Os experimentos realizados empregando a técnica de eletroforese mostraram a atividade de interação/clivagem do complexo com o DNA, somente quando irradiado e dependente da concentração dos complexos utilizados. Convém mencionar que para o complexo com NO o efeito é bastante evidente, enquanto que o complexo aquo aparentemente há indício de simples interação, sem clara definição quanto a clivagem. Os testes de reatividade com peróxido de hidrogênio, também mostraram efeitos de clivagem de DNA, e quando fora combinado com irradiação de luz observou- se, o aceleramento da clivagem do DNA, possivelmente devido à geração de radicais livres. Isso pode ter curiosas implicações devido a geração de peróxido de hidrogênio em células de defesa ou mesmo o uso conjunto de peróxido e complexo.
A utilização de inibidores mostra que existe atividade de clivagem na presença dos complexos influenciada pela geração de radicais livres, para o complexo A a adição dos inibidores preveniu a formação da forma FII, na presença de catalase, histidina, SOD e TEMPO, sugerindo que a geração de superóxido, oxigênio singlete e a presença de carbono e metalo-centrado, estão influenciando na clivagem do DNA. Em relação ao complexo B a presença de catalase e histidina inibiu a formação da FII, indicando que a geração de superóxido e oxigênio singlete, podem está influenciando e alterando a conformação do DNA. Baseando-se nessas informações podemos sugerir que o possível mecanismo de interação que está ocorrendo entre os complexos A e B e o DNA é oxidativo, devido a identificação de espécies
oxidativas através da utilização dos inibidores de radicais78.
Para identificar se a interação entre os complexos é eletrostática ou por intercalação, foi realizado o estudo de eletroforese com adição de NaCl, para o complexo A observou-se que há dependência com a concentração de NaCl que diretamente influência na atividade do complexo na interação/clivagem do DNA. Para o complexo B, a adição de NaCl mostrou ainda maior interferência na atividade do complexo, sugerindo que ocorre interação eletrostática entre o DNA e o complexo. Dessa forma, pode-se sugerir que os dois complexos em estudo fazem interações eletrostáticas com o DNA.
A utilização dos intercalantes de sulco maior (M) e sulco menor (H) sugeriu o possível sítio de ligação do complexo ao DNA. Em relação ao complexo A não é possível afirmar se houve verdadeira interação no sulco menor, somente confirmado no sulco maior. Para o complexo B não parece haver seletividade entre o sulco maior e menor, indicando que a interação pode ocorrer pelos dois sítios.
Os testes de espectrofotometria apresentaram resultados relevantes devido à adição do complexo e DNA e posterior irradiação, foram verificadas mudanças espectrais do complexo, sugerindo que a redução da banda em 323nm e surgimento da banda em 454nm, que é banda referente ao surgimento do aqua-complexo, seja uma banda de transferência de carga do metal para o ligante e devido à irradiação ocorre a liberação do NO, entretanto a mudança espectral observada para o complexo A devido a adição do DNA ocorre na mesma região que é identificada a banda referente ao DNA em 260nm.
A utilização da coluna de exclusão associado a técnica de espectrofotometria, indicaram fortemente a presença do complexo associado ao DNA sugerindo que está ocorrendo interação com o complexo A quando irradiado por 2h, sendo também observado quando o complexo A está na presença de glutationa, o mesmo foi observado no experimento de eletroforese, onde na menor concentração ocorreu a inibição da clivagem do complexo A na presença de glutationa, mas com o aumento da concentração observou-se até a formação da FIII, indicando a interação do complexo com o DNA, para o complexo B também foi observada clivagem e formação da FIII. O surgimento da banda em 480 nm antes do isolamento na coluna de exclusão
pode indicar a interação do complexo com o DNA113. Para o complexo B o
deslocamento da banda característica do complexo de 454nm na ausência de DNA, para 420nm na presença de DNA, indica possível interação do complexo com o DNA, esse deslocamento da banda característica do complexo foi observado na amostra antes do isolamento na coluna de exclusão.
A determinação das constantes de ligação dos complexos A e B mostraram interação dos complexos com o DNA, os valores para o complexo
entretando apresentou valores mais elevado que o complexo [Ru(bpy)3] 2+ que
é conhecido por interagir eletrostaticamente com o DNA129.
Foram realizados experimentos de viscosimetria que indicaram que está ocorrendo interação eletrostática entre os complexos, pois o comportamento
apresentado foi análogo ao demostrado pelo complexo [Ru(bpy)3] 2+, sendo que
ofereceu comportamento mais elevado, o que é justificado pela constante de ligação, que para ambos os complexos A e B apresentou valores mais
elevados, que para o complexo citado na literatura130.
Outro mecanismo utilizado para identificar interação dos complexos, foi a realização da Microscopia de força atômica (MFA), que comparados com o controle, mostrou que os complexos A e B provocaram alteração na conformação do DNA, indicando interação dos complexos com o DNA. No entanto, a imagem referente ao complexo B mostrou maior alteração na conformação do DNA, provocando aglomeração. Para o complexo A, verificamos menor interação com o DNA, nos experimentos anteriormente citados foi verificada maior interação ou clivagem do DNA pelo complexo, entretanto a interação diferença obtido pode ser devido os complexos terem modos de interação diferente entre o DNA e o complexo.
A técnica de RPE, sensível a geração de radicais livres, foi aplicada ao complexo A, para confirmar a possível geração desses radicais pelo complexo, foi observado alteração no sinal emitido pelo complexo que confirma a produção desses radicais. Esse procedimento também permite identificar o sinal que indica a presença do radical livre formado, com isso podemos sugerir que a possível natureza do radical, certamente deve ser baseada em oxigênio, portanto possivelmente a geração de radicais hidroxila ou espécies radicalares de oxigênio, podem ser responsáveis pela origem desses radicais gerados, dessa forma justificando a clivagem observada mesmo sem luz.
O complexo A vem sendo investigado em diversos contextos terapêuticos seja como antiparasíticos a neuroprotetor o que exige maiores estudos de reatividade frente a biomoléculas que tal espécie deverá encontrar, aqui podemos concluir que sem fotoativação esse composto não deve provocar dano ao DNA apesar de interagir moderadamente com o DNA. Todavia, o emprego de luz gera uma interessante capacidade de clivar cadeias de DNA o
que está associado possivelmente a geração de radicais livres do tipo superóxido e oxigênio singlete.
Curiosamente há uma dependência nessa clivagem com a presença da molécula do NO coordenado, sem o mesmo não foi observado fotoclivagem, entretanto não temos evidência do papel direto do NO nessa clivagem, que merece posteriores estudos. O uso de peróxido de hidrogênio capacitou ambos os complexos mesmo na ausência de luz, a clivarem DNA, sendo o complexo com NO ainda mais efetivo quando irradiado. Essa poderia ser uma interessante estratégia de terapia ou ação microbicida que poderá ser investigada a posteriori, particularmente para Chagas cujo complexo A mostrou-se bastante promissor.
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