3. MATERIAL E MÉTODOS
4.4. Contagem de células somáticas e qualidade microbiológica das amostras de leite
Em relação à contagem de células somáticas no leite cru, constatou-se que todas as amostras avaliadas apresentaram valores superiores (Tabela 5) ao limite máximo de 5,69 log CCS.mL-1 estabelecido por Brasil (2011). Costa (2014) constatou que 45,6% das amostras de leite cru granelizado avaliadas no município de Rio Pomba, MG, não atenderam ao limite estabelecido pela legislação. O aumento das células somáticas ocorre quando a vaca tem infecção no úbere, mastite, e é inversamente relacionado com a sua produtividade. Além disso, a elevada CCS no leite pode desencadear várias alterações composicionais, inclusive com o aumento da proteólise em consequência do aumento do percentual de plasmina no leite (HACHANA; KRAIEM; PAAPE, 2010).
Em relação à Contagem bacteriana total (CBT), constatou-se que os valores variaram de 6,80 log CBT.mL-1 a 6,91 log CBT.mL-1 apresentando valores superiores (Tabela 5; Figura 6A) ao limite máximo de 3,0 x 105 CBT.mL-1 (5,48 log CBT.mL-1) conforme estabelecido por Brasil
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(2011). Altas contagens de micro-organismos no leite cru compromete a qualidade deste alimento para o processamento devido a sua ação deterioradora.
Tabela 5. Resultados médios (n=2) da contagem de células somáticas do leite cru e da contagem bacteriana total do leite cru, mesófilos aeróbios dos leites pasteurizado e UHT, psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos do leite cru e pasteurizado e de esporulados mesófilos do leite cru, pasteurizado e UHT
Contagem Estação do
ano Cru Pasteurizado UHT
Células somáticas (log CCS.mL-1 ) Inverno 5,80±0,02a - - Primavera 5,69±0,09a - - Verão 5,81±0,07a - - Outono 5,80±0,09a - - Média 5,79±0,08a - -
Bacteriana total do leite cru (log CBT.mL-1) e de mesófilos aeróbios do leite pasteurizado e UHT (log UFC.mL-1)
Inverno 6,80±0,25a 4,18±0,00a 0,00 Primavera 6,93±0,16a 4,55±0,06ab 0,00 Verão 6,97±0,09a 4,92±0,03b 0,00 Outono 6,91±0,01a 4,68±0,03ab 0,00
Média 6,90±0,0139A 4,58±0,313B 0,00C
Psicrotróficos (log UFC.mL-1)
Inverno 7,02±0,12a 1,24±1,75a - Primavera 7,51±0,24a 2,85±4,03a - Verão 7,41±0,68a 4,75±0,21a - Outono 6,74±0,24a 1,74±2,46a - Média 7,17±0,44A 2,64±2,39B -
Psicrotróficos proteolíticos (log UFC.mL-1)
Inverno 6,35±0,09a 0,86±1,21a - Primavera 6,76±0,22a 2,26±3,19a - Verão 6,68±0,24a 4,10±0,48a - Outono 6,27±0,57a 1,60±2,26a - Média 6,51±0,34A 2,20±2,022B -
Esporulados mesófilos (log UFC.mL-1)
Inverno 2,48±0,00a 2,09±0,78a 0,00 Primavera 3,91±0,00a 2,56±1,95a 0,00 Verão 2,43±0,19a 1,32±1,87a 0,00 Outono 2,77±1,08a 2,10±0,71a 0,00 Média 2,90±0,76A 2,01±1,19A 0,00B Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, respectivamente, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05); (-) Análise não realizada.
Após a pasteurização do leite, constatou-se que a contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios variou entre 4,0 e 5,0 log UFC.mL-1 (Tabela 5 e Figura 6A), estando 50% das amostras acima do padrão estabelecido pela legislação que é de 4,0 x 104 UFC.mL-1 (BRASIL,
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2011). Constatou-se ainda que o tratamento térmico de pasteurização reduziu em média 2,3 ciclos logarítmicos desta microbiota (Tabela 5), sendo o ideal a redução de, aproximadamente, 4 ciclos logarítmicos. A contagem elevada de mesófilos aeróbios após este tratamento térmico pode indicar uma provável pós-contaminação devido à ineficiência do processo de higienização adotado pela indústria, ou devido à presença de micro-organismos termodúricos. Entretanto, após o tratamento térmico UHT ocorreu a eliminação desta microbiota (Tabela 5).
Nas amostras de leite cru as contagens médias de micro-organismos psicrotróficos variou entre 6,74 e 7,51 log UFC.mL-1 (Tabela 5; Figura 6B) enquanto as contagens de psicrotróficos proteolíticos entre 6,27 a 6,76 log UFC.mL-1 (Tabela 5; Figura 6C). Apesar destas contagens estarem acima do recomendado, não foi verificado no presente trabalho alteração na viscosidade do leite UHT no decorrer do armazenamento. Entretanto, tem sido demonstrado que é inviável a produção de leite UHT e queijos a partir de leite cru que possua contagens de micro-organismos psicrotróficos superiores a 106 UFC.mL-1, bem como quando a contagem de micro-organismos psicrotróficos proteolíticos seja superior a 104 UFC.mL-1 devido a presença de enzimas proteolíticas em concentração suficiente para comprometer a integridade da micela de caseína (PINTO, 2004; PINTO et al., 2014), o que pode desencadear a sedimentação, geleificação, bem como o desenvolvimento de sabores indesejáveis no leite UHT, além de perda de peptídeos no soro, com consequente perda de rendimento na produção de queijos.
Verificou-se também que 90% dos micro-organismos psicrotróficos do leite cru eram proteolíticos (Tabela 5). A contagem de psicrotróficos e de psicrotróficos proteolíticos após o tratamento térmico de pasteurização reduziu em média 4,53 e 4,31 ciclos logarítmicos, respectivamente.
A contagem média de micro-organismos esporulados mesófilos nas amostras de leite cru foi de 2,90 log UFC.mL-1 e nas amostras de leite pasteurizado 2,01 log UFC.mL-1 (Tabela 5) não diferindo significativamente. Ressalta-se que esta microbiota é termodúrica e, portanto, resiste à pasteurização. No leite UHT não foi constatada contagem deste grupo microbiano em nenhuma das amostras (Tabela 5; Figura 6D), o que demonstra a eficiência do binômio tempo temperatura adotado pelo laticínios parceiro. Em contrapartida, Souza et al. (2014) constatou contagem de bactérias mesofílicas aeróbias acima de 102 UFC.mL-1 em alto percentual 7/20 (35%) de marcas de leite UHT integral comercializadas na Zona da Mata Mineira.
30 Inverno Primavera Verão Outono
Estação do ano 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Co n tag em d e m es ó fi lo s: l ei te cr u ( L o g CT B. m L -1), p as teu ri zad o e U H T ( L o g U F C. m L -1) F(6, 12)=3,04 p=0,047 Cru Pasteurizado UHT
Inverno Primavera Verão Outono
Estação do ano -2,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 P si cr o tr ó fi co s (L o g U F C. m L -1) Cru Pasteurizado UHT F(6, 12)=0,66 p=0,679
Inverno Primavera Verão Outono
Estação do ano -2,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 P si cr o tr ó fi co s p ro teo lí ti co s (L o g U F C. m L -1) F(6, 12)=0,80 p=0,58 Cru Pasteurizado UHT
Inverno Primavera Verão Outono
Estação do ano -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 E sp o ru lad o s m es ó fi lo s (L o g U F C. m L -1) F(6, 12)=0,38 p=0,875 Cru Pasteurizado UHT
Figura 6. Valores médios de CBT do leite cru e da contagem padrão em placas de mesófilos aeróbios do leite pasteurizado e UHT (A), da contagem padrão em placas de psicrotróficos (B), psicrotróficos proteolíticos (C) e esporulados mesófilos (D) do leite cru, pasteurizado e UHT nas estações do ano.
A B
D C
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A contagem média de micro-organismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos no leite pasteurizado foi semelhante à contagem de esporulados mesófilos nas amostras de leite cru e pasteurizado, o que indica que estas bactérias esporuladas são, predominantemente, psicrotróficas e proteolíticas. A contaminação do leite por micro-organismos esporulados pode ocorrer na propriedade produtora ou na indústria processadora. Esta microbiota geralmente é veiculada ao leite a partir do solo, pastagem e silagem (TE GIFFEL et al., 2002; CARLIN, 2011).
Em relação à contagem padrão de micro-organismos aeróbios mesófilos, todas as amostras de leite UHT (Figura 6A) atenderam os padrões legais vigentes (BRASIL, 1997), que estabelece uma contagem máxima de 1,0 x 102 UFC.mL-1 de bactérias mesofílicas em leite UHT. A presença de micro-organismos mesófilos aeróbios no leite UHT pode se relacionar a problemas no processamento térmico, contaminação durante e, ou pós-processamento e a problemas na integridade das embalagens utilizadas no armazenamento deste leite (BOOR; MURPHY, 2002; SOUZA et al., 2014).
Alguns micro-organismos esporulados podem sobreviver ao tratamento térmico apesar do processo UHT eliminar as células bacterianas vegetativas. Sendo assim, o leite UHT nem sempre é um produto livre de contaminações, podendo, portanto, sofrer deterioração. A baixa qualidade microbiológica deste leite, além de ser um problema relacionado às questões de saúde pública pode alterar as características sensoriais e a vida útil deste alimento.
Bactérias do gênero Bacillus são comumente encontradas no leite UHT, inclusive B. sporothermodurans, que é resistente a este processamento, porém não é patogênico e pode estar presente no leite sem modificar as características físico-químicas no produto no decorrer do seu prazo de validade. Micro-organismos desses gêneros são de origem ambiental e apresentam capacidade de formação de esporos. Os esporos são ainda resistentes a radiações ionizantes, compostos químicos, desidratação e congelamento (FRANCO; LANDGRAF, 2005).
4.5. Proteólise e atividade proteolítica
Os resultados para o grau de proteólise empregando o método de Hull e o kit comercial (Tabela 6) foram similares aos obtidos por Costa (2014), ao avaliar leite cru refrigerado granelizado do munícipio de Rio Pomba, MG. Este autor constatou que quando o leite
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apresentava acima de 0,265 mg.mL-1 de tirosina detectada pelo método proposto por Hull (1947), as amostras tendiam a apresentar instabilidade ao teste do álcool 72 °GL. No presente trabalho, nenhuma amostra de leite cru, pasteurizado e UHT até 60 dias de armazenamento a temperatura ambiente apresentou valor acima de 0,265 mg.mL-1 de tirosina. Estes valores foram encontrados somente nas amostras de leite UHT armazenadas por 120 dias, no entanto, não foi detectada instabilidade térmica em nenhuma delas.
Tabela 6. Resultados médios (n=2) do grau de proteólise determinado pelo método de Hull (mg de tirosina.5 mL-1) e determinado pelo kit comercial (mg de tirosina mucoproteica.5 mL-1) e atividade proteolítica (UEP.hora-1)
Proteólise Estação
do ano Cru Pasteurizado
UHT
Tempo 0 Tempo 60 Tempo 120
Grau de proteólise - método de Hull
Inverno 0,195±0,110a 0,193±0,029a 0,172±0,047a 0,220±0,049a 0,349±0,022a Primavera 0,167±0,015a 0,133±0,068a 0,115±0,030a 0,172±0,037a 0,373±0,036a Verão 0,229±0,078a 0,200±0,047a 0,215±0,011a 0,254±0,027a 0,363±0,032a Outono 0,189±0,004a 0,165±0,021a 0,175±0,016a 0,225±0,018a 0,290±0,007a Média 0,195±0,057A 0,172±0,044 A 0,169±0,044A 0,218±0,041A 0,343±0,040 B Grau de
proteólise - método comercial
Inverno 0,417±0,242a 0,321±0,168a 0,112±0,071a 0,273±0,153a 0,266±0,098a Primavera 0,373±0,220a 0,457±0,411a 0,175±0,116a 0,107±0,033a 0,197±0,054a Verão 0,290±0,078a 0,242±0,011a 0,130±0,042a 0,186±0,061a 0,215±0,042a Outono 0,397±0,011a 0,224±0,020a 0,082±0,006a 0,116±0,008a 0,172±0,009a
Média 0,369±0,137A 0,311±0,194AB 0,125±0,065C 0,170±0,095BC 0,212±0,059ABC
Atividade proteolítica
Inverno 0,690±0,391a 1,111±0,300a 0,834±0,061a 1,168±0,060a 1,273±0,039a Primavera 0,546±0,041a 2,127±1,767a 0,801±0,023a 1,055±0,255a 1,337±0,443a Verão 0,750±0,245a 1,215±0,262a 0,666±0,329a 0,906±0,083a 1,041±0,008a Outono 0,693±0,046a 1,028±0,117a 0,579±0,062a 0,950±0,007 a 1,043±0,008a Média 0,669±0,193A 1,3700±0,059B 0,720±0,191A 1,020±0,150AB 1,173±0,221AB Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, respectivamente, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05).
Ainda segundo Costa (2014), as amostras que possuíam contagem bacteriana total acima de 6,04 log CBT.mL-1 apresentaram um aumento de 665% para que estas fossem consideradas como instáveis ao teste do álcool 72% v/v, em relação as outras amostras analisadas que possuíam valores menores ou iguais a 6,03 log CBT.mL-1. Segundo Pinto et al. (2014), há uma associação entre o número de micro-organismos, grau de proteólise e o tempo de estocagem do leite e a perda de estabilidade térmica. Amostras com população microbiana superior a 7,0 log
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UFC.mL-1 foram mais susceptíveis à instabilidade térmica durante o aquecimento a 72,0 ºC, por 15 segundos (PINTO et al., 2014).
Constatou-se maior atividade proteolítica no leite pasteurizado comparado ao leite cru (Tabela 6). Também foi verificado aumento do grau de proteólise e da atividade proteolítica no leite UHT ao longo do período de armazenamento a temperatura ambiente (Tabela 6). Estes resultados são condizentes com os observados para sedimento, uma vez que quanto maior os valores do grau de proteólise e atividade proteolítica maior é instabilidade das proteínas do leite (ZHANG et al., 2015). De acordo com Martins et al. (2015), é importante o estudo da atividade proteolítica dos diferentes isolados de bactérias proteolíticas obtidas de leite cru refrigerado do Brasil, uma vez que há alta diversidade genética entre estes micro-organismos (MARTINS et al., 2003; MARTINS et al., 2006; NÖRNBERG; TONDO; BRANDELLI, 2009) e que a implementação da refrigeração do leite cru na fazenda tem um histórico recente no país.
O grau de proteólise das amostras de leite cru e pasteurizado foi maior quando quantificado pelo kit adquirido comercialmente, o qual detecta tirosina mucoproteica (Figura 7A e B). Entretanto, o método proposto por Hull (1947) apresentou maiores resultados de grau de proteólise quando as amostras avaliadas foram de leite UHT (Figura 7C). Costa (2014) ressaltou a necessidade de mais estudos a fim de implementar o kit comercial como análise de rotina para detecção de estabilidade proteica do leite.
4.6. Correlação entre os atributos de qualidade avaliados nas amostras de leite cru,