieta. Como conclusão, a administração de bST aumenta a expressão de genes positivamente relacionados ao desenvolvimento parenquimal enquanto a dieta tem efeito menos acentuado nesses genes.
1. INTRODUÇÃO
O estabelecimento do potencial de produção de leite seria criticamente determinado durante a fase pré-púbere do desenvolvimento mamário (SEJRSEN & PURUP, 1997). Um processo complexo, envolvendo fatores ambientais (fotoperíodo e dieta), o sistema endócrino, além de inúmeros fatores produzidos localmente regulam o desenvolvimento e crescimento da glândula mamária (OKA & YOSHIMURA, 1986; FORSYTH, 1989).
Os efeitos nutricionais no desenvolvimento mamário têm sido amplamente estudados e sabe-se que a dieta exerceu um papel fundamental nesse processo. Diversos trabalhos mostraram que a alimentação com altos níveis energéticos durante a fase pré-púbere pode causar um efeito prejudicial no desenvolvimento mamário (GARDNER, 1977; AKERS et al., 2000), com posterior redução permanente na produção leiteira (SEJRSEN & PURUP, 1997). No entanto, RADCLIFF et al., (1997) estudando o desenvolvimento mamário de novilhas pré-púberes, não encontraram diferenças no desenvolvimento parenquimal quando da alimentação com dietas contendo níveis energéticos combinados com níveis protéicos elevados. Esse tratamento levou a um aumento na gordura extra parenquimal no úbere. Em trabalho subseqüente, animais recebendo esse tipo de dieta tiveram diminuição na produção leiteira de 14 % durante a primeira lactação, quando comparados a animais alimentados com uma dieta padrão (RADCLIFF et al., 2000). Esses resultados apontariam para um possível efeito carreador do acúmulo de gordura no desenvolvimento mamário, podendo esse apresentar-se em nível molecular.
Apesar de diversos experimentos terem sido conduzidos com o objetivo de esclarecer os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos no desenvolvimento da glândula mamária de animais submetidos a taxas de crescimento elevadas (STELWAGEN & GRIEVE, 1990; BUSKIRK et al., 1997) e administração de bST (WEBER et al., 1999; WEBER et al., 2000; BERRY et al., 2001) os processos envolvidos nesse sistema não foram totalmente esclarecidos. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de microarranjos tornou possível o exame concomitante de milhares de dezenas de genes diferencialmente expressos em diferentes situações A identificação de genes envolvidos no processo de mamogênese de novilhas submetidas a taxas de crescimento rápido e suplementação com bST pode levar a uma melhor compreensão dos fatores autócrinos e parácrinos relacionados a esse processo, permitindo que num futuro próximo seja adotadas técnicas de manejo mais apropriadas na fase de recria de novilhas leiteiras.
O presente trabalho teve por objetivo geral determinar os efeitos da administração de bST e da dieta com altos níveis energéticos e protéicos na expressão gênica no parênquima mamário de novilhas leiteiras e por objetivo específico identificar genes relacionados a mamogênese alterados por esses manejos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Animais Utilizados e Coleta de Tecidos
No grupo controle (LC) os animais receberam alimentação ad libitum com uma ração completa (Tabela 01), formulada para proporcionar ganho de 0,8 kg/dia. No segundo grupo (LB) os animais foram alimentados ad llibitum com a dieta controle e injetados diariamente com somatotropina bovina recombinante – bST (25 µg/kg de peso corporal, Pharmacia and Upjohn Inc., Kalamazoo, MI.; grupo LC + bST = LB). No terceiro grupo (HC = dieta elevada sem administração de bST), as novilhas foram alimentadas com uma ração completa contendo níveis energéticos e protéicos elevados formulada para ganho de peso de 1,2 kg/dia (Tabela 01). Por fim, o quarto grupo experimental (HB = dieta elevada e suplementados com bST) compreendeu animais alimentados com a dieta elevada e injetados diariamente via intra-muscular com bST (25 µg/kg de peso corporal). Os animais foram abatidos conforme atingissem a idade fisiológica correspondente a fase luteal inicial do 5o ciclo estral, ou seja em média 71 dias após o início da puberdade, tendo as novilhas dos grupos LC e LB atingido essa idade fisiológica aproximadamente 276 dias após o início do experimento com ganho de peso médio diário de aproximadamente 0,8 kg e as dos grupos HC e HB após 218 dias, com ganho de peso médio diário de 1,23 kg (RADCLIFF et al., 1997).
No presente trabalho, o grupo dieta controle “L” compreende os grupos dieta controle suplementados ou não com bST (L = LC + LB), enquanto que grupo dieta elevada “H”, refere-se as novilhas em dieta elevada, independente da administração de bST (H = HB + HC). No tocante aos efeitos do bST, dois grupos são considerados: grupo controle para bST “C”, que compreende animais que não receberam administração de bST, independentemente da dieta (C = LC + HC) e grupo “B”, que compreende animais recebendo bST em ambas as dietas (B = LB + HB).
