Construção de bibliotecas funcionais

3.3.4.1 Clonagem dos fragmentos amplificados

Depois do processo de purificação, 3 µ L dos amplicons obtidos para cada solo TPI e ADJ foram quantificados em gel de agarose a 1 % com o marcador Low Mass DNA Ladder™ (Invitrogen Life Technologies), para determinação da quantidade de inserto a ser utilizada na ligação com o vetor. A clonagem dos fragmentos foi feita utilizando-se células de E. coli quimio-competentes e o kit de clonagem pGEM-T Easy Vector System (Promega), conforme as instruções do fabricante.

A reação de ligação inserto-vetor foi feita a 4°C, por 12 horas, e posteriormente armazenada a -20°C.

Três microlitros da ligação (aproximadamente 10 ng do inserto) foram utilizados para transformar 50 µL de células quimio-competentes da linhagem de E. coli DH5α. A quimio-transformação foi realizada adicionando-se os tubos contendo as células competentes, juntamente com os produtos da ligação em banho de gelo por 30 minutos. Em seguida, os tubos foram transferidos para banho-maria a 42 °C por 50 segundos e retornados ao banho de gelo por mais 2 minutos. Após a transformação, as células foram recuperadas em 450 µL de meio Luria Bertani-LB líquido (Triptona 10 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1 e NaCl 5 g.L-1) e incubadas sob agitação a 37 °C por duas horas.

Em seguida, o volume total das células transformadas foi inoculado por espalhamento em placas de ágar Luria Bertani-LB (Triptona 10 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1 e NaCl 5 g.L-1), contendo ampicilina, IPTG e X-Gal (estoques a 100 mg.mL-1), e incubadas a 37 °C por 16 horas.

O vetor utilizado possui o sistema de expressão gênica induzido pelo IPTG e sinalizado pelo indicador X-Gal (beta galactosidase); assim, os clones que recebem o inserto ligado ao vetor transformado apresentam coloração branca e os demais, sem o fragmento apresentam coloração azul (indicando a expressão do gene lacZ). Desta forma, as colônias brancas, correspondentes aos possíveis clones positivos, foram transferidas individualmente para placas de 96 poços contendo 50 µL de tampão TE 1X, com o auxílio de palitos de madeira autoclavados. Estas placas foram então submetidas à temperatura de 95 °C por 10 minutos em termociclador, para promover a lise celular, e armazenadas a -20 °C, para futuras aplicações. Foram selecionadas 100 colônias de cada sítio de totalizando 400 clones, para posterior sequenciamento dos mesmos.

3.3.4.2 Detecção do inserto nos clones e preparo das sequências para sequenciamento

Após a clonagem e seleção das colônias brancas, a confirmação da presença do inserto foi realizada através da amplificação direta a partir do inserto diluído em TE 1X com os

primers do vetor (promotores SP6 e T7), sem a necessidade de extração do DNA plasmidial.

O "mix" de PCR foi preparado contendo: tampão 1X (20 mM Tris/HCI, pH 8,4;

50 mM KC1), 1,5 mM de MgC12, 0,1 mM de dNTPs, 5 pmol.reação-1 de cada primer (SP6 e

ultra-pura para volume final de 50 µL. O programa de amplificação consistiu de um ciclo de desnaturação inicial a 94 °C por 4 minutos, 30 ciclos de 94° C por 1 minuto, 50 °C por 30 segundos e 72 °C por 2 minutos, além de um ciclo de extensão final de 72 °C por 10 minutos. Os fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1 %, com

padrão de peso molecular Low DNA Mass Ladder™ (Invitrogen Life Technologies).

Em seguida, os amplicons foram submetidos à purificação em placas de 96 poços, onde foram adicionados 135 μL (3 volumes) de isopropanol 100 % e 45 μL (1 volume) de água ultra-pura (Milli-Q), e a mistura foi homogeneizada e incubada a -20 °C por 12 horas.

Após incubação, as placas foram centrifugadas a 4000 rpm por 90 minutos a temperatura ambiente, e o sobrenadante foi totalmente descartado por inversão da placa.

Adicionou-se 150 μL de etanol 70 % e as placas foram novamente homogeneizadas e

centrifugadas a 4000 rpm por 90 minutos à temperatura ambiente; o sobrenadante foi novamente descartado.

Finalmente, as amostras foram colocadas no concentrador de DNA por 10 minutos, e

seguiu-se a eluição em 15 μL de água ultra-pura (Milli-Q). A pureza do material foi

novamente verificada em gel de agarose a 1 %.

Para o sequenciamento, 5 μL do produto purificado (aproximadamente 20 ng) foi

utilizado na reação de amplificação com o DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing

Kit (GE Healthcare) conforme instruções do fabricante, e utilizou-se os primers BPHD F1

para amplificação da sequência-alvo.

As reações de sequenciamento foram purificadas adicionando-se 2 μL de uma solução

de acetato de sódio a 1,5 M, EDTA a 0,25 M e, após homogeneização, adicionou-se 60 μL de

etanol a 100 %. As amostras foram centrifugadas a 4.000 rpm por 45 minutos em temperatura

ambiente, e o sobrenadante foi descartado por inversão da placa. Adicionou-se 150 μL de

etanol a 70 %, a mistura foi homogeneizada e centrifugada a 4.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e os precipitados foram colocados no concentrador de

DNA por 10 min. Em seguida, os produtos foram eluídos em 10 μL de formamida e

3.3.4.3 Análise das sequências e medidas de diversidade

A análise das sequências foi feita com base nos eletroferogramas gerados pelo software Sequencing Analysis 3.0. As sequências nucleotídicas obtidas tiveram seus cromatogramas analisados pelo script Lucy presente no pipeline do RDP, o qual realizou a edição e remoção do primer, a fim de estabelecer as sequências e remover as bases com baixa qualidade. O nível de exigência mínimo foi de 400 bases com qualidade acima de 20 (um erro a cada 100 bases lidas).

Em seguida, as sequências foram comparadas com aquelas disponibilizadas no banco de dados GenBank do Centro de Informação Biotecnológica (NCBI, USA), utilizando-se a ferramenta tblastx (ALTSCHUL et al., 1990).

A ferramenta tblastx, disponível no NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), compara sequências nucleotídicas obtidas por sequenciamento com o banco de proteínas traduzidas disponível no GenBank. Para tal, as sequências de nucleotídeos são traduzidas in silico pelo software conforme as sequências de códons que codificam os aminoácidos correspondentes, e então compara uma a uma com aquelas já depositadas.

Para a análise das medidas de diversidade das bibliotecas do gene bph de bacteria obtidas para os diferentes sítios de TPI estudados e os respectivos solos adjacentes, utilizou-se o programa MOTHUR (SCHLOSS et al., 2009). A plataforma MOTHUR constitui um software abrangente, que permite aos usuários utilizar um único programa para analisar os dados de sequências de comunidades. Este pacote baseia-se em ferramentas anteriores (DOTUR, SONS, TreeClimber, LIBSHUFF, ∫-Libshuff e UniFrac) para fornecer um software flexível e robusto para análise de dados de sequenciamento.

O número de Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs) foi determinado considerando-se uma distância evolutiva (cut-off) de 0,06. A riqueza de UTOs foi estimada mediante o cálculo de curvas de rarefação e dos estimadores ACE, Chao1 e Jackknife, e a heterogeneidade das comunidades de bph foi verificada com os índices de Shannon e Simpson. Comparações assimétricas pareadas entre diferentes bibliotecas também foram realizadas para determinar a significância das diferenças entre elas, por meio do software ∫- Libshuff (SCHLOSS et al., 2004), integrado na plataforma MOTHUR.

Métodos paramétricos e não paramétricos têm sido utilizados para estimar a riqueza de espécies (filotipos) em comunidades microbianas de amostras ambientais (BOHANNAN; HUGHES, 2003; SHEN et al., 2003; CHAO et al., 2006). Estimativas do aumento de filotipos em função do número de sequências de um determinado nível filogenético podem ser analisadas pelo método da rarefação, que reflete o esforço amostral da análise de um experimento. Outros métodos são utilizados para estimar a riqueza de filotipos de uma determinada comunidade, assim como o estimador de riqueza Jackknife, que se baseia na frequência de espécies raras observadas na amostra. Também pode se utilizar métodos não- paramétricos, como o estimador Chao1, capaz de produzir estimativas que também variam com o número de sequências. Também foi determinado neste estudo o estimador de riqueza

ACE, baseado no conceito de cobertura de amostra.

Em 1949, Simpson propôs a primeira medida não-paramétrica para analisar a diversidade, a qual considerava que a diversidade é inversamente reportada pela probabilidade de dois indivíduos escolhidos ao acaso pertencerem à mesma espécie. Entretanto, a medida mais utilizada para estimar a diversidade de espécies é o índice de Shannon (H’) (SHANNON; WEANER, 1949), que se baseia na teoria da informação, e é considerada uma medida da incerteza de que duas sequências pertençam ao mesmo filotipo ou espécie (KREBS, 1998).

Para verificar UTOs únicas para cada solo, e aquelas que se encontravam em mais de um solo, foram construídos Diagramas de Venn (FAUTH et al., 1996) .

Por fim a partir do agrupamento das sequências dos clones baseado na similaridade de 94 % entre as sequências do mesmo grupo (cut-off 0,06), foram escolhidas uma representante de cada UTO para as construções filogenéticas. O alinhamento foi realizado no programa ClustalW (LARKIN et al., 2007) e os agrupamentos filogenéticos foram construídos no programa MEGA 5.0 (TAMURA et al., 2007), pelo método de Maximum-likelihood com valor de bootstrap (reamostragem) de 500 repetições.