Eletroforese em gel de Agarose

A eletroforese em gel de agarose consiste no método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples, rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros métodos, tais como centrifugação

com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação87_{. A}

localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente pelo emprego do corante seletivo.

As bandas no gel são marcadas principalmente por brometo de etídio em baixa concentração, que fluoresce ao se intercalar na dupla fita do DNA. No entanto, a adição prévia de brometo de etídio no gel, causa o retardamento da corrida, sendo necessária a utilização de um fator de correção para calcular a quantidade total de DNA na corrida, já que a forma I (superenovelada) tem sua

mobilidade reduzida devido a adição do intercalante88_.

Concentrações de até 1 ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel empregando luz ultravioleta dependendo do agente intercalante,

no caso deste trabalho preferiu-se usar o GelRed™, ao invés do brometo de

etídio por ser mais sensível a traços de DNA e bem menos tóxico ou mutagênico. Para que a molécula de DNA seja analisada através desse método é necessário que ela seja exposta a um campo elétrico, onde migrará para o eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula.

A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio (ZE = vf). Portanto, uma mistura de moléculas diferentes pode ser separada eletroforeticamente com base no tamanho da molécula, forma ou conformação da molécula e magnitude das cargas elétricas líquida na molécula. Ao serem aplicadas na mesma posição num campo elétrico, as moléculas serão separadas em bandas e migrarão a

velocidades diferentes para posições diferentes no meio89_.

Sob condições fisiológicas, os grupos fosfatos dos ácidos nucléicos encontram-se ionizados. Cadeias de polinucleotídeos de DNA e RNA são chamadas de poliânions e migram para o eletrodo positivo (ânodo) quando colocados em campo elétrico. Devido à natureza repetitiva dos fosfatos, o DNA dupla fita possuem aproximadamente a mesma relação de massa e carga líquida. A viscosidade aparente do meio pode ser determinada pelo tamanho

dos poros do meio através da concentração de agarose empregada89_.

A agarose é um polissacarídeo extraído de certos gêneros de algas vermelhas do gênero Rhodophyceae. Este polissacarídeo consiste na repetição do dissacarídeo formado entre os resíduos de β-D-galactose (ligado pelas

posições 1,3) e 3,6-anidro-α-L-galactose (ligado pelas posições 1,4), como

representado na Figura 10 (A). Quando dissolvida em água fervente e depois resfriada, forma um gel com o aspecto representado na Figura 10 (B).

A composição do gel é formada por duplas hélices que se unem lateralmente para formar filamentos relativamente finos, formando, assim, poros. Os tamanhos dos poros variam de acordo com a concentração do gel, ou seja, quanto mais concentrado o gel agarose, menor o tamanho dos poros. Essa característica permite determinar o tamanho das moléculas de DNA com a concentração do gel de agarose, de forma que se consiga uma separação eficiente.

Figura 10. Estrutura da agarose. (A) Estrutura química da unidade de repetição da

agarose; (B) Malha formada pelo gel polimerizado90_.

Fonte: F. M. Ausubel, Short protocols in molecular biology : a compendium of methods

from Current protocols in molecular biology, Wiley, New York, 2002, p. 1512.

No entanto, não só o tamanho da molécula de DNA é importante na separação num gel de agarose, mas também a forma desta molécula. O DNA plasmidial pode se apresentar em três formas distintas e designadas como F I,

F II e F III. Quando intacta a forma (FI) apresenta-se tensionada sendo

designada como superenovelada, quando sofre quebra em uma das fitas é chamada circular aberta (FII), estando clivada em um único ponto, no entanto, quando ocorre a quebra em uma das fitas ou quebra em duas fitas simples, a

forma será designada como fita linear (FIII) o plasmídeo foi linearizado62_.

Apesar destas formas de DNA possuirem o mesmo tamanho, migram com velocidades diferentes quando submetidas a uma diferença de potencial devido sua distinta conformação ou compactação.

A preparação dos géis de agarose foi feita a partir da completa dissolução, sob aquecimento em forno de microondas, da quantidade necessária de agarose para um gel com concentração de 0,8 % (m/v), em

tampão TAE 1X (Tris 89 mM, ácido acético 89 mM, EDTA 2 mM – pH 8,0 ) ou

TBE 1X (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM _{– pH 8,0 ).}

A mistura gelificante ainda quente aproximadamente 50ºC, foi despejada

no molde da cuba eletroforetica (modelo Sub-Cell® _{GT, BioRad) e inserido o}

pente gerador dos poços, a cuba foi deixada em repouso para total solidificação por aproximadamente 30 min à temperatura ambiente, em seguida a cuba foi colocada por mais 1h em refrigerador para melhorar e garantir a solidificação. Em seguida foi retirado o pente gerador dos poços e adicionado o

(A) (B)

Tampão TAE ou TBE na cuba. O tampão utilizado na preparação do gel deverá

ser o mesmo que será adicionado na cuba eletroforética91_.

As amostras foram preparadas conforme descrito na literatura91_{. Foram}

aplicados cuidadosamente _{12 μL de cada amostra nos poços do gel, Figura 11,}

em seguida foi aplicado uma tensão constante de 70V por aproximadamente 1 hora, ou até que a frente de migração do Loading Buffer atingisse o final do gel. Para esses experimentos foi utilizada a fonte de corrente contínua Apelex modelo PS 305.

Figura 11. Cuba de eletroforese.

Fonte: www.bio-rad.com/en-us/product/wide-mini-sub-cell-gt-cell acessado em 10/10/2013.

As imagens dos géis foram registradas utilizando um sistema de fotodocumentação eletrônico e as frações de cada forma de DNA foi quantificada por densitometria (Figura 12) utilizando o Software Quantity One 4.6.9 Basic (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Em todos os ensaios empregou-se um ou mais controles negativos, essas amostras são submetidas às mesmas condições das amostras sob análise, porém sem adição do complexo metálico. Figura 12. Imagem do equipamento de fotodocumentação (A) Gel de Agarose após

eletroforese (B).