Considerações gerais sobre óleos essenciais

Os óleos essenciais (OEs), também conhecidos como óleos voláteis ou óleos éteros, são extraídos de plantas aromáticas geralmente encontradas em países de clima temperado e tropical (BAKKALI et al., 2008). São produtos de origem natural, com misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, com aroma acentuado e líquido, podendo ser obtidos de todas as partes das plantas, como botões, flores, folhas, caules, ramos, sementes, frutos, raízes ou cascas (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012; BAKKALI et al., 2008).

Em temperatura ambiente apresentam-se como substância líquida oleosa e bastante volátil, sendo esta última, a particularidade que o diferencia de óleos fixos, mistura de substâncias lipídicas obtidos geralmente de sementes (SIMÕES; SPITZER, 2004).

Os OEs são produtos naturais produzidos como metabólitos secundários de plantas aromáticas. São constituídos, principalmente, por compostos terpênicos, cuja origem biossintética ocorre a partir de unidades do isopreno que, por sua vez, origina-se a partir do ácido mevalônico (BAKKALI et al., 2008).

Estes óleos são misturas complexas naturais que podem conter de 20 a 60 componentes diferentes e normalmente, ocorre a predominância de dois ou três componentes em maiores concentrações (BAKKALI et al., 2008). Os compostos terpênicos majoritários nos OEs são os monoterpenos (cerca de 90% dos OEs) (DE SOUSA, 2011; MACHADO; FERNANDES JUNIOR, 2011). Apresentam duas unidades isoprênicas e 10 átomos de carbono, e os sesquiterpenos, com três unidades isoprênicas e 15 átomos de carbono (SIANI et al., 2000; BAKKALI et al., 2008).

Dentre estes, os monoterpenos ainda podem ser divididos em três subgrupos (SIMÕES; SPITZER, 2004): acíclicos (mirceno, linalol e geraniol); monocíclicos (α-terpineol, terpinoleno, mirtenol); e, bicíclicos (α-pineno, tujona, cânfora e fenchona). Em cada um desses subgrupos, há ainda outras classificações: hidrocarbonetos insaturados (limoneno), álcoois (mentol, linalol), aldeídos ou cetonas (mentona e carvona), lactonas (nepelactona) e tropolonas ( -tujaplicina).

Até o momento, são conhecidos aproximadamente 3000 OEs, 300 dos quais são amplamente empregados pela indústria farmacêutica, de saneantes, de cosméticos, de produtos agrícolas e indústria alimentícia, com diversos propósitos,

como o medicinal, bactericida, fungicida, antiparasitário, antiviral, inseticida, e condimentar (BAKKALI et al., 2008).

Os OEs são conhecidos por apresentarem diversas atividades no SNC, como a analgésica (ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; BAKKALI et al., 2008), ansiolítica (ALMEIDA et al., 2004), antidepressiva (VICTORY; BRAHM; SAVEGNAGO, 2013), anticonvulsivante (NÓBREGA, 2012; DE SOUSA et al., 2006a), e também por serem utilizados na aromaterapia, para induzir tranquilidade mental ou relaxamento, e para induzir o sono em humanos (DE SOUSA et al., 2006b).

2.6.1. (-)- Mirtenol

O (-)- mirtenol é um monoterpeno álcool cíclico (FIG. 9), de aroma agradável, que se apresenta como um líquido quase incolor, com fórmula molecular C10H16O e peso molecular 152,24 g/mol (BHATIA et al., 2008).

Figura 9 - Estrutura química do (-)- mirtenol.

O (-)- mirtenol é encontrado em diversas espécies de plantas aromáticas em diferentes proporções. Listamos abaixo algumas das famílias e espécies que este monoterpeno pode ser encontrado:

 Asteraceae: Achillea ligustica All., (MAGGI et al., 2009)

Tanacetum vulgare L., (KESKITALO; PEHU; SIMON, 2001;

 Cyperaceae: Cyperus articulatus L., (COUCHMAN; PINDER; BROMHAM, 1964).

 Lamiaceae: Rosmarinus officinalis L. (USAI, et al., 2011)

Salvia hydrangea (KOTAN et al., 2008)

Salvia hypoleuca Benth (NICKAVAR; MOJAB; ASGARPANAH, 2005)

Salvia lanigera (TENORE et al., 2011)

Salvia microstegia (SENATORE et al., 2006)

Salvia multicaulis Vahl. var. simplicifolia Boiss (SENATORE; ARNOLD; PIOZZI, 2004).

 Myrtaceae: Myrtus communis L., (GUARRERA; LEPORATTI, 2007),  Paeoniaceae: Paeonia lactiflora (NGAN et al., 2012)

 Rosaceae: Strawberry Fragaria spp (AHARONI et. al., 2004).

Na indústria de cosméticos, o (-)- mirtenol é usado como componente de cosméticos, xampus, sabonetes, detergentes, entre outros (BHATIA et al., 2008). Na literatura, existem diversos estudos de toxicidade que asseguram o uso do (-)- mirtenol nessas formulações. Em relação à toxicidade aguda, a DL50 (dose letal que

mata 50% dos animais) do (-)- mirtenol foi determinada em ratos, por via oral, machos 2,45 g/kg e em fêmeas 0,63 g/kg e 1,4 g/kg (machos e fêmeas juntos) (RIFM, 2001; BHATIA et al., 2008). No entanto, não foi relatada a DL50 em

camundongos por nenhuma via de administração.

Quanto as suas atividades biológicas, até o presente momento, foi descrito na literatura, que possuí propriedade biocida (LEPOITTEVIN et al., 2011) e bactericida (NGAN et al., 2012; OKOH; SADIMENKO; AFOLAYAN, 2010).

O óleo essencial de Salvia hydrangea, é rico em (-)- mirtenol e diversas propriedades biológicas têm sido relatadas em relação ao mesmo, como: atividade antimicrobiana e inseticida (KOTAN et al., 2008). Além disso, a espécie Myrtus

communis L, contém quantidades variadas de terpenos, destacando-se como

majoritário o (-)- mirtenol, e a planta apresentou atividade antinociceptiva e anti- inflamatória (HOSSEINZADEH; KHOSHDE; GHORBANI, 2011).

A espécie Tanacetum vulgare L. var. vulgare (tansy) é popularmente conhecida como catinga-da-mulata (DICKEL; RATES; RITTER, 2007), seu óleo essencial é rico em (-)- mirtenol (JUDZENTIENÉ; MOCKUTÉ, 2005; MOCKUTÉ; JUSZENTIENÉ, 2008). Foram descritos diversos efeitos biológicos da planta, tais como: antihelmintico (DUKE, 1985); tratamento da dermatite (DUKE, 1985),

atividade antiulcerogênica em camundongos (TOURNIER et al.,1999); atividade anti- inflamatória in vivo (SCHINELLA et al., 1998 ) e atividade bactericida in vitro (HOLETZ et al., 2002 ). Além disso, altas doses causam intoxicação, vômito, dor abdominal, gastroenterite, perda da consciência, arritmia cardíaca e hemorragia uterina (ROBBERS; TYLER, 1999).

Franco e colaboradores (2011) verificaram que o α-pineno, um terpenóide álcool cíclico, apresentou atividade antinociceptiva com participação do sistema opióide.

Outro terpenóide álcool cíclico, o (S)-(-)- álcool perílico inibiu o crescimento de células de câncer de mama em humanos em modelos in vitro e in

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

 Avaliar a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do (-) - mirtenol em modelos experimentais e os possíveis mecanismos de ação relacionados.

3.2. Específicos

 Determinar a DL50 do (-) - mirtenol em camundongos por via intraperitoneal;

 Investigar os efeitos comportamentais decorrentes do tratamento com (-) - mirtenol em modelos animais;

 Verificar o efeito antinociceptivo do (-) - mirtenol em modelos de nocicepção química e térmica em camundongos;

 Avaliar os mecanismos de ação da atividade antinociceptiva do (-) - mirtenol com o uso de antagonistas dos receptores opióides, do subtipo µ1 dos receptores opióides, dos canais de potássio sensíveis à ATP, do óxido nítrico e do adrenorreceptor α2;

 Pesquisar a atividade anti-inflamatória do (-) - mirtenol no edema de pata induzido pelo agente flogístico carragenina;

 Investigar a atividade anti-inflamatória do (-) - mirtenol no edema de pata induzido pelos mediadores inflamatórios prostaglandina E2 e bradicinina;

 Avaliar a atividade anti-inflamatória do (-) - mirtenol na migração de células no modelo de peritonite induzida pela carragenina;

 Quantificar os níveis de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 no lavado peritoneal de animais tratados com (-) - mirtenol.

4. MATERIAL

4.1. Animais

Para a realização da triagem farmacológica comportamental e DL50 do

presente estudo, foram utilizados camundongos (Mus Musculus) albinos da linhagem suíça, machos e fêmeas, com 2 a 3 meses de idade, pesando entre 25 a 35 g, provenientes do biotério Prof. Dr. George Thomas do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal da Paraíba.

No entanto, para o desenvolvimento dos demais testes, foram utilizados camundongos (Mus Musculus) machos albinos da linhagem suíça, com 2 a 3 meses de idade, pesando entre 25 a 35 g (FIG. 10).

No biotério, os animais foram alojados em gaiolas de polietileno, contendo 20 camundongos, mantidos sob condições monitoradas de temperatura de 21 ± 1º C, com livre acesso a uma dieta controlada a base de ração tipo pellets (Purina®) e água. Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, sendo a fase clara das 6:00 às 18:00 horas.

4.2. Condições experimentais

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Psicofarmacologia e os testes foram realizados no biotério Prof. Dr. Thomas George.

Os camundongos eram previamente alojados em gaiolas de polietileno, contendo 4 animais cada, com pelo menos 120 minutos de antecedência à execução dos testes, visando minimizar as possíveis alterações comportamentais dos animais decorrentes da mudança de ambiente, bem como permitir uma adaptação à sala de experimentação. Os camundongos foram mantidos a temperatura de 21 ± 1º C e privados de água e ração 60 min antes dos testes.

Antes de cada procedimento, a bancada foi limpa com etanol 70%, e durante os procedimentos foi utilizado etanol de baixa graduação (10%). Todos os experimentos foram executados no período compreendido das 12h00 às 17h00 horas, e os animais eram utilizados uma única vez e, em seguida eutanasiados.

Todos os procedimentos experimentais foram analisados e previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do LTF/UFPB, sob a certidão nº 0104/2010.

4.3. Substâncias utilizadas

 (-)- Mirtenol (Sigma _{– EUA)}

 Ácido acético glacial (Synth – E.U.A.)  Água destilada (UFPB _{– Brasil)}  Bradicinina (Sigma – E.U.A.)  Carragenina (Sigma – E.U.A.)

 Cloridrato de morfina (Merck – EUA)  Dexametasona (Sigma – E.U.A)

 Dicloridrato de Naloxonazine (Sigma – E.U.A.)  Etanol (Vetec – Brasil)

 Formaldeído 37% (Vetec – Brasil)  Glibenclamida (Sigma – EUA)

 Glutamato (Sigma – E.U.A.)

 Hidrocloridrato de naloxona (Sigma – E.U.A)  Indometacina (Sigma – EUA)

 Ioimbina (Sigma _{– E.U.A)}

 Kits TNF-_{α e IL-1 (Bioscience)®}  L-arginina (Sigma – E.U.A.)  L-NMa (Sigma – E.U.A.)  L-NOARG (Sigma – E.U.A.)  MK-801 (Sigma – E.U.A.)

 May-Grunwald Giemsa (Sigma – E.U.A.)  Prostaglandina E2 (Sigma – E.U.A.)

 Solução fosfato tamponado (PBS) (Laboratório de Psicofarmacologia)  Tween 80 (polioxetileno sorbitano monoleato) (Sigma – E.U.A.)

4.4. Especificações do (-) - Mirtenol

A substância pura é constituída de uma mistura de isômeros, de anéis furano, tendo como sinônimo: (1R)-2-Pinen-10-ol, (1R)-6,6-Dimetilbiciclo[3.1.1]hept- 2-en-2-metanol. Apresenta grau de pureza de ≥98.5% em cromatografia gasosa. Está registrada no CAS sob o número 19894-97-4, com fórmula C10H16O e peso

molecular 152.24 g/mol.

O (-)- mirtenol utilizado em todos os experimentos foi obtido da empresa Sigma Aldrich Chemical Co. (U.S.A).

O (-)- mirtenol e o α-pineno apresentam o mesmo esqueleto pineno entre si com uma diferença estrutural no grupamento R do carbono 10, (FIG. 11) (LEE, 2002). Assim, o (-)- mirtenol pode ser oxidado apartir do α-pineno pelo citocromo P- 450 através das enzimas mono-oxigenases (AHARONI et al., 2004).

4.4.1. Preparação do (-) - Mirtenol e demais substâncias

Imediatamente antes da realização dos testes, o (-)- mirtenol foi dissolvido em Tween 80 (Polissorbato 80) 0,2% e em água destilada, utilizando-se concentrações decimais de forma a possibilitar a injeção de 0,1 mL/10g de peso do animal.

Foram preparadas as doses de 25, 50 e 100, 150, 200 e 300 mg/kg de (-)- mirtenol, para a administração pela via intraperitoneal (i.p.). Como controle negativo, foi utilizado Tween 80 a 0,2% em água destilada (i.p.).

A preparação das demais substâncias, em suas respectivas doses, foi realizada alguns minutos antes de sua utilização sendo dissolvidas em água destilada ou solução salina 0,9%. Todas as doses das substâncias, que foram administradas por via i.p. ou s.c., foram calculadas de forma a possibilitar a injeção de 0,1 mL/10 g de peso do camundongo. A única exceção ocorreu com a formalina, carragenina, prostaglandina E2 e bradicinina que foram injetadas, por via

intraplantar.