Neste estudo provou-se que o método utilizado é eficaz na distinção de microrganismos gram-positivos de gram-negativos dentro dos géneros de Staphylococcus e
Pseudomonas. Esta distinção permite que este método possa vir a ser utilizado em parceria
com o VITEK, uma vez que esta distinção é necessária para a escolha das cartas a utilizar neste método bioquímico. Devido à rapidez e facilidade de aquisição de espetros de contaminantes de fármacos pelo método espetroscópico em estudo, esta ferramenta poderia ser utilizada no laboratório de microbiologia como técnica de distinção de m.o. gram- positivos de gram-negativos. Este passo permitiria reduzir os custos do método atualmente em uso - ID Endosafe®-PTS ™ Gram - que requer cartuchos de identificação descartáveis.
A separação da P. aeruginosa das restantes amostras do mesmo género revelou-se coerente com os resultados do VITEK, apenas com a construção de modelos de PCA. Seria necessária a recolha de um maior número de amostras para poder avaliar os dados com maior detalhe num modelo supervisionado como o PLS-DA.
Em relação aos Staphycoccus, os resultados na sua maioria são coerentes com os resultados do VITEK. No caso do ascp05 foram necessárias três identificações no VITEK para perceber que a primeira identificação (por norma apenas existe uma identificação quando há crescimento bacteriano) não correspondia ao microrganismo correto, o isolado em questão seria uma S. warneri que foi imediatamente localizado no mapa de agrupamentos junto à classe dos S. warneri. Em relação aos nove microrganismos utilizados para testar o modelo PLS-DA construído, os resultados foram concordantes com os do VITEK, apenas porque excepcionalmente foram feitas três identificações por este método. Tal não acontece numa situação de rotina o que permite concluir que existem alguns erros associados a este método de identificação.
Durante a recolha de m.o., não foi possível detetar, na flora residente, estirpes do género Escherichia, por esse motivo, apenas foram utilizados m.o. padrão da espécie
Escherichia coli para a construção de modelos de PCA para distinção de bactérias gram-
negativas de gram-positivas.
No entanto, para que o FTIR-ATR pudesse ser implementado como um método alternativo ao VITEK, seria necessário construir modelos de PLS-DA com um maior número de amostras, tanto a nível de variabilidade de espécie como de amostras da mesma espécie. Para aumentar a robustez do modelo seria necessária a utilização de métodos como a sequenciação para identificação dos isolados puros. Para além disso seria necessário repetir
este procedimento para cada um dos géneros dos m.o. específicos que são alvo de pesquisa na análise microbiológica de medicamentos não-estéreis: Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, e bactérias gram-negativas tolerantes à bílis.
O método FTIR-ATR na identificação de m.o. revelou-se vantajoso para a discriminação de espécies do género Staphylococcus, sendo este método significativamente mais rápido e com um custo muito inferior ao do VITEK. Cada identificação no VITEK tem um preço de aproximadamente de 14€ (somente em consumíveis) e um tempo de identificação mínimo de 4 horas, enquanto que o custo de um espetro é aproximadamente de 1€ (somente em consumíveis) e o tempo de aquisição ronda os minutos, o que revela que este seja um método com potencial para a indústria farmacêutica.
Referências
1. World Health Organization. Good practices for pharmaceutical microbiology laboratories. 2010. 1–27.
2. U.S.Pharmacopea. Microbiological attributes of nonsterile pharmaceutical products. USP29. p. 2969.
3. EudraLex. The Rules Governing Medicinal Products in the European Union: Good Manufacturing Practice. 2011;4:1–9.
4. Kuligowski J, Quintás G, Herwig C, Lendl B. A rapid method for the differentiation of yeast cells grown under carbon and nitrogen-limited conditions by means of partial least squares discriminant analysis employing infrared micro-spectroscopic data of entire yeast cells. Talanta. 2012;99:566–73.
5. Quintelas C, Mesquita DP, Lopes JA, Ferreira EC, Sousa C. Near-infrared spectroscopy for the detection and quantification of bacterial contaminations in pharmaceutical products. Int J Pharm. 2015;492(1):199–206.
6. INFARMED. Controlo Laboratorial [Internet]. [citado 1 de Novembro de 2016]. Obtido de: http://www.infarmed.pt/portal/page/portal/infarmed/monitorizacao_do_mercado/comprovacao _da_qualidade/controlo_laboratorial
7. European Pharmacopea. Edition 9th, Council of Europe. 2017.
8. Ratajczak M, Kubicka MM, Kamińska D, Sawicka P, Długaszewska J. Microbiological quality of non-sterile pharmaceutical products. Saudi Pharm J. 2015;23(3):303–7.
9. Inspection Guides - Microbiological Pharmaceutical Quality Control Labs (7/93). Office of Regulatory Affairs. 2016
10. Mugoyela V, Mwambete KD. Microbial contamination of nonsterile pharmaceuticals in public hospital settings. Ther Clin Risk Manag. 2010;6:443–8.
11. Fraser S.L. Enterococcal Infections: Background, Pathophysiology, Epidemiology. Medscape. 2016.
12. Marcus J. Zervos MD, Joseph W. Chow MD, Anne Chen MD, Robert R. Muder MD. Enterococcus species. 2010.
13. Lim JY, Yoon J, Hovde CJ. A brief overview of Escherichia coli O157:H7 and its plasmid O157. J Microbiol Biotechnol. 2010;20(1):5–14.
14. Johnson JR, Kuskowski MA, Menard M, Gajewski A, Xercavins M, Garau J. Similarity between Human and Chicken Escherichia coli Isolates in Relation to Ciprofloxacin Resistance
Status. J Infect Dis. 2006;194(1):71–8.
15. Perfeito L, Fernandes L, Mota C, Gordo I. Adaptive Mutations in Bacteria: High Rate and Small Effects. Science (80- ). 2007;317(5839):813–5.
16. Kaper JB, Nataro JP, Mobley HLT. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol. Fevereiro de 2004;2(2):123–40.
17. Su L-H, Chiu C-H. Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature. Chang Gung Med J. 30(3):210–9.
18. Porwollik S, Boyd EF, Choy C, Cheng P, Florea L, Proctor E, et al. Characterization of Salmonella enterica subspecies I genovars by use of microarrays. J Bacteriol. American Society for Microbiology (ASM); 2004;186(17):5883–98.
19. Ralph A. G. Medical Microbiology. Em: Musher DM, editor. Medical Microbiology. 4.a ed.
University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
20. Threlfall EJ. Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food- and water-borne infections. FEMS Microbiol Rev. 2002;26(2):141–8.
21. Iglewski BH. Pseudomonas. Medical Microbiology. University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
22. Selina SC. Pseudomonas Infection: Background, Pathophysiology, Epidemiology [Internet].
2016 [citado 20 de Novembro de 2016]. Obtido de:
http://emedicine.medscape.com/article/970904-overview#showall
23. Becker K, Eiff C. Staphylococcus, Micrococcus, and Other Catalase-Positive Cocci. Bacteriology. 2009. 308–30.
24. Över U, Tüç Y, Söyletir G. Catalase-negative Staphylococcus aureus: a rare isolate of human infection. Eur Soc Clin Infect Dis. 2000;6:681–2.
25. Schleifer KH, Kloos WE. Isolation and characterization of staphylococci from human skin. I. Amended descriptions of Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus and descriptions of three new species: Staphylococcus cohnii, Staphylococcus haemolyticus, and . IntJSystBacteriol. 1975;25(1):50–61.
26. Polgreen PM, Herwaldt LA. Staphylococcus aureus colonization and nosocomial infections: Implications for prevention. Curr Infect Dis Rep. 2004;6(6):435–41.
27. Chow JW. Staphylococcus aureus Nasal Carriage in Hemodialysis Patients. Arch Intern Med. 1989;149(6):1258.
Infect Dis. 2008;8(5):289–301.
29. Archer GL. Staphylococcus aureus : A Well-Armed Pathogen. Clin Infect Dis. 1998;26:1179– 81.
30. Kloos WE, Schleifer KH. Simplified Scheme for Routine Identification of Human Staphylococcus Speciesg. J Clin Microbiol. 1975;1(1):82–8.
31. Rupp ME, Soper DE, Archer ’ GL. Colonization of the Female Genital Tract with Staphylococcus saprophyticus. J Clin Microbiol. 1992;30(11):2975–9.
32. Bieber L, Kahlmeter G. Staphylococcus lugdunensis in several niches of the normal skin flora. Clin Microbiol Infect. 2010;16(4):385–8.
33. Hidron AI, Edwards JR, Patel J, Horan TC, Sievert DM, Pollock DA, et al. Antimicrobial‐ Resistant Pathogens Associated With Healthcare‐Associated Infections: Annual Summary of Data Reported to the National Healthcare Safety Network at the Centers for Disease Control and Prevention, 2006–2007 •. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008;29(11):996–1011.
34. Preisner O, Guiomar R, Machado J, Menezes JC, Lopes JA. Application of fourier transform infrared spectroscopy and chemometrics for differentiation of salmonella enterica serovar enteritidis phage types. Appl Environ Microbiol. 2010;76(11):3538–44.
35. Becker K, Harmsen D, Mellmann A, Meier C, Schumann P, Peters G, et al. Development and Evaluation of a Quality-Controlled Ribosomal Sequence Database for 16S Ribosomal DNA- Based Identification of Staphylococcus Species Development and Evaluation of a Quality- Controlled Ribosomal Sequence Database for 16S Ribosomal DNA-Based. J Clin Microbiol. 2004;42(11):4988–95.
36. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med. 2002;8(6):257–60.
37. Barghouthi SA. A universal method for the identification of bacteria based on general PCR primers. Indian J Microbiol. Springer; 2011;51(4):430–44.
38. Woods DF, Reen FJ, Gilroy D, Buckley J, Frye JG, Boyd EF. Rapid Multiplex PCR and Real- Time TaqMan PCR Assays for Detection of Salmonella enterica and the Highly Virulent Serovars Choleraesuis and Paratyphi C. J Clin Microbiol. 2008;46(12):4018–22.
39. BioMérieux. API® / ID 32 - A referência - bioMérieux Portugal, Lda. [Internet]. Obtido de: http://www.biomerieux.pt/servlet/srt/bio/portugal/dynPage?open=PTG_IND_BPA_PRD&doc= PTG_IND_BPA_PRD_G_PRD_NDY_9&pubparams.sform=2&lang=pt
40. Juang D-F, Morgan JM. The applicability of the API 20E and API Rapid NFT systems for the identification of bacteria from activated sludge. EJB Electron J Biotechnol. 2001;4(1):717–
3458.
41. BioMerieux. VITEK® 2 Compact | bioMérieux Industry website [Internet]. p. 1. BioMerieux. VITEK® 2 Compact | bioMérieux Indus. Obtido de: http://www.biomerieux- industry.com/cosmetics/vitekr-2-compact
42. Pincus dh. Microbial identification using the biomérieux VITEK ® 2 SYSTEM VITEK 2 and VITEK 2 XL. :1–32.
43. BioMérieux. MALDI-TOF Mass Spectrometry | bioMérieux Corporate Website [Internet]. Obtido de: http://www.biomerieux.com/en/maldi-tof-mass-spectrometry
44. Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti J-L, et al. MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin Biochem. 2011;44(1):104–9.
45. Jarvis RM, Goodacre R. Discrimination of Bacteria Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Anal Chem. 2004;76(1):40–7.
46. Hamasha KM. Raman spectroscopy for the microbiological characterization and identification of medically relevant bacteria. 2011.
47. Kaiser optical systems inc. Raman Spectroscopy - A Tutorial [Internet]. [citado 26 de Outubro de 2016]. Obtido de: http://www.kosi.com/na_en/products/raman-spectroscopy/raman- technical-resources/raman-tutorial.php
48. Instruments P. Raman Spectroscopy Basics - Application Note. :1–5.
49. Schmid T, Sebesta A, Stadler J, Opilik L, Balabin RM, Zenobi R. Tip-enhanced Raman spectroscopy and related techniques in studies of biological materials. Em: Dubowski JJ, Geohegan DB, Träger F. 2010.
50. Ilharco LM, Garcia AR, Lopes LMF, Brito de Barros R, Júlio MF, Morais J. Espectroscopia: Para além do que os nossos olhos vêem. Ingenium. 2015;147:42–3.
51. Ilharco LM. Espectroscopia de Infravermelho uma Técnica Antiga, Sempre Actual. 1998. 34- 45.
52. Davis R, Mauer LJ. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy: a rapid tool for detection and analysis of foodborne pathogenic bacteria. Curr Res Technol Educ Top. 2010;2(1):1582– 94.
53. Bellisola G, Sorio C. Infrared spectroscopy and microscopy in cancer research and diagnosis. Am J Cancer Res. e-Century Publishing Corporation; 2012;2(1):1–21.
spectroscopy and chemometrics to discriminate clinical isolates of bacteria of the Burkholderia cepacia complex from different species and ribopatterns. Anal Bioanal Chem. 2009; 394(8):2161–71.
55. Irudayaraj J, Yang H, Sakhamuri S. Differentiation and detection of microorganisms using fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy. J Mol Struct. 2002;606(1–3):181–8.
56. PerkinElmer. FT-IR Spectroscopy ATR. [Internet]. [citado 13 de Outubro de 2016] Obtido de: https://shop.perkinelmer.com/Content/technicalinfo/tch_atraccessories .
57. Atitar MF, Belhadj H, Dillert R, Bahnem DW. The Relevance of ATR-FTIR Spectroscopy in Semiconductor Photocatalysis. Em: Emerging Pollutants in the Environment - Current and Further Implications. InTech; 2015; 202-227.
58. Sousa C, Grosso F, Meirinhos-Soares L, Peixe L, Lopes J. Identification of carbapenem- resistant Acinetobacter baumannii clones using infrared spectroscopy. J Biophotonics. 2014;7(5):287–94.
59. Carlos C, Maretto DA, Poppi RJ, Sato MIZ, Ottoboni LMM. Fourier transform infrared microspectroscopy as a bacterial source tracking tool to discriminate fecal E. coli strains. Microchem J. 2011;99(1):15–9.
60. Naumann D. Infrared and NIR Raman spectroscopy in medical microbiology. Mantsch HH, Jackson M. 1998
61. Naumann D. Infrared Spectroscopy in Microbiology. Encycl Anal Chem. 2000;102–31. 62. Ngo-Thi NA, Kirschner C, Naumann D. Characterization and identification of microorganisms
by FT-IR microspectrometry. J Mol Struct. 2003;661–662(1–3):371–80.
63. Miranda M. Aplicação de Espectroscopia de FT-IR para a Serotipagem e Avaliação da Susceptibilidade à Penicilina em Streptococcus pneumoniae. 2008.
64. Kardas M, Gozen AG, Severcan F. FTIR spectroscopy offers hints towards widespread molecular changes in cobalt-acclimated freshwater bacteria. Aquat Toxicol. 2014;155; 15–23. 65. Lavine B, Workman J. Chemometrics. Anal Chem. 2008;80(12):4519–31.
66. Difoggio R. Guidelines for Applying Chemometrics to Spectra: Feasibility and Error Propagation. Appl Spectrosc Vol 54, Issue 3, pp 94A-113A. Society for Applied Spectroscopy; 2000;54(3):94A–113A.
67. Goodacre R. Explanatory analysis of spectroscopic data using machine learning of simple, interpretable rules. Vib Spectrosc. 2003;32:33–45.
2002. 348.
69. Varmuza K, Filzmoser P. Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics. CRC Press. 2009. 35-37.
70. Osborne BG, Osborne, G. B. Near-Infrared Spectroscopy in Food Analysis. Encyclopedia of Analytical Chemistry. 2000.
71. Eigenvector. Advanced Preprocessing: Sample Normalization - Eigenvector Documentation Wiki [Internet]. [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de: http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Advanced_Preprocessing:_Sample_Normalization #SNV_.28Standard_Normal_Variate.29
72. Naes T, Isaksson T, Fearn T, Davies T. A user friendly guide to Multivariate Calibration and Classification. NIR Publications. 2002.
73. Wise BM, Gallagher NB, Bro R, Shaver JM, Windig W, Koch RS. PLS_Toolbox Version 4.0 for use with MATLAB TM. 2006. 1-414 .
74. European Pharmacopeia. Chemometric methods applied to analytical data. Edition 9th, Council of Europe. 2017.
75. Worley B, Halouska S, Powers R. Utilities for quantifying separation in PCA/PLS-DA scores plots. Anal Biochem. 2013;433(2):102–4.
76. Eigenvector. PLSDA [Internet]. 2016 [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de: http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Plsda
77. CAMO Software AS. PLS-DA [Internet]. 2016 [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de: http://www.camo.com/resources/pls-da.html
78. Gromski PS, Muhamadali H, Ellis DI, Xu Y, Correa E, Turner ML, et al. Metabolomics and partial least squares-discriminant analysis - a marriage of convenience or a shotgun wedding. Anal Chim Acta. 2015;879:10–23.
79. Wenning M, Scherer S. Identification of microorganisms by FTIR spectroscopy : perspectives and limitations of the method. Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97:7111–20.
80. Lamprell H, Mazerolles G, Kodjo A, Chamba JF, Noël Y, Beuvier E. Discrimination of Staphylococcus aureus strains from different species of Staphylococcus using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Int J Food Microbiol. 2006;108(1):125–9.
81. Sousa C, Silva L, Grosso F, Lopes J, Peixe L. Development of a FTIR-ATR based model for typing clinically relevant Acinetobacter baumannii clones belonging to ST98, ST103, ST208 and ST218. J Photochem Photobiol B Biol. 2014;133:108–14.
82. Oust Janbu A, Møretrø T, Bertrand D, Kohler A. FT-IR microspectroscopy: a promising method for the rapid identification of Listeria species. Fed Eur Microbiol Soc. 2007;278:164– 70.
83. Amiali NM, Golding GR, Sedman J, Simor AE, Ismail AA. Rapid identification of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Fourier transform infrared spectroscopy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011;70(2):157–66.
84. Bosch A, Golowczyc MA, Abraham AG, Garrote GL, De Antoni GL, Yantorno O. Rapid discrimination of lactobacilli isolated from kefir grains by FT-IR spectroscopy. Int J Food Microbiol. 2006;111(3):280–7.
85. Bounphanmy S, Thammathaworn S, Thanee N, Pirapathrungsuriya K, Beardall J, McNaughton D, et al. Discrimination of cyanobacterial strains isolated from saline soils in Nakhon Ratchasima, Thailand using attenuated total reflectance FTIR spectroscopy. J Biophotonics. 2010;3(8–9):534–41.
86. Garon D, El Kaddoumi A, Carayon A, Amiel C. FT-IR Spectroscopy for Rapid Differentiation of Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus and Characterization of Aflatoxigenic Isolates Collected from Agricultural Environments. Mycopathologia. 2010;170(2):131–42.
87. Grunert T, Wenning M, Barbagelata MS, Fricker M, Sordelli DO, Buzzola FR, et al. Rapid and Reliable Identification of Staphylococcus aureus Capsular Serotypes by Means of Artificial Neural Network-Assisted Fourier Transform Infrared Spectroscopy. J Clin Microbiol. 2013;51(7):2261–6.
88. Kuhm AE, Suter D, Felleisen R, Rau J. Identification of Yersinia enterocolitica at the species and subspecies levels by Fourier transform infrared spectroscopy. Appl Environ Microbiol. American Society for Microbiology. 2009;75(18):5809–13.
89. Al-Holy MA, Lin M, Al-Qadiri H, Cavinato AG, Rasco BA. Classification of foodborne pathogens by fourier transform infrared spectroscopy and pattern recognition techniques. J Rapid Methods Autom Microbiol. 2006;14(2):189–200.
90. Biomérieux. BioBall® - Amostras de referência precisas para controlo de qualidade quantitativo [Internet]. [citado 26 de Novembro de 2016]. Obtido de: http://www.biomerieux.pt/servlet/srt/bio/portugal/dynPage?open=PTG_IND_BPA_PRD&doc= PTG_IND_BPA_PRD_G_PRD_NDY_13&crptprm=ZmlsdGVyPQ==
91. Kaufman L, Rousseeuw PJ. Finding Groups in Data: An Introduction to Cluster Analysis. Wiley-Interscience. 2005. 368.
de Dezembro de 2016]. Obtido de: http://wiki.eigenvector.com/index.php?title=Using_Cross- Validation#Contiguous_Blocks
93. Sousa C, Novais Â, Magalhães A, Lopes J, Peixe L. Diverse high-risk B2 and D Escherichia coli clones depicted by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Sci Rep. 2013;3:3278. 94. Davis R, Mauer L. Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy: a rapid tool for detection
and analysis of foodborne pathogenic bacteria. Curr Res Technol Educ Top. 2010;(1):1582–94. 95. Ghebremedhin B, Layer F, König W, König B. Genetic classification and distinguishing of Staphylococcus species based on different partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf gene sequences. J Clin Microbiol. 2008;46(3):1019–25.
96. Solberg R, Escobar J, Arduini A, Torres-Cuevas I, Lahoz A, Sastre J, et al. Metabolomic Analysis of the Effect of Postnatal Hypoxia on the Retina in a Newly Born Piglet Model. Bundy JG, editor. PLoS One. Public Library of Science. 2013;8(6):66540.
97. Cohen NR, Lobritz MA, Collins JJ. Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell Host Microbe. NIH Public Access. 2013;13(6):632–42.
Anexos
Anexo 1: Diferenciação das espécies de Staphylococcus através das suas características