CLEITON DE SOUZA BATISTA ESTUDO DE CORRELAÇÃO ENTRE A QUALIDADE DO LEITE CRU REFRIGERADO E DO LEITE UHT INTEGRAL

CLEITON DE SOUZA BATISTA

ESTUDO DE CORRELAÇÃO ENTRE A QUALIDADE DO

LEITE CRU REFRIGERADO E DO LEITE UHT INTEGRAL

Dissertação apresentada ao campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, c o m o r e q u i s i t o p a r c i a l para a conclusão do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre.

RIO POMBA MINAS GERAIS – BRASIL

2015

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CLEITON DE SOUZA BATISTA

ESTUDO DE CORRELAÇÃO ENTRE A QUALIDADE DO

LEITE CRU REFRIGERADO E DO LEITE UHT INTEGRAL

Dissertação apresentada ao campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, c o m o r e q u i s i t o p a r c i a l para a conclusão do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre.

Orientador: MAURILIO LOPES MARTINS

RIO POMBA

MINAS GERAIS – BRASIL 2015

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Dedico este trabalho a minha professora, Antônia, da quarta série primária que mesmo com a minha dificuldade de concentração e aprendizagem acreditou em mim e me incentivou sempre.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, a quem dedico todas as minhas vitórias.

Em memória minha mãe Cidinha, ao meu pai Serafim, pelo exemplo de superação e garra constante em todos os momentos da vida e, principalmente, nas dificuldades.

À minha família em especial aos meus filhos Henrique, Laís e Théo, pois sem eles não teria motivação necessária para a conclusão desta pesquisa.

Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, campus Rio Pomba, pela oportunidade da realização desde o curso Técnico até o mestrado, por disponibilizar a infraestrutura e contribuir para o meu crescimento profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento deste trabalho.

À indústria parceira desta pesquisa, por todo o apoio e disponibilidade, imprescindíveis para que fosse possível o desenvolvimento do estudo.

Ao professor Maurilio Lopes Martins, pela orientação em vários trabalhos, inclusive neste, pelos ensinamentos constantes e total apoio para a realização do curso de mestrado.

À professora Aurélia Dornelas de Oliveira Martins, pela coorientação e pelos ensinamentos.

À pesquisadora Cláudia Lúcia de Oliveira Pinto da Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), pela coorientação e pelos ensinamentos, pela oportunidade de desenvolver trabalhos em parceria e pelo apoio dado.

Às professoras Larissa Mattos Trevizano e Wellingta Cristina Almeida do Nascimento Benevenuto pela disponibilidade de participar da banca e pelas correções do trabalho e sugestões.

Ao professor Roselir Ribeiro da Silva por toda orientação e formação desde meu ensino técnico em Agroindústria, até os conhecimentos de estatística que foram aplicados neste trabalho.

Ao meu grande amigo e parceiro das altas madrugadas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, John Warnes, pelo companheirismo, comprometimento para que este trabalho fosse realizado com tranquilidade e sucesso.

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Aos amigos Pelé, Teresa, Crisley, João Paulo, Zezé e Sr. Paulinho funcionários do laticínios Lindo Vale do campus Rio Pomba pelo carinho e amizade, que foi indispensável a cada instante.

Aos amigos Luana, Renato, Joaquim, Lindolpho e Bárbara pelo companheirismo, sugestões para que este trabalho fosse realizado com foco e determinação.

Aos amigos Andrey, Marcos, José Mario, Silvano e Fabrícia pelo acompanhamento e facilitação da aplicação desta pesquisa no campo industrial.

Ao Professor Paulo Henrique Silva da UFJF, referência na área de leite longa vida no Brasil, pelo incentivo dado por meio da leitura de seus livros e aulas como aluno especial na UFJF.

À todos os professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do campus Rio Pomba.

Ao professor Márcio Roberto Silva, pesquisador da EMBRAPA Gado de Leite, pelas orientações iniciais no estabelecimento dos delineamentos estatísticos a serem aplicados no trabalho.

Aos laboratoristas Jonathan e Rosélio, pelo apoio técnico, que foi de extrema importância para execução do trabalho.

A todos os amigos, companheiros de curso e laboratório, que mesmo não sendo citados aqui, tanto contribuíram para a conclusão desta etapa.

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Se não puder destacar-se pelo talento, vença pelo esforço (Dave Weinbaun).

vii SUMÁRIO

RESUMO... viii

ABSTRACT... . x

LISTA DE FIGURAS... xii

LISTA DE TABELAS... xiii

1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1

2. REVISÃO LITERATURA... 3

3. MATERIAL E MÉTODOS... 10

3.1. Caracterização e histórico da indústria de laticínios parceira... 10

3.2. Avaliação dos processos tecnológicos adotados na produção de leite UHT pela indústria de laticínios parceira deste trabalho... ¹¹

3.3. Coleta das amostras... 11

3.4. Determinação da qualidade físico-química das amostras... 12

3.5. Determinação da massa de sedimentos das amostras de leite UHT... 12

3.6. Determinação da viscosidade das amostras de leite UHT... 13

3.7. Determinação da contagem de células somáticas do leite cru e da qualidade microbiológica das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT... 13

3.8. Determinação do grau de proteólise do leite cru, pasteurizado e UHT... 14

3.8.1. Determinação pelo método descrito por Hull (1947)... 14

3.8.2. Determinação utilizando kit comercial... 14

3.9. Determinação da atividade proteolítica do leite cru, pasteurizado e UHT... 16

3.10. Análises estatísticas... 16

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 18

4.1. Estabelecimento do fluxograma utilizado no processamento de leite UHT integral pela indústria... 18

4.2. Temperatura das amostras de leite no momento da coleta... 18

4.3. Qualidade físico-química das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT... 20

4.4. Contagem de células somáticas e qualidade microbiológica das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT... 27

4.5. Proteólise e atividade proteolítica... 31

4.6. Correlação entre os atributos de qualidade avaliados nas amostras de leite cru, pasteurizado e UHT... 33

5. CONCLUSÕES... 38

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 40

viii RESUMO

BATISTA, Cleiton de Souza, Mestrado Profissional, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, agosto de 2015. Estudo de correlação entre a qualidade do leite cru refrigerado e do leite UHT integral. Orientador: Maurilio Lopes Martins. Coorientadores: Cláudia Lúcia de Oliveira Pinto e Aurélia Dornelas de Oliveira Martins.

No Brasil, o leite UHT é predominante no mercado consumidor dentre os leites fluidos, mas a baixa qualidade microbiológica da matéria-prima é ainda um entrave na cadeia produtiva desse produto. Objetivou-se avaliar a influência da qualidade do leite cru e pasteurizado sobre a qualidade e características de estabilidade de leite UHT integral. A coleta de amostras foi realizada em uma indústria processadora de leite UHT. Realizou-se avaliações da qualidade do leite cru (Contagem de Células Somáticas – CCS, Contagem Bacteriana Total - CBT, psicrotróficos, psicrotróficos proteolíticos e esporulados, grau de proteólise, atividade proteolítica e análises físico-químicas); do leite pasteurizado (contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos, psicrotróficos, psicrotróficos proteolíticos e esporulados, grau de proteólise, atividade proteolítica e análises físico-químicas) e do Leite UHT (contagem de micro- organismos aeróbios mesófilos, esporulados, análises físico-químicas e determinação da massa de sedimentos, viscosidade, grau de proteólise e atividade proteolítica nos tempos 0, 60 e 120 dias de armazenamento à temperatura ambiente). O grau de proteólise do leite foi determinado pelos métodos de Hull e Método de Winzler (Labtest), o qual foi adaptado para leite, ambos fundamentados na determinação de tirosina. Procedeu-se a análise da correlação entre a qualidade microbiológica do leite cru, grau de proteólise e atividade proteolítica. A CCS e CBT do leite cru estavam em desacordo com os padrões legais. A pasteurização promoveu redução de 2,3 ciclos logarítmicos na CBT. A população de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos no leite cru foi superior a 10⁶ UFC.mL^-1 e, após a pasteurização houve diminuição de 4,4 ciclos logarítmicos. A contagem média de microrganismos esporulados mesófilos nas amostras de leite cru e pasteurizado foi de 2,45 log UFC.mL^-1 e < 1,0 UFC.mL^-1 nas amostras de leite UHT. As amostras de leite cru, pasteurizado e UHT estavam de acordo com os padrões físico-químicos, exceto as amostras de leite cru e pasteurizado coletadas na primeira repetição, que foram instáveis ao alizarol 72 °GL, ao etanol, à cocção e apresentaram índice crioscópico alterado e presença de sacarose. Não houve interação (p>0,05) entre os tipos de leite (cru, pasteurizado e UHT) com as estações do ano para as variáveis acidez titulável, pH, gordura, densidade, extrato seco total e desengordurado. Entretanto, houve interação significativa (p<0,05) para a variável crioscopia, que foi associada à adição de estabilizante proteico (fosfato de sódio) no leite cru. As amostras de leite UHT apresentaram maiores valores de acidez titulável e menores valores de pH em relação ao leite cru. Não houve interação (p>0,05) entre viscosidade e massa de sedimentos do leite UHT com o tempo e variação significativa da viscosidade entre as amostras durante o armazenamento. Entretanto, houve aumento significativo da massa de sedimentos. Maior grau de proteólise foi observado no leite pasteurizado, sendo que maiores índices de tirosina foram observados pelo Método de Winzler (Labtest) no leite cru e pasteurizado. Pelo método Hull observou-se maior índice de proteólise no leite UHT. Houve aumento do grau de proteólise e da atividade proteolítica no leite UHT

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durante o armazenamento, além de uma correlação significativa entre a contagem de micro- organismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos, contagem de micro-organismos psicrotróficos proteolíticos e grau de proteólise, contagem de micro-organismos psicrotróficos e massa de sedimentos, grau de proteólise e massa de sedimentos e entre grau de proteólise e atividade proteolítica. Concluiu-se que qualidade microbiológica do leite cru e do leite pasteurizado tem influência significativa na proteólise, atividade proteolítica e massa de sedimentos do leite UHT durante o armazenamento. Portanto, recomenda-se o emprego de matéria-prima com alto padrão de qualidade microbiológica para prevenção de problemas tecnológicos relacionados à ação de proteases microbianas termoresistentes e obtenção de um produto com alto padrão de qualidade.

Palavras-chave: Qualidade do leite, processamento UHT, proteólise, estabilidade térmica.

x ABSTRACT

BATISTA, Cleiton de Souza, Professional Master, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, August 2015. Correlation study between quality of refrigerated raw milk and whole UHT milk. Advisor: Maurilio Lopes Martins. Co-advisors: Cláudia Lúcia de Oliveira Pinto and Aurélia Dornelas de Oliveira Martins.

UHT milk is widely consumed as fluid milk in Brazil. However, one limitation of quality during this food production is the raw milk contamination by psychrotrophic bacteria that produce thermostable extracellular proteases. The aim was to evaluate the influence of raw and pasteurized milk quality on the quality and stability characteristics of whole UHT milk. The samples were collected in dairy industry that produces UHT milk. It was determined the quality of raw milk (Somatic Cells Count – SCC, Total Bacterial Count - TBC, psychrotrophic, proteolytic psychrotrophic, sporeforming bacteria, degree of proteolysis, proteolytic activity and physico-chemical analysis); pasteurized milk (mesophilic aerobic microorganisms, psychrotrophic, proteolytic psychrotrophic, sporeforming bacteria, degree of proteolysis and proteolytic activity), and UHT milk (mesophilic aerobic microorganisms, sporeforming bacteria, physico-chemical analyzes, and determination of sediment mass, viscosity, proteolysis degree and proteolytic activity at 0, 60 and 120 days of UHT milk storage at room temperature). The proteolysis degree of milk was determined by the method of Hull and by Winzler Method (Labtest), which was adapted to milk, both based on the tyrosine determination. It was performed analyzes of correlation between microbiological quality of raw milk, proteolysis degree and proteolytic activity. The SCC and TBC of raw milk were in disagreement to the legal standards. Pasteurization promoted reduction of 2.3 log cycles on the TBC. The counts of psychrotrophic bacteria and proteolytic psychrotrophic bacteria in raw milk was higher than 10⁶ UFC.mL^-1 and, after pasteurization, there was a decrease of 4.4 log cycles. The average count of mesophilic sporulated in raw and pasteurized milk samples was of 2.45 log CFU.mL^-1, and < 1,0 CFU.mL^-1 into the UHT milk samples, which were in accordance with microbiological standards. The samples of raw, pasteurized and UHT milk were in accordance with the physico-chemical standards, except for samples of raw and pasteurized milk collected in the first repetition, which were unstable at 72 °GL alizarol, ethanol, and cooking. These samples also presented altered cryoscopic index and presence of sucrose. There was no interaction (p>0.05) between the types of milk (raw, pasteurized and UHT) with the seasons to the acidity, pH, fat, density, total dry extract and non-fat solids. However, there was significant interaction (p<0.05) for the freezing point, which was associated with the addition of protein stabilizer (sodium phosphate) in raw milk. UHT milk samples had higher acidity values and lower pH values in relation to raw milk. It was not interaction (p>0.05) between viscosity and sediment mass of UHT milk with time, and no significant viscosity variation between samples during storage. However, there was significant increase in the mass of sediment. Higher proteolysis degree was observed in pasteurized milk, being the larger tyrosine ratios observed by Winzler Method (Labtest) in raw and pasteurized milk. By the Hull Method, it was observed higher proteolysis index in UHT milk. There was increase of proteolysis degree and proteolytic activity in UHT milk during storage, and a significant correlation between psychrotrophic microorganisms count and proteolytic

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psychrotrophic microorganisms count, proteolytic psychrotrophic count and degree of proteolysis, psychrotrophic microorganisms count and sediment mass, proteolysis degree and sediment mass, and between proteolysis degree and proteolytic activity. It was concluded that microbiological quality of raw and pasteurized milk has significant influence on proteolysis, proteolytic activity and sediment mass of UHT milk during storage. Therefore, it is recommended the use raw milk with high microbiological standard of quality in order to prevention of technological problems related to the action of heat resistant microbial proteases and obtain a product with high quality standard.

Keywords: Milk quality, UHT processing, proteolysis, thermal stability.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fluxograma de processamento de leite UHT adotado pela indústria parceira... 19 Figura 2 - Valores médios de acidez (A), pH (B), gordura (C) e densidade (D) das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT nas estações do ano... 22 Figura 3. Valores médios de extrato seco total (A), extrato seco desengordurado (B) e crioscopia (C) das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT nas estações do ano... 23 Figura 4 - Valores médios dos teores de proteína (A) e lactose (B) das amostras de leite cru e pasteurizado nas estações do ano... ²⁵ Figura 5 - Valores médios de viscosidade (A) e de sedimento (B) das amostras de leite UHT nos tempos 0, 60 e 120 dias de armazenamento a temperatura ambiente... 26 Figura 6 - Valores médios de CBT do leite cru e da contagem padrão em placas de mesófilos aeróbios do leite pasteurizado e UHT (A), da contagem padrão em placas de psicrotróficos (B), psicrotróficos proteolíticos (C) e esporulados mesófilos (D) do leite cru, pasteurizado e UHT nas estações do ano... 30 Figura 7 - Comparação do grau de proteólise das amostras de leite cru (A), pasteurizado (B) e UHT (C) determinado pelo método descrito por Hull e pelo Kit comercial utilizando o Teste T... 34 Figura 8 - Correlação da contagem de micro-organismos psicrotróficos proteolíticos e psicrotróficos no leite cru (A) e entre a contagem de micro-organismos psicrotróficos proteolíticos do leite cru e grau de proteólise determinado pelo kit comercial nas amostras de leite UHT... 34 Figura 9 - Correlação entre a contagem de micro-organismos psicrotróficos no leite cru e massa de sedimento no leite UHT no tempo 0... 35 Figura 10 - Correlação entre grau de proteólise das amostras de leite cru (A e B) e massa de sedimento no leite UHT armazenado por 60 dias e entre grau de proteólise das amostras de leite pasteurizado (C) e massa de sedimento do leite UHT armazenado por 120 dias... 36 Figura 11 - Correlação entre atividade proteolítica e grau de proteólise das amostras de leite cru (A), pasteurizado (B) e UHT (C) e correlação entre grau de proteólise determinado pelo kit comercial e de acordo com Hull nas amostras de leite UHT (D)... 37

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Temperatura média (n=2) das amostras de leite no memento da coleta... 19 Tabela 2 - Estabilidade térmica, presença de conservantes, reconstituintes, neutralizantes,

antibiótico, fosfatase alcalina e peroxidase nas amostras de leite cru... 21 Tabela 3 - Estabilidade térmica, presença de conservantes, reconstituintes, neutralizantes,

antibiótico, fosfatase alcalina e peroxidase nas amostras de leite pasteurizado... 21 Tabela 4 - Estabilidade térmica das amostras de leite UHT... 21 Tabela 5 - Resultados médios (n=2) da contagem de células somáticas do leite cru e da

contagem bacteriana total do leite cru, mesófilos aeróbios dos leites pasteurizado e UHT, psicrotróficos, psicrotróficos proteolíticos do leite cru e pasteurizado e de esporulados mesófilos do leite cru, pasteurizado e UHT... 28 Tabela 6 - Resultados médios (n=2) do grau de proteólise determinado pelo método de

Hull (mg de tirosina.5 mL^-1) e determinado pelo kit comercial (mg de tirosina mucoproteica.5 mL^-1) e atividade proteolítica (UEP.hora^-1)... 32

1 1. INTRODUÇÃO

No Brasil, o consumo de leite UHT apresentou um considerável crescimento nos últimos 21 anos. Segundo a Associação Brasileira de Leite Longa Vida (ABLV), de um volume anual consumido de leite UHT na ordem de 450 milhões de litros processados em 1992, o consumo saltou para mais de 6 bilhões de litros no ano de 2014. Assim, o produto atingiu 82% do total do leite fluido consumido no país e movimentou R$ 14 bilhões em 2012. Para o ano de 2013, a estimativa da ABLV projetou um aumento de cerca de 70% nas vendas do leite UHT, o que correspondeu a 6,13 bilhões de litros em um mercado total de 10,5 bilhões de litros de leite de consumo (ABLV, 2013).

Entretanto, mesmo com estes dados que demonstram a expressividade do leite UHT no mercado, um dos entraves da cadeia produtiva é a contaminação do leite cru com bactérias psicrotróficas e esporuladas, apontadas como principais fatores limitantes para a qualidade do produto. A qualidade do leite cru tem efeito direto na qualidade e vida útil do leite UHT. Assim, a implementação de novos indicadores de qualidade relativos à atividade de enzimas lipolíticas e proteolíticas produzidas por bactérias psicrotróficas e à presença de esporos termorresistentes, têm sido acrescidos ao controle de qualidade de produtos UHT.

As bactérias produtoras de enzimas proteolíticas e lipolíticas termorresistentes são as principais causadoras de coagulação doce, ou geleificação, sabor amargo e odores indesejáveis em leite e são também associadas à formação de biofilmes em superfícies mal higienizadas, o que propicia a resistência a agentes antimicrobianos usados para higienização na indústria de laticínios.

Algumas bactérias do gênero Bacillus resistem ao tratamento térmico durante a produção de leite pelo sistema UHT. Quando a contagem de micro-organismos mesófilos aeróbios é superior a 1,0 x 10² UFC.mL^-1 no produto final, o mesmo encontra-se em desacordo com os padrões legais exigidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1996; BRASIL, 1997).

Considerando estes entraves da cadeia produtiva do leite UHT, as atividades propostas neste trabalho visaram desenvolver um estudo de caso a fim de correlacionar a qualidade do leite UHT com a de sua respectiva matéria prima. Assim, este trabalho teve como objetivo geral avaliar a influência da qualidade do leite cru e do leite pasteurizado, bem como dos processos

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tecnológicos utilizados por uma indústria de laticínios do estado de Minas Gerais, na qualidade do leite UHT produzido por esta. Especificamente objetivou-se:

• Descrever a tecnologia adotada no processamento de leite UHT;

• Determinar a qualidade físico-química, microbiológica e o grau de proteólise do leite cru e do leite pasteurizado utilizados para o processamento de leite UHT;

• Determinar a qualidade físico-química, microbiológica, grau de proteólise e massa de sedimentos das amostras de leite UHT;

• Estudar a correlação das características composicionais, microbiológicas e a vida de prateleira das amostras de leite UHT com a qualidade físico-química, microbiológica e com o grau de proteólise do leite cru e pasteurizado utilizados na sua produção ao longo das estações do ano.

• Propor alternativas de melhoria da qualidade do leite UHT produzido pela empresa parceira deste trabalho.

3 2. REVISÃO DE LITERATURA

O leite é um dos principais alimentos consumidos, sendo bem aceito por todas as faixas etárias. Seu agronegócio é fundamental no suprimento de alimentos e na geração de emprego e renda para a população brasileira.

O processamento do leite UHT envolve o recebimento do leite cru refrigerado a temperaturas entre 3,0 °C e 5,0 °C e armazenamento em silos isotérmicos de aço inoxidável até ser enviado ao beneficiamento. Este leite entra no fluxo de produção pelo tanque de equilíbrio, sendo bombeado para o conjunto de pasteurização onde é pré-aquecido a 75,0 °C – 85,0 °C no pasteurizador de placas, ocorrendo em seguida a padronização do teor de gordura, geralmente, para 3,0%, quando se deseja leite integral e adição dos estabilizantes proteicos como citrato de sódio ou sais de fosfato (SILVA, 2004).

O sistema de aquecimento do leite durante o tratamento térmico UHT pode ser da forma direta, em que há injeção de vapor culinário ao produto e sua posterior remoção em câmara asséptica por meio da aplicação de vácuo, ou indireto, por meio de trocadores de calor tubular (TETRA PAK, 1996).

Entretanto, o sistema direto possui algumas limitações como: ser adequado para produtos de baixa viscosidade, o vapor utilizado deve ser de alta qualidade (potável) para evitar o desenvolvimento de sabor e aroma indesejáveis nos produtos e a regeneração da energia é menor do que 50%, ao contrário do sistema indireto em que a regeneração é maior do que 90%, sendo, portanto, o sistema de aquecimento direto mais oneroso (LEWIS; HEPPEL, 2000).

Ressalta-se que todo o sistema está pressurizado por volta de 4 Bar, impedindo assim, que o leite entre em ebulição. No aquecimento direto é promovido o aumento da temperatura com injeção de vapor com temperatura entre 137,0 °C a 145,0 °C, o que provoca a inclusão de água, cujo excesso deve ser removido. A câmara de vácuo, responsável por retirar toda a água adicionada no momento da injeção de vapor, controla a retirada da quantidade de vapor que foi injetado durante o aquecimento UHT. A temperatura do leite no momento da injeção de vapor tem que ser a mesma do produto que sai da câmara de vácuo (flash cooler) e deve estar entre 78,0 °C a 80,0 °C, uma vez que acima de 81,0 °C, o leite sairá do processo adicionado de água (TETRA PAK, 1996), o que constitui fraude.

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A ausência de um padrão de crioscopia específico para o leite UHT, muitas vezes, faz com que as indústrias de laticínios recomponham o leite sem considerar que houve a adição de estabilizantes de proteínas como citrato e fosfato de sódio que, por se tratarem de sal, alteram o ponto de congelamento do leite, levando-o ao abaixamento (TAMANINI et al., 2011).

De acordo com Tetra Pak (1996) e com Silva (2004), a utilização do sistema de aquecimento direto do leite é mais vantajosa na produção de leite UHT pelo baixo impacto térmico na qualidade do produto, redução de incrustação nas tubulações industriais, elevação rápida da temperatura de 80,0 °C para 150,0 °C, com redução do tempo de permanência do leite a altas temperaturas, abaixamento do ponto de ebulição do produto devido à utilização de vácuo, troca de calor latente e evaporação de água do produto na câmara de vácuo.

Em seguida, em sistema continuo, o leite é encaminhado para a homogeneização a fim de promover a diminuição do tamanho dos glóbulos de gordura. Este processo ocorre à pressão de 250 a 50 Bar ou 180 a 40 Bar e em 2 estágios, promovendo os processos físicos de cavitação, cisalhamento, explosão e impacto. De acordo com Tetra Pak (1996), a homogeneização reduz os glóbulos de gordura melhorando a vida de prateleira do produto e sua palatabilidade, sabor, viscosidade e estabilidade. Este processo tem como mecanismo de funcionamento um motor elétrico que impulsiona os pistões e força o leite a pressões elevadas, através de pequena abertura em alta velocidade a fim de romper os glóbulos de gordura. Uma vez que se opera em duas etapas de pressão, a primeira promove o rompimento dos glóbulos de gordura e a outra desfaz a reorganização dos pequenos glóbulos, separando-os (TETRA PAK, 1996; OLIVEIRA 2008).

Após a homogeneização, o leite é enviado para o tanque asséptico para posterior envase, ou é imediatamente envasado assepticamente. A vantagem de se utilizar o tanque asséptico é a maior rotatividade de produtos, podendo se trabalhar com mais de uma envasadora, promovendo melhor dinamização e otimização do processo industrial (TETRA PAK, 2011). Um ponto limitante da utilização do tanque asséptico é a execução da limpeza e sanitização, que são pontos críticos nesta etapa.

No envase asséptico não há o contato manual e é realizado a 32,0 °C em embalagens hermeticamente fechadas e assépticas e tem por função garantir o envase seguro e comercialmente estéril. A assepsia da embalagem ocorre em bandeja de peróxido de hidrogênio

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com concentração de 30% a 35%, com secagem instantânea por meio de fonte de calor (TETRA PAK, 1996).

Apesar de toda a tecnologia empregada no processamento UHT, a qualidade microbiológica e físico-química do leite cru tem influência direta sobre a qualidade deste alimento. Assim, a microbiota psicrotrófica presente no leite cru é um fator importante para a qualidade do leite UHT (MARTINS et al., 2015). Entretanto, de acordo com a literatura, a contaminação do leite por bactérias psicrotróficas deterioradoras é frequente e de difícil controle (PINTO et al., 2006; BRANDÃO et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2015).

Estudos demonstraram que as enzimas proteolíticas e lipolíticas produzidas por bactérias psicrotróficas apresentam alta atividade residual após o tratamento térmico (TOPÇU et al., 2006; MARCHAND et al., 2008; MARTINS et al., 2015). Assim, problemas relacionados à geleificação e aparecimento de sabor amargo e de ranço em leite UHT associado a essa atividade residual são frequentes (TOPÇU et al., 2006). A maioria da microbiota psicrotrófica de relevância para a indústria de laticínios inclui espécies de bactérias Gram-negativas dos gêneros Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium e Flavobacterium e bactérias Gram-positivas dos gêneros Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus e Microbacterium spp. (COUSIN, 1982; RYSER, 1999; PINTO, 2004; PINTO et al., 2013; PICCOLO; MACÊDO; BRITO; 2013).

Entretanto, entre os micro-organismos psicrotróficos contaminantes do leite há predominância de espécies dos gêneros Serratia e Pseudomonas (MACHADO et al., 2015), sendo Pseudomonas fluorescens dominante (PINTO et al., 2013). Esta bactéria destaca-se pelo alto potencial deteriorador (MARTINS et al. 2014; MACHADO et al., 2015; MARTINS et al., 2015).

Segundo Zhang et al. (2015), a indústria de laticínios pode se beneficiar do controle de P. fluorescens no leite, por controlar a concentração de protease nos produtos lácteos e então maximizar a eficiência do processamento. De acordo com os autores, no futuro, o desenvolvimento de métodos envolvendo avaliação da ação proteolítica pode indicar a concentração de proteases no leite e, consequentemente, a qualidade dos produtos lácteos.

Pinto et al. (2014) avaliaram a taxa de crescimento e a atividade proteolítica de estirpes de P. fluorescens, isoladas a partir de leite cru, após incubação a 2, 4, 7 e 10°C. Os autores constataram, pela determinação da atividade proteolítica, por eletroforese em gel de

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poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) e pela estabilidade térmica do leite, que esta bactéria promoveu a degradação de proteínas durante o armazenamento das amostras. A hidrólise da caseína resultou na perda da estabilidade térmica do leite e na formação de fragmentos de baixa e média massa molecular. Temperaturas de até 10,0 °C não garantiram a qualidade do leite cru quando a contaminação por P. fluorescens foi igual ou superior a 10⁶ UFC.mL^-1.

Segundo Costa (2014), é necessário o desenvolvimento de métodos que contribuam para determinação da atividade proteolítica no leite a fim de evitar possíveis perdas de produtividade, além de possibilitar a destinação adequada deste alimento na linha de processamento, com base em fundamentos técnico-científicos mais consistentes. Martins et al. (2005), também ressaltaram a importância do direcionamento do leite ao melhor processamento.

Os métodos atuais de detecção de proteólise e de contagem de micro-organismos apresentam baixa correlação, assim muitas vezes os dados obtidos não são conclusivos em relação à integridade das proteínas do leite. A contagem da microbiota contaminante do leite fornece dados importantes para a indústria, porém a atividade proteolítica e o grau de proteólise variam de acordo com as estirpes contaminantes deste alimento. Além disso, muitas vezes, a metodologia é aplicável, mas não fornece o resultado em tempo hábil para o direcionamento do leite ao processamento, o que limita o uso de alguns métodos de avaliação da matéria-prima na plataforma de recepção das indústrias (COSTA, 2014).

A proteólise de origem microbiana é um problema atual para as indústrias de laticínios no Brasil. Porém, os métodos empregados para mensuração da atividade proteolítica em leite e derivados são considerados de alta complexidade e morosos, o que torna o processo, muitas vezes, ineficaz no contexto produtivo e industrial (COSTA, 2014). Portanto, a ênfase na redução do tempo de análise e da complexidade na sua execução torna-se necessária para o desenvolvimento de metodologias que possam ser concluídas de forma simples e clara permitindo praticidade e eficiência na tomada de decisões no contexto produtivo.

As proteases, lipases e fosfolipases produzidas por psicrotróficos, principalmente, Pseudomonas, são estáveis a altas temperaturas e resistem a tratamentos de pasteurização e esterilização comercial (MARTINS, et al., 2015). As proteases apresentam temperatura ótima entre 30,0 ºC a 45,0 ºC, além de boa atividade a temperaturas de 4,0 ºC a 7,0 ºC (SØRHAUH; STEPANIAK, 1997, NETTO, 2012).

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A redução de 90% da atividade de proteases extracelulares produzidas por Pseudomonas pode ser alcançada a 72,0 °C, por 4 a 5 horas ou a 120,0 ºC por 7 minutos (SØRHAUH; STEPANIAK, 1997). Entretanto, estes tratamentos são considerados altamente prejudiciais às características do leite (PINTO et al., 2013).

Ressalta-se que as enzimas proteolíticas de importância em leite e derivados podem ser de origem endógena ou microbiana. As proteases produzidas por micro-organismos, principalmente por psicrotróficos, atuam sobre as caseínas, por meio de proteólise, tendo como consequência a modificação das características físico-químicas do leite durante a sua vida de prateleira. As caseínas formam um grupo de proteínas específicas que correspondem a, aproximadamente, 80% do total de proteínas do leite bovino (WALSTRA et al., 2006). Devido a sua importância comercial, as caseínas têm sido estudadas extensivamente.

As enzimas proteolíticas de natureza bacteriana agem, em sua maioria, sobre a κ-caseína, resultando na desestabilização das micelas e na coagulação do leite, sendo esta ação análoga a da quimosina (FAIRBAIRN; LAW, 1986; RECIO et al., 2000). Esta ação proteolítica pode causar a gelificação do leite UHT (DATTA; DEETH, 2001). Por outro lado, as lipases agem sobre a gordura do leite liberando ácidos graxos de cadeia curta que ocasionam ranço hidrolítico, dentre outros problemas tecnológicos (PINTO et al., 2013).

Assim, falhas na higienização e o uso de temperaturas de refrigeração acima de 4,0 ºC, associados à coleta em dias alternados, podem causar sérios problemas de qualidade nos produtos de laticínios fabricados com o leite que contenha alta população de bactérias psicrotróficas (CUNHA; BRANDÃO, 2000; MACHADO et al., 2015).

Além das bactérias psicrotróficas, bactérias esporuladas dos gêneros Bacillus e Paenibacillus são os principais micro-organismos apontados como fator limitante para a qualidade do leite fluido obtido em más condições higiênicas (HUCK et al., 2007). Dentre os micro-organismos termodúricos, que sobrevivem à pasteurização, espécies do gênero Bacillus são predominantes, em especial Bacillus licheniformis e Bacillus cereus (PINTO et al., 2013). Muitos desses micro-organismos são psicrotróficos e produzem enzimas termoresistentes, as quais são associadas à redução da qualidade e da vida útil do leite termicamente tratado e de produtos lácteos fabricados com leite contaminado; por esta razão, esses micro-organismos são considerados deterioradores significativos (PINTO, 2004; CEMPÍRKOVA; MIKULOVÁ, 2009, MARTINS et al., 2015).

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Uma das alternativas para a indústria minimizar os problemas da baixa estabilidade do leite é a adição de citratos e/ou fosfatos em até 0,1% expressos em P₂O₅ após a pasteurização (BRASIL, 1997). Esses sais estabilizantes têm a finalidade de sequestrar o cálcio iônico, estabilizar a caseína para evitar a precipitação das micelas, aumentar o pH e reduzir a formação de sedimentos durante a estocagem do leite UHT (PASTORINO, 2003; TSIOULPAS et al., 2010). Assim como Fox et at. (1991), Harwalkar (1997) e Silva (2004) afirmaram que a adição de fosfato e citrato de sódio ao leite aumenta a estabilidade térmica pelo efeito sequestrador do cálcio iônico. Além disso, no caso da adição de citrato de sódio ao leite há redução do fosfato de cálcio coloidal por meio da conversão a citrato solúvel não-ionizado. Segundo Omoarukhe et al. (2010), há poucas informações disponíveis na literatura sobre concentração de cálcio iônico no leite submetido a altas temperaturas. Entretanto, eles constataram que o cálcio iônico aumenta linearmente com o aumento da temperatura utilizada no processamento.

Ainda segundo estes autores, é sabido que o pH do leite diminui com o aumento da temperatura. No leite pasteurizado e UHT isto é completamente reversível no resfriamento, enquanto isto não ocorre no leite UHT esterilizado em batelada, sendo o pH deste leite 0,2 unidade menor do que o do leite original. O que é pouco entendido é como a composição do leite afeta a mudança no pH e na concentração de cálcio iônico durante o tratamento térmico e o resultado desta mudança na estabilidade térmica do leite.

O leite submetido a altas temperaturas causa ligeiro aumento da micela de caseína devido à associação das soroproteínas desnaturadas com o fosfato de cálcio. A temperatura, tempo de processo e pH são responsáveis por esse fenômeno que pode ocasionar defeitos no leite UHT durante a estocagem, principalmente se for aquecido pelo sistema de injeção direta de vapor, o qual pode ser eliminado pelo processo de homogeneização após o tratamento térmico em altas temperaturas (KELLY et al., 2006).

Os fosfatos podem inativar esses íons através da precipitação ou sequestro. Segundo Dziezak (1990), em laticínios, os fosfatos estão entre os mais importantes ingredientes. Quando usados em concentrações bem abaixo de 5%, desempenham uma variedade de funções que, além da emulsificação, neutralização, estabilização e sequestro de metais, promovem o controle da coagulação proteica e a dispersão de proteínas. A adição de fosfato dissódico estabiliza a caseína do leite impedindo sua coagulação. Assim, o leite pode não geleificar e as alterações reológicas

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durante a estocagem não ocorrerão. O fosfato dissódico previne, também, o desenvolvimento do flavour cozido.

Em temperaturas acima de 80,0 °C ocorre a desnaturação da β-lactoglobulina que interage com a ҡ-caseína, o que reduz a susceptibilidade do leite à coagulação. Esta reação irreversível é um dos efeitos principais do processo UHT que controla a maioria das propriedades do leite e derivados. Formação de grupos sulfidrílicos responsáveis pelo flavor cozido, incrustações nos trocadores de calor pela β-lactoglobulina e ação da plasmina são exemplos de compostos que devem ser inativados sob ação do calor para que não haja perda da qualidade dos produtos UHT. Vale ressaltar que as modificações da superfície micelar que ocorrem a 100,0 °C comprometem a estabilidade térmica; por isso, recomenda-se que o pré- aquecimento para produtos UHT não ultrapasse 90,0 °C (SILVA, 2004).

10 3. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi desenvolvido em uma indústria parceira e nos Laboratórios de Microbiologia e Análise de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais, campus Rio Pomba e parte das amostras foram enviadas aos Laboratórios da EMBRAPA Gado de Leite.

3.1. Caracterização e histórico da indústria de laticínios parceira

O laticínios parceiro iniciou-se em 1991, quando foi inaugurado em uma fazenda produtora de leite da Zona da Mata Mineira, uma agroindústria para beneficiar o leite, produzindo queijo mussarela e manteiga. A grande aceitação destes produtos motivou a agroindústria a lançar, em seguida, o leite pasteurizado tipo C. O sabor caseiro, característico dos produtos, conquistou a região de imediato. Esse sucesso incentivou, como prioridade, a inclusão de novos produtos no mercado.

Assim, a agroindústria transformou-se em empresa, expandiu e se transferiu para outra cidade na Zona da Mata Mineira, com estrutura mais adequada, tecnologia e equipamentos mais modernos. Em 2006, esta grande indústria de queijos do estado de Minas Gerais inaugurou sua segunda unidade fabril, onde além da fabricação de queijos a empresa passou a fazer a secagem do leite e do soro de leite transformando-os em leite em pó e soro de leite em pó, respectivamente.

Em 2011, a empresa inaugurou outra unidade fabril, mais moderna. O empreendimento contou com investimentos em torno de 50 milhões de reais. A nova fábrica aumentou a capacidade de produção da empresa em cerca de 100% e a tornou a maior do Brasil em processamento de soro e a maior de Minas Gerais em processamento de queijos.

Em 2013, a empresa lançou o leite UHT nas versões integral e desnatado, oferecendo ao mercado consumidor a mais moderna tecnologia de envase de leite.

Atualmente, a empresa processa em média 750 mil litros de leite por dia, sendo 18 mil litros de leite por hora só no processamento de leite UHT e comercializa seus produtos para diferentes regiões do Brasil. Ela possui em media 780 funcionários e apresenta crescimento com

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a busca da eficiência na produção e na confiança do consumidor, mantendo a tradição, o sabor e a qualidade dos produtos.

3.2. Avaliação dos processos tecnológicos adotados na produção de leite UHT pela indústria de laticínios parceira deste trabalho

Previamente ao início das coletas de amostras e realização dos experimentos, e também durante as coletas, foi observado e registrado o fluxo de produção do leite UHT adotado pelo laticínios. Assim, foi construído um fluxograma detalhado de todas as etapas do processo produtivo do leite UHT, desde a recepção do leite cru, armazenamento do leite na indústria, pasteurização, padronização, esterilização, homogeneização, regeneração, envase até a quarentena do produto.

3.3. Coleta das amostras

Amostras indicativas de leite cru e pasteurizado foram coletadas em duplicata para as análises físico-química e microbiológica em cada repetição. Também foram coletadas amostras de leite UHT integral em cada repetição e em duplicata para análise físico-química, microbiológica nos tempos 0, 60 e 120 dias de armazenamento a temperatura ambiente. As coletas foram realizadas em duas repetições por estação do ano, totalizando 8 coletas e 208 amostras, sendo 32 de leite cru, 32 de leite pasteurizado e 144 de leite UHT.

As amostras de leite cru e de leite pasteurizado foram coletadas diretamente dos tanques de armazenamento indicados pela indústria de laticínios parceira deste trabalho e as amostras de leite UHT foram coletadas quando pelo menos metade do lote correspondente ao leite pasteurizado que originou o leite UHT tinha sido processado.

As amostras de leite cru e pasteurizado foram coletadas em frascos Schott^® de 250 mL e transportadas e acondicionadas em caixas térmicas com gelo reciclável até o Laboratório de Microbiologia de Alimentos do campus Rio Pomba, para que a temperatura das mesmas não ultrapassassem 4,0 ºC. As amostras de leite UHT foram coletadas e transportadas à temperatura ambiente.

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Durante as coletas, a temperatura do leite cru e pasteurizado foi anotada a partir das leituras realizadas nos termômetros acoplados aos tanques de armazenamento.

3.4. Determinação da qualidade físico-química do leite

As amostras de leite cru e pasteurizado, conforme preconizado pela Instrução Normativa n.°62 (BRASIL, 2011), foram submetidas às análises de estabilidade ao alizarol 72°GL, cocção, peróxido de hidrogênio, formol, amido, cloretos, sacarose, neutralizantes, antibiótico, fosfatase alcalina, peroxidase, acidez, gordura, densidade, extrato seco total, extrato seco desengordurado, crioscopia, proteína e lactose. Além disso, foi determinada a estabilidade das amostras ao teste do álcool 74°GL a 80°GL, bem como determinado o pH.

As amostras de leite UHT foram submetidas no tempo zero (imediatamente após a coleta) e após 60 e 120 dias de armazenamento a temperatura ambiente, conforme requisitos de qualidade estabelecido na legislação (BRASIL, 1996; BRASIL, 1997), às análises de estabilidade ao álcool 68 °GL, acidez, gordura e extrato seco desengordurado. Além disso, foi determinada a estabilidade das amostras ao teste do álcool 80°GL e realizadas as análises de cocção, pH, densidade, extrato seco total e crioscopia.

As metodologias empregadas para análises físico-químicas foram as recomendadas na Instrução Normativa n.°68 (BRASIL, 2006). A presença de antibióticos foi determinada por meio do kit Beta Star plus da empresa NeoGen Corporation distribuído pela Chr. Hansen Brasil.

3.5. Determinação da massa de sedimentos das amostras de leite UHT

A massa de sedimentos das amostras de leite UHT foi determinada empregando a metodologia descrita por Pinto (2004). A embalagem foi cortada de forma a obter uma altura final de, aproximadamente, 4 cm a partir da base. Foi invertida e mantida emborcada por 10 minutos. Posteriormente, foi cortada pelas arestas e aberta completamente para facilitar a secagem de algum sedimento retido. A secagem da embalagem foi feita à temperatura controlada de 37,0 °C, por 48 horas. Após este período, foi pesada em balança analítica e, posteriormente, lavada, empregando-se pequeno volume de água, com auxilio de uma piseta. Após a secagem, a

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embalagem foi pesada e o seu valor anotado. A massa de sedimentos foi o resultado obtido pela diferença entre as duas pesagens e o resultado expresso em g.L^-1.

3.6. Determinação da viscosidade das amostras de leite UHT

A Viscosidade das amostras de leite UHT foi determinada em viscosímetro digital (Gehaka modelo VG 200) para fluidos newtonianos com copo Ford e orifícios de latão n.º 2. O ensaio consistiu em nivelar o equipamento, colocar o orifício (giglê) de latão no bico do copo Ford, depositar o leite no copo com cuidado para que não houvesse formação de espuma e bolhas. Posteriormente, retirou-se o excesso com auxilio de placa de vidro mantendo o orifício bloqueado para que não houvesse escoamento. Em seguida, foi ajustado no menu do equipamento o número do orifício e foi acionado o modo medir viscosidade. A vazão foi liberada retirando a placa de vidro que estava acima do copo de Ford. Ao final da vazão, foi medido o tempo que todo volume do fluido levou para escoar por completo pelo orifício do copo. O equipamento emitiu resultados em cSt (CentStoke) e o tempo de escoamento do fluido em segundos.

3.7. Determinação da contagem de células somáticas do leite cru e da qualidade microbiológica das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT

A contagem de células somáticas e a contagem total de bactérias das amostras de leite cru foram realizadas na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA Gado de Leite) de acordo com a metodologia de citometria de fluxo nos equipamentos Bentley 2000 (Id.: 2124); SomaCount 300 (Id.: 3151) e BactoCount IBC (Id.: 1088), respectivamente, de acordo com IDF (1995).

As amostras de leite pasteurizado foram submetidas à contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos em sistema Petrifilm^TM de acordo com as recomendações do fabricante. Também foram determinadas, nas amostras de leite cru e de leite pasteurizado, as contagens de micro-organismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos de acordo com Frank et al. (1992) e de esporulados de acordo com Stevenson; Segner (2001).

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As amostras de leite UHT também foram submetidas à contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos em sistema Petrifilm^TM de acordo com as recomendações do fabricante e de esporulados aeróbios mesófilos (STEVENSON; SEGNER, 2001).

3.8. Determinação do grau de proteólise do leite cru, pasteurizado e UHT

3.8.1. Determinação pelo método descrito por Hull (1947)

Uma alíquota de 10 mL de ácido tricloroacético 0,72 mol.L^-1 foi adicionada em 5 mL de amostra de leite. Após a homogeneização e posterior repouso por 10 minutos, foi realizada a filtração em papel de filtro qualitativo (Papel filtro Qualy, marca J.Prolab, gramatura de 80 g.m²). Cinco mililitros do filtrado foi adicionado em 10 mL de solução de carbonato de sódio e hexametafosfato de sódio (solução preparada a partir de 75 g de carbonato de sódio e 10 g de hexametafosfato de sódio, completando o balão volumétrico para 500 mL) que foi mantida a 4,0 ºC. Após 10 minutos, foram adicionados 3 mL de reagente fenólico (reagente de Folin- Ciocalteau), sob constante agitação. Após cinco minutos, a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 650 nm. Os valores de absorvância obtidos foram convertidos em seu equivalente de tirosina, empregando-se uma curva padrão, previamente preparada com soluções de concentrações conhecidas, tendo seus resultados expressos em mL de tirosina por 5 mL de leite (PINTO, 2004).

3.8.2. Determinação utilizando kit comercial

O grau de proteólise foi também determinado por metodologia de quantificação de mucoproteínas que se trata de um teste colorimétrico para dosagem de mucoproteínas em soro sanguíneo (WINZLER et al., 1948). Utilizou-se o kit comercial da empresa Laborclin, Teste para Mucoproteínas - Linha Bioliquid.

Esta técnica foi realizada de acordo com o fabricante do kit, sendo dividida em três fases. Na primeira, as proteínas séricas, exceto as mucoproteínas, foram precipitadas, pela mistura de 1 mL de leite com 4 mL de solução desproteinizante (ácido perclórico 1,2 mol.L^-1) e com 2,5 mL de solução fisiológica em um tubo de ensaio. A solução foi homogeneizada e, posteriormente,

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foi mantida em repouso por 10 minutos, e filtrada em papel filtro qualitativo (Papel filtro Qualy, marca J.Prolab, gramatura de 80 g.m²).

Na segunda fase, 3 mL do filtrado foi transferido para outro tubo de ensaio. Posteriormente, foi adicionado 0,5 mL da solução precipitante (ácido fosfotúngstico 8,7 mmol.L^-1 em ácido clorídrico 2,0 mol.L^-1), sendo a mistura homogeneizada e mantida em repouso por 15 minutos. Em seguida, foi realizada a centrifugação das amostras a 2.500 RPM por 10 minutos (Microcentrifuga Centribio, modelo 80-2B), com descarte do sobrenadante para retirada do excesso do líquido.

Na terceira fase, foi feita a determinação colorimétrica das mucoproteínas a partir da tirosina contida nas amostras. Primeiramente, foi adicionado 5 mL do solvente alcalino (solução de carbonato de sódio 0,85 mol.L^-1) ao tubo com o precipitado. Após, foi realizada a homogeneização entre o solvente e o precipitado e 0,2 mL do reagente de Folin-Ciocalteau 2N foi adicionado e o tubo incubado em um banho-maria (Solab, modelo SL155/22) a 37,0 ºC, por 15 minutos.

Para a amostra considerada como branco, foram adicionadas apenas a solução solvente e reagente de Folin-Ciocalteau nas mesmas quantidades indicadas para a amostra de leite. Para análise da amostra considerada como padrão (solução de L-tirosina a 5 mg.5mL^-1) fornecida pelo kit, foram adicionadas a mesma solução solvente e o reagente de Folin-Ciocalteau, nas mesmas quantidades indicadas para a amostra de leite e de branco.

Posteriormente, foram feitas as leituras em espectrofotômetro (Bioespectro, modelo SP- 220), em comprimento de onda, ajustado para 680 nm. A relação entre a leitura das amostras, branco e padrão disponível no kit forneceu o valor de miligrama de tirosina mucoproteica em 5 mililitros de amostra analisada conforme Equação 1 (COSTA, 2014).

mg.5mL^-1 em tirosina mucoproteica = Absorvância da amostra – Absorvância do branco x 0,25 Absorvância do padrão

O grau de proteólise das amostras de leite cru e pasteurizado foi determinado imediatamente após a coleta, enquanto o das amostras de UHT foi determinado no tempo zero e nos tempos 60 e 120 dias de armazenamento a temperatura ambiente.

Equação 1

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3.9. Determinação da atividade proteolítica do leite cru, pasteurizado e UHT

A atividade proteolítica foi determinada a partir de um substrato como indicador da reação de hidrólise proteica do leite, a azocaseína, como descrita por Nörnberg et al. (2010) e Costa (2014) com alterações. Um volume de 100 μL de leite foi adicionado de 100 μL de solução tampão 0,1M de fosfato de sódio pH 7,0 e 100 μL de solução de azocaseína, com concentração de 10 mg.mL^-1, preparada em água destilada estéril. As soluções juntamente com o leite, foram transferidas para um tubo e a mistura foi incubada a 37,0 ºC por 60 minutos em banho-maria (Solab, modelo SL155/22), sendo a reação interrompida após esse período, pela adição de 500 μL de ácido tricloroacético 30%. A solução foi centrifugada a 10.000 RPM por 5 minutos (Centrífuga Hettich Zentrifugen, modelo Mikro 220). Posteriormente, foram retirados 800 μL do sobrenadante da solução, o qual foi neutralizado com 200 μL de solução de hidróxido de sódio 1,8M.

A leitura da absorvância foi feita em espectrofotômetro (Bioespectro, modelo SP-220), em comprimento de onda ajustado para 420 nm. Em paralelo, foi preparado o branco, o qual continha todos os reagentes utilizados no procedimento, inclusive o leite, sendo a mistura não incubada a 37,0 °C por uma hora. As leituras obtidas a partir do branco e das amostras de leite foram anotadas. O aumento na absorbância de 0,01 da amostra de leite em relação ao branco correspondia a uma unidade enzimática proteolítica por hora (UEP.h^-1) (NÖRNBERG et al., 2010; COSTA, 2014).

3.10. Análises estatísticas

As amostras de leite cru, pasteurizado e UHT foram coletadas de forma aleatória em oito momentos distintos, distribuídos em duas repetições por estação do ano.

As características físico-químicas e microbiológicas das amostras foram avaliadas em esquema fatorial 4x3, sendo quatro estações do ano (inverno, primavera, verão e outono) e três tipos de leite (cru, pasteurizado e UHT).

A viscosidade e sedimento do leite UHT também foram avaliados em esquema fatorial 4x3, sendo quatro estações do ano (inverno, primavera, verão e outono) e três tempos de armazenamento das amostras a temperatura ambiente (0, 60 e 120 dias).

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A Contagem Bacteriana Total (CBT), mesófilos aeróbios, psicrotróficos, psicrotróficos proteolíticos e esporulados mesófilos das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT, Contagem de Células Somáticas (CCS) do leite cru, grau de proteólise e atividade proteolítica das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT também foram comparadas nas estações do ano (tratamentos) empregando-se o delineamento inteiramente casualizado, com duas repetições. Os resultados foram analisados por meio de Análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey para comparações entre as médias.

A qualidade microbiológica (CBT, contagem de mesófilos aeróbios, psicrotróficos, psicrotróficos proteolíticos e esporulados mesófilos), grau de proteólise e atividade proteolítica das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT ainda foram avaliadas empregando-se o delineamento inteiramente casualizado, com oito repetições para comparação de cada tipo de leite (cru, pasteurizado e UHT). Os resultados também foram analisados por meio de Análise de Variância (ANOVA) e teste de Tukey para comparações entre as médias.

O grau de proteólise determinado de acordo com Hull (1947) e pelo kit comercial e a atividade proteolítica das amostras de leite foram comparados empregando-se o teste T.

Também foi realizado um estudo da correlação entre as variáveis, sendo destacadas as que apresentaram significância estatística igual ou menor que 5% (p≤0,05). A partir destas análises, foram obtidos modelos estatísticos multivariados, a fim de explicar as correlações entre as variáveis, sendo considerados o coeficiente de correlação e a regressão linear como resposta destas correlações, o que permitiu concluir sobre os principais fatores que influenciaram na resposta de cada variável.

Todos os procedimentos estatísticos foram realizados considerando o nível de 5% de probabilidade e utilizando os softwares Statistica 7.1 (StatSoft, Inc., 2005).

18 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Estabelecimento do fluxograma utilizado no processamento de leite UHT integral pela indústria

A indústria parceira utilizava o sistema direto de aquecimento do leite com injeção de vapor ao produto e concomitante remoção da água incorporada ao leite na câmara de vácuo - flash cooler (Figura 1). Este sistema apresenta alta versatilidade com longos ciclos de produção podendo trabalhar até 40 horas sem interrupção, o que reduz as incrustações e evita paradas desnecessárias. Além disso, este sistema permite a elevação instantânea da temperatura do leite de 80,0 ºC para 150,0 ºC com baixo impacto na qualidade do produto, preservando seu sabor (TETRA PAK, 2010). Portanto, o sistema de aquecimento direto apresenta maior agilidade no processo de aquecimento e resfriamento do leite, o que reduz a possibilidade de mudanças físicas e químicas que poderiam ocorrer durante o tratamento UHT convencional, ou seja, aquele que utiliza o aquecimento indireto do leite por meio de trocadores de calor tubular (SILVA, 2004; FELLOWS, 2006; LEWIS; DEETH, 2009).

4.2. Temperatura das amostras de leite no momento da coleta

As temperaturas das amostras de leite cru variaram de 7,0 °C a 8,0 °C no momento da coleta e das amostras de leite pasteurizado entre 6,0 °C a 8,0 °C (Tabela 1).

As temperaturas de armazenamento do leite cru e pasteurizado utilizadas pela indústria permitem o crescimento de micro-organismos psicrotróficos, os quais são capazes de multiplicarem a 7,0 °C ou menos, independente de sua temperatura ótima de crescimento (MARTINS, 2003; PINTO et al., 2013).

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Figura 1. Fluxograma de processamento de leite UHT adotado pela indústria parceira. Tabela 1. Temperatura média (n=2) das amostras de leite no momento da coleta

Estação do ano Leite cru (°C) Leite pasteurizado (°C)

Inverno 7,0 6,0

Primavera 8,0 6,0

Verão 7,0 8,0

Outono 7,0 7,0

Recepção e análise do leite cru Armazenamento do leite cru no silo a 7,0 ºC por, aproximadamente, 5 horas Pasteurização a 75ºC por 15 segundos Padronização do leite para 3,0% de gordura Armazenamento do leite pasteurizado no silo a

7,0 °C por até 24 horas

Adição de 0,05% (m/v) de fosfato de sódio

Pré-aquecimento do leite pasteurizado a 85,0 ºC – 90,0ºC em trocador de calor tubular em contracorrente com o

leite UHT recém esterilizado

Injeção direta de vapor culinário no leite e aquecimento do mesmo a 142,0 ºC por 4 segundos

Entrada do leite na câmara de vácuo e resfriamento instantâneo para 80,0 °C – 85,0 °C

Homogeneização asséptica do leite em dois estágios. No primeiro a 200 Bar e no segundo a 40 Bar

Resfriamento do leite a 25,0 °C em trocador de calor em contracorrente com o leite pasteurizado

Envase asséptico

Análises de controle de qualidade Quarentena por 7 dias

Armazenamento do leite comercialmente estéril em tanque asséptico (Alsafe)

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Ressalta-se que esta microbiota produz enzimas deterioradoras termorresistentes como proteases, lipases e lecitinases, que irão degradar as proteínas, lipídeos e comprometer a membrana do glóbulo de gordura do leite, respectivamente. A degradação de proteínas e gordura do leite cru, provocada pelos psicrotróficos, pode acarretar problemas tecnológicos no leite UHT, principalmente durante a vida útil e industrialmente na fabricação de derivados (MARTINS et al., 2005; TAMANINI, 2012; MACHADO et al., 2015). Além disso, a atividade proteolítica destes micro-organismos pode ocasionar perda de rendimento na produção de queijos (BARBOSA et al., 2009; ROCHA; CARVALHAES; MARTINS, 2015).

O tempo de armazenamento do leite cru utilizado pela indústria por, aproximadamente, 5 horas antes da pasteurização pode permitir o aumento de uma geração ou mais na população de micro-organismos psicrotróficos, uma vez que estas bactérias gastam em média de 6 a 9 horas para realizar a divisão celular quando mantidas a 7,0 °C ou mais (WHITE, 2001; PINTO et al., 2014). Quanto maior a temperatura de refrigeração adotada pela indústria, mais rapidamente ocorrerá a divisão celular destes micro-organismos.

Ressalta-se que leite cru utilizado no processamento UHT pela indústria parceira permanecia sob refrigeração por, aproximadamente, 15 horas na fazenda, uma hora no transporte até o posto de resfriamento, 8 horas nos postos de resfriamento, no mínimo 2 horas no transporte entre o posto de resfriamento e a unidade processadora e mantido por até 5 horas no silo de leite cru do laticínios, o que permite um aumento na contagem de psicrotróficos. Constatou-se ainda que é permitida a recepção do leite cru nos postos de resfriamento da indústria quando este apresenta temperatura inferior 8,0 °C. Entretanto, no posto de resfriamento, o leite cru é refrigerado para 2,0 °C. Quando o leite cru é mantido sob refrigeração (3,0 °C a 5,0 ºC) entre 24 e 48 horas, diversas modificações ocorrem na sua composição físico-química (FURTADO, 2005). Constatou-se também que após a pasteurização o leite era mantido em média a 7,0 ºC na indústria podendo permanecer por até 24 horas no silo de leite pasteurizado.

4.3. Qualidade físico-química das amostras de leite cru, pasteurizado e UHT

As amostras de leite cru, pasteurizado e UHT atenderam aos padrões físico-químicos estabelecidos pela legislação brasileira (Tabelas 2, 3 e 4; Figuras 2 e 3), exceto para estabilidade ao alizarol 72 °GL, etanol e cocção da amostra de leite cru da primeira repetição, presença de sacarose nas amostras de leite cru e pasteurizado da primeira repetição (Tabelas 2 e 3) e análise de crioscopia da amostra de leite cru (Figura 3C) coletada no inverno.