UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
MIRIAN GRACIELA DA SILVA STIEBBE SALVADORI
MECANISMO DE AÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
E
ANTI-INFLAMATÓRIA DO (-) - MIRTENOL
MIRIAN GRACIELA DA SILVA STIEBBE SALVADORI
MECANISMO DE AÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
E
ANTI-INFLAMATÓRIA DO (-) - MIRTENOL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências
da Saúde da Universidade Federal da Paraíba para obtenção
do grau de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS - Área de concentração:
FARMACOLOGIA.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
S182m Salvadori, Mirian Graciela da Silva Stiebbe.
Mecanismo de ação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do (-) - mirtenol / Mirian Graciela da Silva Stiebbe Salvadori.-- João Pessoa, 2013.
157f. : il.
Orientador: Reinaldo Nóbrega de Almeida
Tese (Doutorado) – UFPB/CCS
1. Farmacologia. 2. (-) - Mirtenol. 3. Antinociceptivo. 4. Anti-inflamatório. 5. Monoterpeno. 6. Mecanismo de ação.
MIRIAN GRACIELA DA SILVA STIEBBE SALVADORI
MECANISMO DE AÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
E
ANTI-INFLAMATÓRIA DO (-) - MIRTENOL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de
DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS - Área de concentração: FARMACOLOGIA.
Aprovado em 01/08/2013
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________ Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida
Orientador – UFPB
__________________________________________ Prof. Dr. Carlos Fernando de Mello
Examinador externo – UFSM
__________________________________________
Prof. Dr. Nelson Torro Alves Examinador externo - UFPB
__________________________________________ Profa. Dra. Hilzeth de Luna Freire Pessôa
Examinadora interna – UFPB
__________________________________________ Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima
Aos meus pais (in memoriam).
Ao Fabiano e as nossas filhas Ana Luiza e
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as bênçãos que me proporcionou, por ter me dado
força, sabedoria e serenidade para enfrentar os obstáculos ao longo deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida, por
acolher-me em seu grupo de pesquisa, depositando confiança em mim e no acolher-meu trabalho e
que acreditou na minha capacidade. Pelo exímio exemplo como orientador,
professor e ser humano.
Aos meus pais (in memoriam), Maria Helena e Edvino Leopoldo, razão
da minha existência, obrigado por todo amor e exemplo de vida.
As minhas amadas filhas Ana Luiza e Ana Beatriz, por todo o amor,
alegria, carinho e compreensão pela minha ausência. Vocês duas são a razão da
minha vida, amo-as incondicionalmente.
Ao Fabiano, meu esposo e grande companheiro de todas as horas, pelo
apoio imensurável, dedicação, compreensão e amor. Obrigado por fazer parte da
minha história, te amo muito!
Aos meus irmãos, Marlei, Marlise, Marlon Cristiano, Marcos André e
Márcio, pelos momentos felizes que vivemos quando estamos juntos e por torcerem
sempre pelo meu sucesso. Amo muito vocês!
Aos meus queridos sobrinhos e afilhados, por toda a alegria e amor.
A Família Salvadori, presença constante, por compartilhar os momentos
de dificuldades bem como das minhas conquistas.
Ao Prof. Dr. Damião Pergentino de Sousa, pelo fornecimento da
A todos ex-colegas e amigos do laboratório de Psicofarmacologia, que me
acolheram tão carinhosamente, Adriana Fernandes, Camila Carolina, Flávia
Negromonte, Franklin Nóbrega, Leandra Oliveira, Maria Clécia Sena e Vanine
Mota Lemos.
Aos meus queridos colegas de experimentos que não mediram esforços
em colaborar, Adriana Fernandes, Charlane Souto, Diogo Villar, Fabíola Lélis,
Paula Salgado e Rosângela Penha, minha eterna gratidão e reconhecimento.
Aos demais colegas da psicofarmacologia, Aline Kelly, Ana Karina,
Edgar, Érica, Lucas, Luciano Paula Torres, Renan, Rubens, Sara, Vanessa,
Viviana, Wendel, pela colaboração e amizade.
As professoras Dra. Liana Clébia S. L. de Morais e Dra. Temilce Assis
pela amizade e convivência.
A profa. Dra. Márcia Piuvezam e Fagner Carvalho, do laboratório de
imunologia, pela parceria e colaboração nos testes de inflamação. Muito obrigado!
A todos Professores do Programa da Pós-graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos, pelos ensinamentos científicos.
Aos professores membros da banca do exame de qualificação Dra.
Leônia Maria Batista, Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima e Dr. Nelson Torro
Alves, pela grande contribuição para o aprimoramento da tese.
Á secretaria da Pós-graduação Caroline Mangueira e Tânia Maria
Araújo, pelo carinho e serviços prestados.
A Mônica Rodrigues, pela amizade sincera, apoio e dedicação.
Aos funcionários do Biotério Prof. Dr. Thomas George, Luis Cordeiro,
Ao amigo José Crispim Duarte, uma pessoa fundamental nessa
trajetória. Muito obrigada pela dedicação e amizade.
As minhas amigas Cristina Banderó e Anajara Teixeira, que apesar da
distância, sempre torceram pelo meu sucesso e felicidade.
Ao professor Dr. Carlos Fernando de Mello, pela acolhida no universo
da pesquisa, pelo exemplo de pesquisador e ser humano.
Aos professores membros da banca de defesa da tese Dr. Carlos
Fernando de Mello, Dra. Hilzeth de Luna Freire Pessôa, Dr. Nelson Torro Alves
e Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima, por aceitarem o convite e pela grande
contribuição para o aprimoramento da tese.
Ao Biotério Prof. Dr. Thomas George do Laboratório de Tecnologia
Farmacêutica pelo fornecimento dos animais.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida durante a realização desse
trabalho.
Enfim, a todos que de alguma forma participaram na realização deste
“
Aprender é a única coisa de que
a mente nunca se cansa,
nunca tem medo e
nunca se arrepende."
RESUMO
SALVADORI, M.G.S.S. Mecanismo de ação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do (-) - mirtenol. 2013. 157p. Tese (Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) - UFPB/CCS/ João Pessoa – PB.
Os óleos essenciais obtidos de plantas medicinais possuem uma variedade de compostos bioativos, como os monoterpenos. Estes monoterpenos possuem distintas atividades farmacológicas descritas, como analgésica, anti-inflamatória, antidepressiva e anticonvulsivante dentre outras. O (-)-mirtenol é um monoterpeno, álcool monocíclico, de odor agradável, utilizado na indústria de cosméticos. No entanto, a ausência de pesquisas sobre as possíveis atividades farmacológicas deste monoterpeno incentivou à realização deste trabalho. O presente estudo investigou o efeito do (-)- mirtenol, pela via intraperitoneal, em camundongos suíços machos adultos em modelos experimentais de dor e de inflamação. Inicialmente, foi realizada a pesquisa da dose letal 50 (DL50) do monoterpeno, no intuito de estabelecer doses seguras para os testes subsequentes. Para investigar o perfil de ação do monoterpeno no sistema nervoso central foi realizado a triagem farmacológica comportamental e o principal efeito observado nos animais tratados com (-)- mirtenol foi analgesia. Em seguida, foram realizadas metodologias para avaliar a atividade antinociceptiva. O (-)- mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) aumentou a latência para o inicio das contorções abdominais induzidas por ácido acético e reduziu o número de contorções, quando comparado ao grupo controle. No teste da formalina, utilizando as mesmas doses, o (-) - mirtenol não alterou o tempo de lambida da pata na fase neurogênica (0-5 min), mas inibiu significativamente (p<0,001) o tempo de lambida da pata na fase inflamatória (15-30 min). No teste da nocicepção induzida por glutamato, as três doses do monoterpeno reduziram o tempo de lambida da pata. Já no teste da placa quente, que é sensível e específico para drogas que atuam por mecanismo central, o (-)- mirtenol não alterou a latência na retirada da pata. Com estes resultados podemos propor que a ação antinociceptiva do (-)- mirtenol pode ser por mecanismo de ação periférica e não central. Na tentativa de elucidar o mecanismo de ação envolvido no efeito antinociceptivo do (-)- mirtenol foram usadas ferramentas farmacológicas no teste da formalina. A antinocicepção produzida pelo (-)- mirtenol (100 mg/kg i.p.) foi revertida pela naloxona (5 mg/kg s.c.), naloxonazine (10 mg/kg s.c.), glibenclamida (10 mg/kg s.c.), L-NOARG (50mg/kg i.p.) e ioimbina (0,15 mg/kg i.p) somente na segunda fase do teste da formalina. Tendo em vista a destacada ação do monoterpeno na segunda fase do teste da formalina, investigamos sua possível atividade anti-inflamatória. Nessa avaliação, o tratamento com o (-)- mirtenol (50 e 100 mg/kg, i.p.) foi capaz de reduzir o edema de pata induzido por carragenina (500 µg/pata), prostaglandina E2 (5 nmol/pata) e bradicinina (3 nmol/pata) em todos os tempos testados. No modelo da peritonite induzida por carragenina (1%), o monoterpeno diminuiu o influxo de leucócitos e também os níveis das citocinas IL-1 e TNF-α no lavado peritoneal. Portanto, este trabalho demonstrou que o (-)- mirtenol possui atividade antinoceptiva com participação dos sistemas opióidérgico µ1, canais de K+ATP, óxidonitrérgico e α2-adrenérgico. Além disso, possui atividade anti-inflamatória ao inibir a formação do edema de pata e reduzir o influxo de leucócitos possivelmente pela inibição da produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1 e TNF-α.
ABSTRACT
SALVADORI, M.G.S.S. Mechanism of action of the antinociceptive and
anti-inflammatory (-) – myrtenol. 2013. 157p. Tese (Pós-graduação em Produtos Naturais
e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) - UFPB/CCS/ João Pessoa – PB.
The essential oils of herbs have a variety of bioactive compounds, such as monoterpenes. These monoterpenes have several pharmacological activities described as analgesic, anti-inflammatory, antidepressant and anticonvulsant, among others. The (-)- myrtenol is a monoterpene alcohol monocyclic, of pleasant odor, used in the cosmetics industry. However, the absence of research on possible pharmacological activities of this monoterpene has encouraged the present research. This study investigates the effect of (-)- myrtenol, intraperitoneally in adult male Swiss mice under experimental models of pain and inflammation. Initially, the research was initiated with lethal dose 50 (LD50) of monoterpene, in order to establish safe doses for subsequent tests. To investigate the action profile of monoterpene in the central nervous system, a pharmacological screening behavior was carried out, the effect of which in animals treated with (-)- myrtenol was that of analgesia. Then methodologies were conducted to evaluate the antinociceptive activity. The (-)- myrtenol (25, 50 and 100 mg/kg, i.p) increased the latency to the onset of abdominal writhing induced by acetic acid and reduced the number of writhing when compared to the control group. In the formalin test, using the same doses, (-) myrtenol did not alter the duration of paw licking in the neurogenic phase (0-5 min), but it inhibited significantly (p <0,001) the time of paw licking along the inflammatory phase (15-30 min). In the test of nociception induced by glutamate, the three doses of monoterpene reduced time of paw licking. In the hot plate test, which is sensitive and specific to drugs that act through a central mechanism, the (-)- myrtenol did not alter the paw withdrawal latency. With these results, we propose that the antinociceptive action of (-)- myrtenol may be a peripheral and not central mechanism of action. In an attempt to elucidate the mechanism of action involved in the antinociceptive effect of (-)- myrtenol, pharmacological tools were used in the formalin test. The antinociception produced by (-)- myrtenol (100 mg/kg, i.p) was reversed by naloxone (5 mg/kg, s.c) naloxonazine (10 mg/kg, s.c), glibenclamide (10 mg/kg, s.c), L-NOARG (50mg/kg, i.p) and yohimbine (0,15 mg/kg, i.p) only in the second phase of the formalin test. In view of the outstanding action of monoterpene in the second phase of the formalin test, we have investigated its possible anti-inflammatory activity. In this evaluation, treatment with (-)- myrtenol (50 and 100 mg/kg, i.p) was effective in reducing the paw edema induced by carrageenan (500 mg / paw), prostaglandin E2 (5 nmol / paw) and bradykinin (3 nmol / paw) at all times tested. In the model of carrageenan-induced peritonitis (1%), the monoterpene decreased the influx of leukocytes and also the levels of IL-1 and TNF-α in peritoneal fluid. Therefore, this study has demonstrated that (-)- myrtenol has antinociceptive activity with the participation of opioid receptor μ1, K+
ATP
channels, oxidonitrergic and adrenergic αβ. Furthermore, (-)- myrtenol has exhibited anti-inflammatory activity by inhibiting the formation of paw edema and reduced leukocyte influx, possibly by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines IL-1 and TNF -α.
Keywords: (-)-Myrtenol, Pain, Antinociception, Anti-inflammatory, Monoterpene,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura química do α-pineno ... 22
Figura 2 - Estrutura química do (S)-(-)- álcool perílico ... 23
Figura 3 - Estrutura química do (-)- linalol ... 23
Figura 4 - Estrutura química do tetrahidrolinalol ... 23
Figura 5 - Visão geral do circuito nociceptivo... 30
Figura 6 - Desenho esquemático mostrando a localização das lâminas do corno dorsal da medula espinhal... 33
Figura 7 - Componentes do processo inflamatório ... 42
Figura 8 - Biossíntese de eicosanóides e seus receptores ... 45
Figura 9 - Estrutura química do (-) - mirtenol ... 49
Figura 10 - Camundongo suíço ... 55
Figura 11 - Estrutura química do mirtenol e α-pineno ... 57
Figura 12 A - Vista superior da caixa de observação usada no teste da formalina ... 58
Figura 12 B - Vista frontal da caixa de observação usada para o teste da formalina ... 58
Figura 13 - Aparelho da placa quente ... 59
Figura 14 - Resumo esquemático das metodologias utilizadas no estudo do (-)- mirtenol ... 60
Figura 15 - Efeito da administração do (-)- mirtenol, morfina e indometacina na latência para a primeira contorção abdominal induzidas pelo ácido acético ... 78
Figura 17 - Efeito do (-)- mirtenol, morfina e indometacina na fase neurogênica do teste da formalina em camundongos ... 80
Figura 18 - Efeito do (-)- mirtenol, morfina e indometacina na fase inflamatória do teste da formalina em camundongos ... 81
Figura 19 - Efeito do (-)- mirtenol sobre a nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos ... 83
Figura 20 - Efeito do (-)- mirtenol na fase neurogênica do teste da formalina, em camundongos, na presença de naloxona e morfina ... 84
Figura 21 - Efeito do (-)- mirtenol na fase neurogência do teste da formalina, em camundongos, na presença de naloxona e morfina ... 85
Figura 22 - Efeito do pré-tratamento com naloxonazine na antinocicepção ocasionada pelo (-)- mirtenol e morfina, na fase neurogênica do teste da formalina ... 86
Figura 23 - Efeito do pré-tratamento com naloxonazine na antinocicepção ocasionada pelo (-)- mirtenol, na fase inflamatória do teste da formalina ...
87
Figura 24 - Efeito do pré-tratamento com glibenclamida na antinocicepção ocasionada pelo (-)- mirtenol, na fase neurogênica do teste da formalina ... 88
Figura 25 - Efeito do pré-tratamento com glibenclamida na antinocicepção ocasionada pelo (-)- mirtenol, na fase inflamatória do teste da formalina ... 89
Figura 26 - Efeito do (-)- mirtenol na fase neurogênica do teste da formalina, em camundongos, na presença de L-Arginina e L-NOARG ... 90
Figura 27 - Efeito do (-)- mirtenol na fase inflamatória do teste da formalina, em camundongos, na presença de L-Arginina e L-NOARG ... 91
Figura 28 - Efeito do (-)- mirtenol na fase neurogênica do teste da formalina, em camundongos, na presença de ioimbina ... 92
Figura 30 A - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona no edema de pata induzido por carragenina na primeira fase ... 95
Figura 30 B - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona no edema de pata induzido por carragenina na segunda fase ... 96
Figura 31 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona no edema de pata induzido por prostaglandina E2 ... 97
Figura 32 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona no edema de pata induzido por bradicinina ... 99
Figura 33 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona sobre a migração de leucócitos totais na peritonite induzida por carragenina ... 100
Figura 34 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona sobre os neutrófilos na peritonite induzida por carragenina ... 101
Figura 35 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona sobre as células mononucleares, na peritonite induzida por carragenina .. 101
Figura 36 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona sobre os níveis das citocinas TNF-α no modelo de peritonite induzida por carragenina ... 102
Figura 37 - Efeito da administração do (-)- mirtenol e da dexametasona sobre os níveis das citocinas IL-1 no modelo de peritonite induzida por carragenina ... 103
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Classificação anátomo-funcional das fibras nervosas ... 31
Quadro 2 - Protocolo experimental utilizado na triagem farmacológica comportamental ... 63
Quadro 3 - Alterações comportamentais observadas em camundongos após a administração do (-)- mirtenol ... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Percentual de mortes em camundongos tratados com diferentes doses do (-)- mirtenol ... 75
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% Por cento
± Mais ou menos
® Marca registrada
° C Graus Celsius
AA Ácido araquidônico
AINES Anti-inflamatório não-esteroidais
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiônico
AMPc Monofosfato de adenosina cíclico
ANOVA Análise de variância
AP-1 Fator de ativação da proteína 1
ASIC B1 a B4
Canais iônicos sensíveis a ácido Receptores da bradicinina
Ca2+ Íons calico
CCK Colecistocinina
CFA Completo adjuvante de Freund
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
cm Centímetros
COX Ciclooxigenase
COX-1 Ciclooxigenase I
COX-2 Ciclo-oxigenase-2
DAG Diacilglicerol
DEXA Dexametasona
DL50 Dose letal que mata 50% dos animais
DOR E.P.M.
Receptor opioide delta Erro padrão da média
EP Receptores prostanóides
g Grama
g/kg Grama por quilograma
Gi/o Proteína G inibitória
GIRK GPCRs
Canais de K+ retificadores de influxo Receptores acoplados a proteína G
H2O Água
i.p. Intraperitoneal
IASP International Association for the Study of Pain ICAM-1 Molécula de adesão intracelular 1
IF- Interferon-gama
IL-1 Interleucina 1
IL-18 Interleucina 18
IL-1Ra Antagonista do receptor da IL-1 IL-1α Interleucina 1α
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IP3 1,4,5-trifosfato de inositol
ISO International standard organization
K+ Íon potássio
K+ATP Canal de potássio ativado por ATP
Kainato 2-carboxi-3-carboximetil-4-isopropenilpirrolidina KOR
L-Arg
Receptor opioide kappa L-arginina
L-NMa N G -metil-L-arginina L-NOARG Nω-nitro-L-arginina
LPS Lipopolissacarídeo
LTF Laboratório de Tecnologia Farmacêutica
LTs Leucotrienos
LXA Lipoxinas
MAPKs Proteínas quinases ativadas por mitógeno
mg/kg Miligrama por quilograma
Min Minuto
MK-801 Antagonista não-competitivo do receptor NMDA
mL Mililitros
mm Milímetros
MOR MORF
Receptor opioide mu Morfina
Nav Canal de sódio dependente de voltagem
N/OFQ Receptor do subtipo nociceptina/orfanina
n° Número
NF-kB Fator de transcrição nuclear κB NGF Fator de crescimento neural
NKA Neurocinina A
NKB Neurocinina B
nm Nanômetro
NMDA N-metil-D-aspartato
Nmol Nanomol
NO Óxido nítrico
NOP Receptor peptídico
NOS Óxido nítrico sintase
NOSe NOS endotelial
NOSi NOS induzida
NOSn NOS neuronal
Oes Óleos essenciais
PAF Fator de agregação plaquetária
PBS Tampão fosfato de sódio
PG Prostaglandina
PGE2 Prostaglandina E2
PGFβα Prostaglandina F2-alfa
PGI2 Prostaciclina
pg/mL PKA
Picograma por mililitro Proteína quinase A
PKC Proteína quinase dependente de cálcio
r.p.m. Rotações por minuto
s.c. Subcutânea
S-I Córtex somatossensorial primário
S-II Córtex somatossensorial secundário
SNA Sistema nervoso autônomo
SNC Sistema nervoso central
SP Substância P
TLRs Receptores do tipo toll
TNF-α Fator de necrose tumoral-α
Tween 80 Polioxetileno sorbitano monoleato 80
TXA2 Tromboxano A2
TXA4 Tromboxano A4
VCAM- 1 Molécula de adesão das células vasculares 1
α Alfa
Beta
δ Delta
κ Kappa
μ Mu
μL Microlitros
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 21
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 26
2.1. Considerações sobre fármacos que atuam no SNC ... 26
2.2. DOR – classificação geral ... 27
2.3 Percepção e propagação da dor ... 29
2.3.1. Vias periféricas de transmissão ... 30
2.3.2. Vias centrais de transmissão ... 34
2.3.2.1. Vias ascendentes ... 34
2.3.2.2. Vias descendentes ... 35
2.4. Tratamento farmacológico da dor ... 37
2.5. Considerações gerais sobre inflamação ... 40
2.5.1. Mediadores inflamatórios ... 41
2.6. Considerações gerais sobre óleos essenciais ... 48
2.6.1. (-)- Mirtenol ... 49
3. OBJETIVOS.... 53
3.1. Geral ... 53
3.2.Específicos ... 53
4. MATERIAL ... 55
4.1 Animais ... 55
4.2 Condições experimentais ... 56
4.3 Substâncias utilizadas ... 56
4.4 Especificações do (-)- Mirtenol ... 57
4.4.1. Preparação do (-) - Mirtenol e demais substâncias ... 58
4.5. Caixa de observação para o teste da formalina ... 58
4.6. Aparelho da placa quente ... 59
5. MÉTODOS ... 60
5.1.1. Teste de solubilidade ... 61
5.1.2. Avaliação dos efeitos tóxicos ... 61
5.1.3. Determinação da DL50 ... 62
5.1.4. Triagem farmacológica comportamental ... 62
5.2. Estudo da atividade antinociceptiva ... 64
5.2.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético... 64
5.2.2. Teste da formalina ... 64
5.2.3. Teste da placa quente ... 65
5.2.4. Nocicepção induzida pela injeção intraplantar de glutamato ... 66
5.3. Investigação dos possíveis mecanismos de ação na atividade antinociceptiva do (-) – mirtenol ... 67
5.3.1. Participação do sistema opióide ... 67
5.3.2. Participação dos receptores opioidérgicos seletivos µ1 ... 68
5.3.3. Participação dos canais de K+ ATP ... 68
5.3.4. Participação do sistema L-arginina-óxido nítrico ... 68
5.3.5. Participação do sistema α2-adrenérgico ... 69
5.4. Estudo da atividade anti-inflamatória do (-)– mirtenol ... 70
5.4.1. Edema de pata induzido por carragenina ... 70
5.4.2. Edema de pata induzido por prostaglandina E2 e bradicinina ... 70
5.4.3. Peritonite induzida por carragenina ... 71
5.4.3.1. Contagem diferencial de células do lavado peritoneal ... 72
5.4.4 Dosagem das citocinas TNF-α e IL-1 ... 72
5.5. Análise estatística... 73
6. RESULTADOS ... 75
6.1. Avaliação da toxicidade do (-)- mirtenol ... 75
6.1.1. Determinação da dose letal / DL50 ... 75
6.2. Avaliação da atividade do (-)- mirtenol no SNC ... 76
6.2.1. Efeito do (-)- mirtenol na triagem farmacológica comportamental... 76
6.3. Avaliação da atividade antinociceptiva do (-)- mirtenol ... 78
6.3.2. Efeito do (-)- mirtenol no teste da formalina ... 80
6.3.3. Efeito do (-)- mirtenol no teste da placa quente ... 82
6.3.4. Efeito do (-)- mirtenol no teste da nocicepção induzida por glutamato ... 83
6.3.5. Estudo do mecanismo de ação da atividade antinociceptiva do (-)- mirtenol pelo teste da formalina ... 84
6.3.5.1. Participação da via opióide ... 84
6.3.5.2. Participação dos receptores opioidérgicos seletivos µ1 ... 86
6.3.5.3. Participação dos canais de K+ATP ... 88
6.3.5.4. Participação do sistema L-arginina-óxido nítrico ... 90
6.3.5.5. Participação do sistema α2-adrenérgico ... 92
6.4. Avaliação da atividade anti-inflamatória do (-)- mirtenol ... 94
6.4.1. Efeito do (-)- mirtenol no edema de pata induzido por carragenina ... 94
6.4.2. Efeito do (-)- mirtenol no edema de pata induzido por prostaglandina E2 ... 96
6.4.3. Efeito do (-)- mirtenol no edema de pata induzido por bradicinina ... 98
6.4.4. Efeito do (-)- mirtenol na peritonite induzida por carragenina ... 100
6.4.5. Efeito do (-)- mirtenol sobre os níveis de TNF-α e IL-1 no lavado peritoneal ... 102
7. DISCUSSÃO ... 105
8. CONCLUSÃO ... 125
9. PERSPECTIVAS ... 127
10. REFERÊNCIAS ... 129
11. ANEXOS I ... 152
11.1. Artigos produzidos na vigência do doutorado ... 152
12. ANEXOS II ... 154
1. INTRODUÇÃO
A sensação da dor normalmente acompanha a maioria das doenças que acometem os seres humanos, alertando o organismo para a presença de estímulos danosos (WOOLF; SALTER, 2000). A dor é a causa mais frequente de procura aos serviços de saúde, sua prevalência na população geral varia de 11% a 40%. No Brasil, 1/3 da realização das consultas médicas são devido à dor, sendo encontrado em 70% dos pacientes (TEIXEIRA et al., 2001). Quando não adequadamente tratada, a dor pode produzir efeitos desastrosos na vida dos pacientes e também das pessoas que convivem com eles. Uma das principais causas de afastamento do trabalho, de depressão e de isolamento social é, justamente, a dor não tratada adequadamente. Assim, identificar a causa e aliviar esse sintoma é, com certeza, parte importante do tratamento de qualquer doença.
A dor pode ser modulada por uma série de eventos comportamentais, uma vez que abrange, além da transmissão do estímulo nocivo, diferentes fatores emocionais, ambientais e cognitivos (RUSSO; BROSE, 1998; JULIUS; BASBAUM, 2001). A nocicepção consiste na real injúria tecidual ou em um evento potencialmente danoso transduzido e codificado por nociceptores em níveis espinhais e supra-espinhais (LOESER; TREED, 2008; SCHNAKERS et al., 2012). Estes nociceptores podem ser ativados por diferentes estímulos, tais como químicos, térmicos e mecânicos, porém, essa estimulação pode ser reforçada ou sensibilizada por mediadores inflamatórios, como bradicinina, serotonina e prostaglandinas (BONNINGTON; MCNAUGHTON, 2003; HUANG; ZHANG; MCNAUGHTON, 2006).
juntamente com o alívio da dor, efeitos adversos que impedem a continuidade do tratamento.
Considerando a alta incidência da dor e também a falta de analgésicos eficazes e seguros, torna-se relevante pesquisar novas moléculas com potencial terapêutico. Assim, os produtos naturais derivados de plantas, representam uma valiosa fonte de agentes terapêuticos, por apresentar um vasto número de compostos químicos, em espécies de plantas encontradas em todo o mundo (KOEHN; CARTER, 2005; ABUHAMDAH; CHAZOT ADEREM, 2008).
Dentro deste contexto, as plantas medicinais contêm uma variedade de compostos bioativos, como os terpenos, que são constituintes dos óleos essenciais, que possuem várias propriedades farmacológicas, como analgésica e anti-inflamatória (DA SILVA et al., 2008; DE SOUSA; ALMEIDA, 2005; DE SOUSA, 2011). Os terpenos mais abundantes nos óleos essenciais são os monoterpenos e os sesquiterpenos (DE SOUSA, 2011).
Diversos estudos indicam que uma substância pode apresentar uma relação entre suas propriedades antinociceptiva e anti-inflamatória (BATISTA et al., 2008). Neste sentido, vários compostos de origem vegetal encontrados em abundância na natureza têm sido estudados. Citamos como exemplo, o α-pineno, o (S)-(-)- ácool perílico, o (-) – linalool e o tetrahidrolinalol.
O α-pineno é um monoterpeno álcool presente em grande quantidade no óleo essencial de Pistacia vera L. (Anacardiaceae). Em estudos experimentais, o extrato obtido desta planta, foi capaz de reduzir a formação do edema de pata induzido pelo agente flogístico carragenina sem provocar qualquer dano gástrico (ORHAN, et al., 2005).
Figura1: Estrutura
O (S)-(-)- álcool perílico, também um monoterpeno álcool, apresentou destacada atividade antinociceptiva nos testes de nociceptivos químicos: formalina e constrição abdominal induzido por ácido acético e térmico: no modelo da placa quente (BENEDITO, 2009).
Outro monoterpeno álcool acíclico encontrado em diversas espécies de plantas aromáticas é o (-)-linalol, onde as espécies Coriandrum sativum L. e Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, apresentam uma elevada concentração deste monoterpeno (BAKKALI et al., 2008).
Este monoterpeno também apresentou atividade antinociceptiva em vários modelos como na constrição abdominal induzida por ácido acético, placa quente (PEANA, et al., 2003), formalina (PEANA et al., 2004a) e nocicepção induzida por glutamato (BATISTA et al., 2008). Além disso, evidenciou-se atividade antinflamatória, no modelo de inflamação crônica induzido por completo adjuvante de Freund (CFA) (BATISTA, et al., 2010) e edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos tais como carragenina, glutamato e prostaglandina E2 (PEANA, et al., 2004b).
O tetrahidrolinalol é derivado do metabolismo do (-) – linalol, e assim como seu precursor é um monoterpeno álcool acíclico, e também apresentou atividade antinociceptiva nos modelos da constrição abdominal induzida por ácido acético, placa quente e formalina (OLIVEIRA, 2010).
Figura 4: Estrutura Química do Tetrahidrolinalol
Figura 2: Estrutura Química do (S)-(-)- álcool perílico
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 . Considerações sobre fármacos que atuam no SNC
Os psicotrópicos ou psicofármacos são drogas que atuam no sistema nervoso central (SNC) ocasionando alterações das funções cerebrais, principalmente no que se refere ao humor, emoções e atividades psicomotoras. Podem ser classificados das mais diferentes formas, levando-se em consideração critérios relacionados à sua estrutura química, efeitos clínicos, efeitos adversos e ações não terapêuticas, dentre outros. No entanto, de forma a contemplar um maior número de drogas que exercem algum efeito sobre o SNC, Almeida e Barbosa-Filho (2006) propuseram uma classificação:
Psicoanalépticos: são drogas estimulantes da atividade do SNC que excitam o psiquismo. Enquadram-se as drogas convulsivantes, os inibidores do apetite, estimulantes da vigília, psicoestimulantes, drogas estimulantes menores ou xantinas e drogas antidepressivas (ALMEIDA; BARBOSA-FILHO, 2006).
Psicolépticos: drogas que apresentam atividade depressora do SNC. Nesta classe encontram-se os neurolépticos (antipsicóticos), hipnóticos, ansiolíticos, analgésicos opióides, alcoóis, anestésicos gerais e anticonvulsivantes (ALMEIDA; BARBOSA-FILHO, 2006).
Psicodislépticos: drogas que não tem ação estimulante e nem depressora, são substâncias que não apresentam uso terapêutico. Trata-se de uma classe de drogas perturbadoras de atividade do SNC, sendo também chamadas de alucinógenos (ALMEIDA; BARBOSA-FILHO, 2006).
Parapsicotrópicos: drogas que não se enquadram em nenhuma das classes anteriores, porém são empregados frequentemente na clínica psiquiátrica e/ou neurológica. São exemplos destes os estabilizadores do humor, as drogas para o tratamento do alcoolismo e as drogas antiparkinsonianas (ALMEIDA; BARBOSA-FILHO, 2006).
novas, além de colaborar com o entendimento das bases neuroquímicas de muitas doenças.
As principais e mais pesquisadas classes de psicotrópicos são os antidepressivos, anticonvulsivantes, ansiolíticos, hipnóticos, relaxantes musculares, analgésicos e neurolépticos (POLATIN; DERSH, 2004). Com exceção dos antidepressivos, os demais compostos compõem a classe dos psicotrópicos com atividade depressora do SNC.
2.2. Dor – classificação geral
A sensação dolorosa tem um papel fisiológico e funciona como um sinal de alerta aos organismos vivos como uma tentativa de defesa individual, o que proporcionará a estes a possibilidade de evitar situações potencialmente perigosas e limitar os possíveis danos (MILLAN, 1999; WOOLF; SALTER, 2000; ALMEIDA et al., 2004).
Segundo a Associação Internacional para o Estudo da Dor (International Association for the Study of Pain – IASP, 2012), a dor é definida como ―uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão tecidual potencial ou real, ou descrita em termos de tal lesão‖. Já está bem estabelecido que a dor é uma experiência complexa que não envolve apenas a transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas existe também o processamento cognitivo e emocional pelo encéfalo, responsável pelas diferentes respostas comportamentais à dor processadas pelo cérebro.
Dessa forma, é importante distinguir entre dois termos: dor e nocicepção. Enquanto a nocicepção é a detecção da lesão tecidual por transdutores especializados ligados a fibras dos nervos periféricos do tipo A-δ (delta) e C, a dor envolve a percepção da nocicepção, contando com um componente emocional subjetivo (MILLAN, 1999; ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004), sendo influenciada por ansiedade, depressão, expectativa e outras variáveis psicológicas.
quadros dolorosos (COUTAUX et al., 2005). Uma vez que os animais não são capazes de verbalizar os componentes subjetivos da dor, neles não se avalia dor, mas nocicepção. Sendo assim, termos como dor e analgesia são mais adotados para humanos e nocicepção e antinocicepção para animais (JONES, 1996).
A dor é uma sensação complexa e, existem algumas classificações que dividem os processos dolorosos em diversas categorias, de acordo com a intensidade e a natureza do estímulo, duração, entre outros aspectos. Dentre as várias classificações, a mais importante é a que divide a dor em dor aguda e dor crônica.
A dor aguda é uma resposta fisiológica normal em resposta a um estímulo nocivo (CARR; GOUDAS, 1999) tais como lesões em tecidos ou órgãos, ocasionadas por inflamação, infecção, traumatismo ou outras causas. A sensação de dor é desencadeada pela ativação de nociceptores presentes no local lesionado, normalmente sendo de curta duração e limitada a área afetada, desaparecendo com a eliminação desse estímulo nocivo (RIEDEL; NEECK, 2001).
2.3. Percepção e propagação da dor
A função de alerta da dor reflete a ativação fásica de sensores denominados nociceptores, os quais são sensibilizados quando o estímulo é potencialmente perigoso, ou seja, excedem uma determinada faixa considerada fisiológica (estímulo inócuo) (BURGESS; PERL, 1967; MILLAN, 1999). A relação entre a percepção da dor e a ativação dos nociceptores envolve a ativação de uma cascata de eventos que surge na periferia e é transmitido ao longo das vias sensoriais (BASBAUM; JESSEL, 2000). Estes eventos são extremamente complexos, os quais reconhecem o estímulo através de receptores específicos (nociceptores), o convertem em potencial de ação que, por sua vez, é transmitido até o SNC, onde é processado e é gerada a percepção da dor (MILLAN, 1999).
Figura 5 - Visão geral do circuito nociceptivo.
Fonte: Modificado de GOLAN et al., 2009.
2.3.1. Vias periféricas de transmissão
Os nociceptores são receptores que consistem em um neurônio primário sensorial e se apresentam como terminações nervosas livres com alto limiar de excitabilidade. Eles conduzem as informações nociceptivas ao SNC, e seus corpos celulares encontram-se dentro dos gânglios das raízes dorsais, adjacente à medula espinhal (RUSSO; BROSE, 1998).
químicos (substâncias irritantes), diferindo quanto aos tipos de neurotransmissores que contêm os receptores e canais iônicos que expressam, na velocidade de condução, nas suas propriedades de resposta ao estímulo nocivo e sua capacidade de serem sensibilizados durante a inflamação, lesão e doença (STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001). Os nociceptores apresentam um limiar de ativação maior do que outros receptores sensoriais e respondem progressivamente, de acordo com a intensidade do estímulo (MENSE, 1983; MILLAN, 1999). Eles podem ser encontrados em toda a superfície da pele, mucosa, membranas, tecidos conectivos de órgãos viscerais, ligamentos e articulações, músculos, tendões e vasos arteriais (MENSE, 1983; ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004).
Os neurônios aferentes primários ou fibras sensoriais são classificados de acordo com a estrutura, diâmetro e velocidade de condução em três tipos: C, Aδ e A . A presença de mielina aumenta a velocidade de condução do impulso nervoso (Quadro 1) (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Quadro 1 - Diferentes tipos de neurônios sensoriais primários, responsáveis pela condução do sinal nociceptivo da periferia ao SNC.
Tipos de fibras Aα e A A I e II C
Mielinização Muita Pouca Ausente
Diâmetro (µm) 10 2 – 6 0,4 – 1,2
Velocidade de condução (m/s)
30 – 100 1,2 – 30 0,5 – 2
Temperatura Não reconhece Tipo I > 53oC Tipo II > 43oC
> 43oC
Tipo de sinal Propriocepção Toque leve
Térmico, mecânico e químico
Térmico, mecânico e químico
FONTE: Adaptado de Julius e Basbaum, (2001).
da dor crônica, enquanto que as fibras tipo Aδ são responsáveis por promover a sensação durante a dor aguda e respondem a estímulos mecânicos fortes, podem responder a estímulos térmicos e químicos desde que tenham sido previamente sensibilizados (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Figura6 - Conexão entre fibras aferentes primárias e a medula espinhal.
Fonte: Modificado de BASBAUM et al., 2009.
Para que ocorra a condução do estímulo doloroso da periferia para a medula espinhal, os canais de sódio regulados por voltagem devem converter a despolarização da terminação periférica em potencial de ação. São expressos nos aferentes primários seis tipos diferentes de canais de sódio regulados por voltagem (Nav). Merecem destaque, os canais Nav 1.8 e Nav 1.9, pois são seletivamente expressos em neurônios de pequeno calibre, apresentam limiar de ativação mais alto e inativam mais lentamente do que outros canais de sódio neuronais regulados por voltagem. O bloqueio seletivo desses dois canais específicos pode inibir a dor induzida na periferia sem bloquear a sensibilidade tátil ou a função motora somática ou autônoma e sem atuar sobre os canais de sódio do SNC ou cardiovasculares
2.3.2. Vias centrais de transmissão
2.3.2.1. Vias ascendentes
Quando as fibras nociceptivas aferentes chegam ao corno dorsal da medula espinhal, elas transmitem o sinal originado na periferia através da liberação de vários neurotransmissores específicos que estão associados com a dor (D’MELLO; DICKENSON, β008).
O principal neurotransmissor excitatório liberado pelos neurônios aferentes primários é o glutamato, um aminoácido excitatório que tem um papel essencial na transmissão da informação nociceptiva para os neurônios do corno dorsal da medula espinhal (CHIZH, 2002; OKUSE, 2007).
O glutamato se liga a dois tipos de receptores glutamatérgicos: receptores ionotrópicos e metabotrópicos, os quais estão presentes nos terminais pré-sinápticos e na membrana pós-sináptica no encéfalo e na medula espinhal (PINHEIRO; MULLE, 2008; KALIA; KALIA; SALTER, 2008). Os receptores glutamatérgicos ionotrópicos permitem a entrada de sódio e cálcio na célula, e são de três subtipos principais: receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), receptor ácido α -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiônico (AMPA) e receptor 2-carboxi-3-carboximetil-4-isopropenilpirrolidina, denominado kainato (DINGLEDINE et al., 1999; KEW; KEMP, 2005; KALIA; KALIA; SALTER, 2008). A família dos receptores glutamatérgicos metabotrópicos atua na ativação da fosfolipase C, aumentando os níveis de cálcio intracelular (OKUSE, 2007).
A estimulação contínua e a liberação sustentada de glutamato podem resultar no desenvolvimento de um estado de hiperexcitabilidade de neurônios nociceptivos, que se manifesta clinicamente como hiperalgesia e alodinia (GOUDET et al., 2009).
prostaglandinas (PG), galanina, encefalinas e endorfinas (BREDER, 1996; MILLAN, 1999).
Os neurônios aferentes primários fazem sinapse com neurônios no corno dorsal da medula espinhal. A medula espinhal está organizada em diferentes lâminas, que se estendem desde a superfície até a profundidade do corno dorsal. A maioria das fibras tipo Aδ e C terminam superficialmente nas lâminas I-II, enquanto as fibras tipo A terminam predominantemente nas lâminas III e VI (TODD, 2002).
A informação nociceptiva, após ter alcançado a medula espinhal, deve ser conduzida até o encéfalo, por meio de vias ascendentes que transmitem o impulso nervoso a estruturas do tronco encefálico e do diencéfalo, incluindo o tálamo, substância periaquedutal, região parabraquial, formação reticular, complexo amigdalóide, núcleo septal e hipotálamo (WILLIS; WESTLUND, 1997; MILLAN, 1999).
O tálamo representa a principal estrutura de controle (relé) das informações sensoriais destinadas ao córtex, estando envolvida em diversas funções, entre elas, recepção, integração e transferência do estímulo nociceptivo através de diferentes projeções até o córtex, compreendendo um circuito funcional de processamento da dor (MILLAN, 1999; ALMEIDA; ROIZENBLATT; TUFIK, 2004).
Neste circuito entre o tálamo e o córtex, dois sistemas de projeção nociceptiva atuam em paralelo: o sistema lateral e o medial, os quais envolvem três importantes regiões corticais, sendo elas, o córtex somatossensorial primário (S-I), córtex somatossensorial secundário (S-II) e córtex anterior cingulado (TREEDE; KENSHALO; GRACELY, 1999; TIMMERMANN; PLONER; HAUCKE, 2001).
2.3.2.2. Vias descendentes
O sistema descendente pode exercer tanto ações facilitatórias quanto inibitórias sobre a percepção de estímulos dolorosos e, desta forma, aumentar ou diminuir a sensação de dor. Assim, vias descendentes inibitórias podem atenuar a liberação de substâncias algogênicas das fibras aferentes primárias ou, ainda, direta ou indiretamente suprimir a estimulação dos neurônios de projeção (via interneurônios inibitórios) (MILLAN, 2002). Dentre as vias descendentes, destacam-se as vias noradrenérgica, serotoninérgica, dopaminérgica, opioidérgica e colinérgica. É importante ressaltar que o sistema descendente de controle da dor é bastante complexo, sendo que um mesmo neurotransmissor pode exercer tanto ações inibitórias quanto facilitatórias, dependendo do local onde é liberado (MILLAN, 2002; MARKS et al., 2009).
2.4. Tratamento farmacológico da dor
O tratamento farmacológico para o controle da dor é composto, basicamente, por três grupos de drogas analgésicas:
I) analgésicos periféricos representados pelos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES), que previnem a sensibilização de receptores periféricos da dor inibindo a ciclo-oxigenase;
II) fármacos adjuvantes, como os antidepressivos, anticonvulsivantes, ansiolíticos e antipsicóticos, são medicamentos normalmente indicados para outras condições patológicas;
III) analgésicos de ação central como os opióides, que abolem diretamente a transmissão nociceptiva, no SNC, pela ligação em receptores opióides (MOORE, 2009).
Os analgésicos periféricos são agentes anti-inflamatórios que agem no processo de redução da reação inflamatória, inibindo a liberação de PGs. O mecanismo de ação dos AINEs baseia-se na inibição do sistema enzimático da ciclo-oxigenases, a COX-1 e a COX-2, responsável pela síntese dos diferentes tipos de eicosanoides (PGD2, PGE2, PGI2, TXA2), os quais medeiam o processo inflamatório sensibilizando os nociceptores (GILROY et al., 2004; KURITZKY; SAMRAJ, 2012). Portanto, os efeitos dos AINEs não podem ser atribuídos apenas à inibição da síntese das prostaglandinas periféricas. Os AINEs atuam também no SNC, inibindo a hipersensibilidade espinhal e ativando mecanismos inibitórios descendentes, ambas ações decorrem do bloqueio das prostagandinas (CALIXTO et al., 2000; VANEGAS; SCHAIBLE, 2001).
O segundo grupo de analgésicos, é representado pelos fármacos adjuvantes, mas que atuam como fármacos analgésicos, particularmente, em pacientes que estão em tratamento dos estados dolorosos neuropáticos e outros tipos de dor crônica, mas que respondem mal aos analgésicos que normalmente são indicados para esta patologia. Os medicamentos incluídos neste grupo são:
Anticonvulsivantes: a carbamazepina, gapapentina, topiramato e lamotrigina, possuem boa ação terapêutica nas dores neuropáticas (TREMONT-LUKATS; MEGEFF; BOCKONJA, 2000).
Anestésicos locais (lidocaína), que bloqueiam descargas espontâneas de terminações nervosas lesadas.
Ansiolíticos e antipsicóticos: diminuem a excitabilidade neuronal, proporcionando sedação e analgesia. Dentre os fármacos ansiolíticos mais utilizados para este fim são os pertencentes ao grupo dos benzodiazepínicos, pois seus efeitos hipnóticos melhoram a qualidade do sono o que indiretamente promove relaxamento da musculatura estriada e alívio da dor. Entre os antipsicóticos a levomepromazina e a sulpirida são os mais utilizados. (MILLAN, 1999; RANG, et al., 2007; BROOKS, TRACEY, 2005).
O terceiro grupo são os analgésicos de ação central tais como os fármacos opióides, a exemplo da morfina e da codeína. São particularmente úteis no tratamento de dor viscerais difusas, dores associadas ao câncer e na analgesia pré e pós-cirúrgica. Dores neuropáticas, entretanto, costumam ser resistentes aos opióides, ao passo que dores inflamatórias ou dores somáticas de localização bem definida são mais adequadamente tratadas como analgésicos não-esteroidais ou com uma associação deste com um opióide (McDONALD; LAMBERT, 2009; MIZOGUCHI et al., 2012).
O mecanismo de ação destes fármacos envolve a ativação dos receptores opióides clássicos: MOR, DOR E KOR (também referidos como μ (mu), δ (delta), κ (kappa), os quais apresentam ligantes endógenos já identificados. As –endorfinas ligam-se aos receptores μ, as dinorfinas aos receptores κ, e as encefalinas aos receptores δ. Estes ligantes endógenos são de extrema importância na modulação da dor (JAN; VISCUSI, 2003; MIZOGUCHI et al., 2012).
Além destes três receptores descritos acima, descobriu-se um quarto receptor opióide, classificado como não clássico, o receptor peptídico (NOP) e subtipo nociceptina/orfanina N/OFQ (ZOLLNER; STEIN, 2007; McDONALD; LAMBERT, 2009).
corrente de influxo (inwardly rectifying potassium channel -GIRK). Assim, os canais de K+ são abertos, promovendo a hiperpolarização da célula, bloqueando a liberação dos neurotransmissores e da transmissão da dor em diversas vias neuronais (MACHELSKA, 2007). Essa redução da excitabilidade neuronal - é responsável pela ação antinociceptiva dos seus agonistas, como a morfina (LAW; WONG; LOH, 2000).
O uso de fármacos opióides, como a morfina, no tratamento de quadros de dor é limitado pelos diversos efeitos indesejados, além do que o uso prolongado pode ocasionar tolerância com consequente redução da analgesia em uma dose fixa. Além disso, a suspensão abrupta de seu uso, acarreta em síndrome de abstinência (McDONALD; LAMBERT, 2009; MIZOGUCHI, et al., 2012).
Outros tipos de receptores estão envolvidos no processo de analgesia, sendo tais receptores responsivos ao tratamento com opióides, tais como, os serotoninérgicos, GABAérgicos, glutamatérgicos e adrenérgicos (PINTO, 2000; STEIN et al., 2009).
2.5. Considerações gerais sobre inflamação
A inflamação é classicamente definida como uma resposta desencadeada por traumas, lesões teciduais e invasão por agentes infecciosos, com a finalidade de eliminar micro-organismos ou outros agentes irritantes e reparar danos teciduais ou perda de função (FLOWER; PERRETTI, 2005).
A resposta inflamatória está associada a uma grande diversidade de mediadores que iniciam respostas inflamatórias, recrutam e ativam outras células para o sítio da inflamação na tentativa de resolver o processo inflamatório (RITTNER; BRACK; STEIN, 2008). Estes mesmos mediadores são responsáveis por desencadear os sinais característicos desse processo: dor, calor, rubor e edema, acompanhados ou não, da perda de função do tecido ou órgão afetado (SERHAN, 2010).
O processo inflamatório pode ser classificado como agudo ou crônico, de acordo com o tempo de duração e características patológicas.
Na fase aguda a duração é relativamente curta - minutos, horas ou alguns dias, sendo mediada por substâncias como NO e PG, tais como PGI2, PGD2, PGE2 e PGFβα. Caracteriza-se por vasodilatação, exsudação de líquido (plasma), infiltração
de células polimorfonucleares (neutrófilos) seguido por monócitos que se diferenciam em macrófagos e finalmente os fibroblastos que se proliferam podendo restabelecer a estrutura do tecido lesado (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Este tipo de inflamação é normalmente benéfica para o hospedeiro, capaz de erradicar o estímulo nocivo inicial (POBER; SESSA, 2007; GRIVENNIKOV; GRETEN; KARIN, 2010).
A formação do edema é um sinal precoce e importante na inflamação aguda, que ocorre devido ao fluxo transvascular de fluído rico em proteínas (plasma), dos compartimentos intravasculares para o interstício, em decorrência do aumento de permeabilidade vascular de capilares e vênulas, como resultado da liberação de histamina, bradicinina, fatores do complemento, SP e fator de agregação plaquetária (PAF) no sítio inflamatório (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
fluido para o tecido. Concomitantemente, as citocinas como o Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e a Interleucina 1 (IL-1) liberados por células teciduais, principalmente por macrófagos, ativam vias de sinalização em células endoteliais que regulam a expressão de moléculas de adesão, como as selectinas, molécula de adesão das células vasculares 1 (VCAM) e integrinas leucocitárias para que ocorra o processo de migração celular (LAWRENCE; WILLOUGHBY; GILROY, 2002; SIMMONS, 2006).
A inflamação aguda pode ser finalizada com a resolução de todos os eventos característicos da reação inflamatória e retorno do tecido lesionado à normalidade ou sua substituição por tecido conjuntivo (GILROY et al., 2004; ADEREM; SMITH, 2004). A progressão da resposta tecidual para inflamação crônica caracteriza-se por infiltração de células mononucleares, que incluem macrófagos, linfócitos e plasmócitos.
O processo inflamatório crônico é de maior duração, estendendo-se de semanas a meses, e está associado histologicamente à presença de linfocitose e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos e as tentativas de reparo tecidual com consequente destruição do tecido e a formação de fibrose e necrose tecidual (FUJIWARA; KOBAYASHI, 2005). Entre as doenças crônicas inflamatórias incluem-se a artrite reumatóide, a ateroscleroincluem-se e o lupus eritematoso sistêmico (GILROY et al., 2004; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
2.5.1. Mediadores inflamatórios
em vários tecidos-alvo para provocar mudanças em seus estados funcionais que otimizam a adaptação à condição nocivos (por exemplo, infecção ou lesão tecidual) (MEDZHITOV, 2010).
Figura 7 - Componentes do processo inflamatório.
Fonte: Modificado de MEDZHITOV, 2010.
Os componentes básicos de um processo inflamatório envolvem eventos vasculares e celulares, mediadores derivados de células e da ativação plasmática, que produzem os sinais clínicos clássicos da inflamação (GILROY et al., 2004).
Os eventos vasculares ocorrem em resposta à ação dos mediadores inflamatórios. Iniciam-se imediatamente e desenvolvem-se durante as primeiras horas após o estímulo inflamatório. Eles induzem a produção de mediadores, como as aminas vasoativas, os peptídeos vasoativos, os fragmentos de componentes do complemento, os mediadores lipídicos, as citocinas, as quimiocinas e as enzimas proteolíticas (SERHAN, CHIANG, VAN DYKE, 2008). Todos os mediadores são conhecidos por promover dor pela ativação e/ou sensibilização das fibras aferentes primárias especializadas, ou seja, os nociceptores, e recrutam outros mediadores para exacerbar o sinal de dor (RITTNER; BRACK; STEIN, 2008).
Vamos destacar alguns dos mediadores envolvidos nos processos inflamatórios tais como as citocinas, os eicosanoides e as cininas.
Entre as citocinas mais conhecidas, TNF-α e IL-1 (IL-1α, IL-1 , IL-1Ra e IL-18) são vistas como de suma importância, devido aos seus papéis na patofisiologia de muitas respostas inflamatórias, além de terem um papel regulador sobre o início, a manutenção e o término das reações inflamatórias (EL ALWANI et al., 2006; MORI et al., 2011; SAADANE et al., 2011).
As citocinas IL-1 e TNF-α são as primeiras a serem formadas após o dano tecidual ou infecção, afetando diretamente os receptores específicos dos neurônios sensoriais (de OLIVEIRA et al., 2011). Em torno de 01 hora após o inicio da cascata inflamatória, estas citocinas são secretadas em grandes quantidades principalmente pelos macrófagos e aparecem na circulação e apresentam efeitos locais e sistêmicos (EL ALWANI et al., 2006).
A citocina TNF-α é produzida por células polimorfonucleares e mononucleares, exercendo potentes efeitos inflamatórios, tais como, indução da expressão endotelial de moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM-1 (EL ALWANI et al., 2006), ativação de neutrófilos e fagócitos mononucleares, aumento da permeabilidade vascular, além de atuar como um fator de crescimento para fibroblastos e angiogênese (LAWRENCE; WILLOUGHBY; GILROY, 2002; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).
As respostas biológicas, decorrentes da ação de TNF-α, envolvem as vias de sinalização intracelulares por meio dos membros da família de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK), fator nuclear-kB (NF-kB) e p38 que levam à síntese de TNF-α, dentre outras citocinas (EL ALWANI et al., 2006). Promove a liberação do NF-kB no citosol, que por sua vez regula a síntese de proteínas que funcionam em vias inflamatórias, incluindo IL-1, INF- , TNF-α e as ciclo-oxigenases (EL ALWANI et al., 2006; SUN, 2011; ZHENG et al., 2011).
A liberação sistêmica de TNF-α pode, entretanto, precipitar uma cascata destrutiva de eventos que resultam em lesão tecidual, disfunção orgânica e, potencialmente, morte. Entre seus efeitos sistêmicos está a indução de febre, estimulação da secreção de proteínas de fase aguda pelo fígado, ativação da cascata de coagulação dentre outros (SHERWOOD;TOLIVER-KINSKY, 2004).
inúmeros cenários inflamatórios (WAGNER e ROTH, 2000; EL ALWANI et al., 2006). Seus efeitos fisiológicos são essencialmente, idênticos aos do TNF-α, entretanto, a IL-1 não induz, por si só, lesão tecidual ou morte apoptótica, embora possa intensificar os efeitos lesivos do TNF-α (WAGNER; ROTH, 2000; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; EL ALWANI et al., 2006).
A IL-1 , IL-6, IL-8 e TNF-α, são capazes de induzir hiperalgesia mediada indiretamente através de diversos mecanismos, incluindo liberação de prostaglandinas, elevação na expressão do fator de crescimento neural ou de receptores da bradicinina, ou ainda por afetar as fibras simpáticas (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998).
A IL-1 , TNF-α e IL-6 possuem efeitos sistêmicos quando secretadas em quantidades suficientes. Essas citocinas também são responsáveis por induzir as enzimas ciclo-oxigenases e lipoxigenases na formação de seus produtos (GÓMEZ ESTRADA; GONZÁLEZ RUIZ; MEDINA, 2011).
Os eicosanóides são mediadores lipídicos que compreendem os prostanóides, leucotrienos (LTs) e lipoxinas, todos derivados do metabolismo do ácido araquidônico (AA), que é um ácido graxo poli-insaturado presente esterificado nos fosfolipídios de membrana celular. Após a ativação por íons Ca+2 intracelular, a fosfolipase A2 citosólica gera o AA a partir da fosfatidilcolina. O AA é metabolizado em eicosanóides por ciclo-oxigenases (COX-1 e COX-2), que geram prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXA), ou por lipoxigenases, que geram leucotrienos (LTs) e lipoxinas (LXA) (SERHAN, 2010) (FIG. 9). Os eicosanóides estão envolvidos em vários processos fisiológicos e estão entre os mais importantes mediadores e moduladores da reação inflamatória (RANG et al ., 2007).
Figura 8 - Biossíntese de eicosanóides e seus receptores.
Fonte: Modificado de RAHNAMA et al., 2012.
A prostaglandina E2 (PGE2) modula vários eventos inflamatórios e imunes, como o aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação, contribuindo assim na formação do edema, na adesão e diapedese dos neutrófilos e monócitos das células natural Killer e macrófagos (ARA; TEICHER, 1996).
seja, é um importante vasodilatador intrínseco, sendo assim o eicosanóide predominantemente detectado em processos inflamatórios (ARA; TEICHER, 1996; VANEGAS; SCHAIBLE, 2001).
Altos níveis de PGE2 são encontrados em exsudatos inflamatórios e a injeção de PGE2 diretamente dentro do tecido, produz uma série de sinais clássicos da inflamação (WILLIAMS; HIGGS, 1988; LAWRENCE; WILLOUGHBY; GILROY, 2002). Interessantemente, existe uma série de estudos que sugerem que a PGE2 atua sinergicamente com outros mediadores, como a histamina e bradicinina, especialmente na dor e edema associados aos processos inflamatórios (WILLIAMS e HIGGS, 1988; ARMSTRONG et al., 1995; LAWRENCE; WILLOUGHBY; GILROY, 2002).
Em conjunto, essas evidências mostram o importante papel exercido pela enzima COX-2 e pela produção de PGE2 nos processos inflamatórios periféricos. A PGE2 exerce sua ação através de receptores específicos na membrana plasmática, chamados de receptores prostanóides e são divididos em quatro subtipos: EP1, EP2, EP3, e EP4 e se enquadram à categoria de receptores acoplados a proteína G (GPCRs). A ativação dos receptores EP pela PGE2 pode estimular a PKA, PKC e as proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs) (COLEMAN; SMITH; NARUMIYA, 1994; CLAUDINO, et al., 2006; ZEILHOFER, 2007, STEIN et al., 2009).
As cininas, bradicinina e calidina, constituem peptídeos formados no plasma e em tecidos periféricos em resposta a ativação de enzimas denominadas calicreínas, atuando em substratos cininogênios (MOREAU, et al., 2005).
Além de tecidos periféricos, a bradicinina exerce atividades fisiológicas no SNC (WALKER et al., 1995) . Uma vez formada na periferia, a bradicinina ativa fibras Aδ e C nos nervos sensoriais, produzindo dor, hiperalgesia ou alodinia, tanto em humanos quanto em modelos experimentais (WALKER et al., 1995).
Em virtude das importantes funções da bradicinina na patogênese da dor inflamatória, foram, desenvolvidos e testados, recentemente os antagonistas do receptor B2 da bradicinina, apresentando promissores resultados como agentes analgésicos e anti-inflamatórios em modelos animais. Entre estes, destacam-se principalmente o NPC16731, NPC567, HOE140, CPO127 e WIN64338. Antagonistas do receptor B1 tem sido também desenvolvidos com atividade analgésica em hiperalgesia crônica (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998).
Os mediadores inflamatórios são divididos em dois grupos igualmente importantes na transmissão nociceptiva: aqueles que promovem uma sensibilização dos nociceptores (hiperalgesia) como as citocinas e as prostaglandinas, e os que ativam os nociceptores sensibilizados como as cininas (bradicinina) e os neuropeptídeos (SP, NKA e CGRP) (MILLAN, 1999; CALIXTO et al., 2000).
2.6.Considerações gerais sobre óleos essenciais
Os óleos essenciais (OEs), também conhecidos como óleos voláteis ou óleos éteros, são extraídos de plantas aromáticas geralmente encontradas em países de clima temperado e tropical (BAKKALI et al., 2008). São produtos de origem natural, com misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, com aroma acentuado e líquido, podendo ser obtidos de todas as partes das plantas, como botões, flores, folhas, caules, ramos, sementes, frutos, raízes ou cascas (REGNAULT-ROGER; VINCENT; ARNASON, 2012; BAKKALI et al., 2008).
Em temperatura ambiente apresentam-se como substância líquida oleosa e bastante volátil, sendo esta última, a particularidade que o diferencia de óleos fixos, mistura de substâncias lipídicas obtidos geralmente de sementes (SIMÕES; SPITZER, 2004).
Os OEs são produtos naturais produzidos como metabólitos secundários de plantas aromáticas. São constituídos, principalmente, por compostos terpênicos, cuja origem biossintética ocorre a partir de unidades do isopreno que, por sua vez, origina-se a partir do ácido mevalônico (BAKKALI et al., 2008).
Estes óleos são misturas complexas naturais que podem conter de 20 a 60 componentes diferentes e normalmente, ocorre a predominância de dois ou três componentes em maiores concentrações (BAKKALI et al., 2008). Os compostos terpênicos majoritários nos OEs são os monoterpenos (cerca de 90% dos OEs) (DE SOUSA, 2011; MACHADO; FERNANDES JUNIOR, 2011). Apresentam duas unidades isoprênicas e 10 átomos de carbono, e os sesquiterpenos, com três unidades isoprênicas e 15 átomos de carbono (SIANI et al., 2000; BAKKALI et al., 2008).
Dentre estes, os monoterpenos ainda podem ser divididos em três subgrupos (SIMÕES; SPITZER, 2004): acíclicos (mirceno, linalol e geraniol); monocíclicos (α-terpineol, terpinoleno, mirtenol); e, bicíclicos (α-pineno, tujona, cânfora e fenchona). Em cada um desses subgrupos, há ainda outras classificações: hidrocarbonetos insaturados (limoneno), álcoois (mentol, linalol), aldeídos ou cetonas (mentona e carvona), lactonas (nepelactona) e tropolonas ( -tujaplicina).
como o medicinal, bactericida, fungicida, antiparasitário, antiviral, inseticida, e condimentar (BAKKALI et al., 2008).
Os OEs são conhecidos por apresentarem diversas atividades no SNC, como a analgésica (ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001; BAKKALI et al., 2008), ansiolítica (ALMEIDA et al., 2004), antidepressiva (VICTORY; BRAHM; SAVEGNAGO, 2013), anticonvulsivante (NÓBREGA, 2012; DE SOUSA et al., 2006a), e também por serem utilizados na aromaterapia, para induzir tranquilidade mental ou relaxamento, e para induzir o sono em humanos (DE SOUSA et al., 2006b).
2.6.1. (-)- Mirtenol
O (-)- mirtenol é um monoterpeno álcool cíclico (FIG. 9), de aroma agradável, que se apresenta como um líquido quase incolor, com fórmula molecular C10H16O e peso molecular 152,24 g/mol (BHATIA et al., 2008).
Figura 9 - Estrutura química do (-)- mirtenol.
O (-)- mirtenol é encontrado em diversas espécies de plantas aromáticas em diferentes proporções. Listamos abaixo algumas das famílias e espécies que este monoterpeno pode ser encontrado:
Asteraceae: Achillea ligustica All., (MAGGI et al., 2009)
