5 MATERIAL E MÉTODO
5.6 Contagem de leucócitos
5.6.1 Leucograma global
• 20µl de sangue foram diluídos em eppendorf contendo líquido de turk (líquido hemolisante), na proporção de 1:20 ( 0,4 ml de líquido diluente para 20µl de sangue), produzindo uma solução homogeneizada para que houvesse hemólise dos eritrócitos.
• Câmara de Neubauer improved, lavada com água destilada e seca foi utilizada para a contagem celular. O preenchimento com pipeta semi- automática ocorreu em um único tempo, para que não extravasasse ou faltasse líquido, evitando assim, interferência na distribuição ao acaso das células no retículo.
• A contagem celular foi realizada em microscópio óptico com aumento de 400 vezes. (Silva, 1999)
• Foi calculado o número de células por milímetro cúbico de sangue através da seguinte fórmula:
No Céls /mm3 = Q1 + Q2 + Q3 + Q4 x 10 x 20 4
(Sendo Q = número de células por quadrante da câmara de Neubauer)
5.6.2 Leucograma diferencial
• Técnica do esfregaço para contagem diferencial de leucócitos (neutrófilos, linfócito, eosinófilos e monócito) que possibilitou encontrar a freqüência relativa de cada célula.
• O sangue foi homogeneizado antes da realização do esfregaço para que as células ficassem distribuídas adequadamente na lâmina.
• A técnica consiste em depositar sobre uma lâmina de vidro uma pequena gota de sangue. Com uma segunda lâmina inclinada em ângulo de aproximadamente 45º, realiza-se o deslizamento sobre a primeira.
• Os esfregaços foram fixados com metanol e corados pelo método May Grünwald-Giemsa, que apresentam afinidades por estruturas celulares citoplasmáticas e nucleares (Silva, 1999)
• Foram contadas 100 células por lâmina, em campos ópticos distribuídos aleatoriamente e diferenciando-se as células. Foi utilizado o microscópio óptico comum com auxílio da objetiva de imersão (aumento de 1000 vezes).
5.7 Análise estatística
Realizou-se uma Análise Exploratória e descritiva dos Dados. Análise de variância (Split-Plot) foi utilizada para investigação dos efeitos principais e de interação. Para região de rejeição adotou-se o nível de significância de 5%. Modelos de regressão foram utilizados para verificar qual o modelo matemático-estatístico que melhor explica o comportamento dos dados. Para todas as análises utilizou-se o pacote estatístico SPSS versão 10.0.
6 RESULTADOS
Resultados da analise de variância (SPLIT-PLOT) revelaram que os animais que nadaram com carga de 0% e 5% não apresentaram diferenças significativas sobre a concentração de lactato sanguineo (P > 0,05). Por outro lado o teste de comparação múltipla de Bonferroni revelou diferenças significativas (P < 0,001) entre os demais grupos (Tabela 1). Os resultados também indicaram efeitos significativos de interação entre os fatores grupo versus tempo de coleta (Greenhaouse-Geisser, P < 0,001).
Tabela 1: Médias e Intervalos de confiança da concentração de lactato sangüíneo. Grupos X I.C de 95% Controle 0% 5% 50% 1,6 2,4 2,5 4,7 (1,3 - 1,9) (2,1 - 2,7) (2,2 - 2,8) (4,4 - 5,0)
I.C - Intervalo de Confiança.
Tabela 2: Médias e desvios padrões sobre a concentração de lactato sangüíneo durante os pós-testes.
Grupos Tempo de Coleta (minutos)
0 15 30 60 120 Controle 1,7 (±0,3) 1,6 (±0,3) 1,6 (±0,5) 1,5 (±0,3) 1,5 (±0,3)
0% 2,7 (±0,5) 3,3 (±0,9) 2,1 (±0,6) 1,6 (±0,2) 1,9 (±0,8) 5% 3,1 (±0,9) 3,6 (±1,0) 2,1 (±0,3) 1,7 (±0,3) 1,9 (±0,5) 50% 10,3 (±1,4) 6,5 (±1,1) 2,5 (±0,4) 1,8 (±0,5) 1,7 (±0,1)
Após simulações com diferentes modelos de regressão linear, o modelo polinomial cúbico, foi o que melhor explicou o comportamento dos dados (Tabela 3 e Figuras 1, 2, 3 e 4).
Tabela 3: Variâncias explicadas (R2) segundo modelos de regressão linear entre a concentração de lactato sangüíneo e leucócitos (global e diferencial).
MODELOS CÉLULAS
Leucócitos Linfócitos Neutrófilos Monócitos
Cúbico 0,91 0,90 0,81 0,46
Linear Simples 0,77 0,66 0,43 0,26
Quadrático 0,89 0,86 0,74 0,41
Leucócitos
O número de leucocitos aumentou imediatamente após o exercício de natação para os grupos de 0% (~39%), 5% (~62%) e 50% de carga (~91%) em relação ao grupo controle (Tabela 4 e Figura 1).
Tabela 4: Médias e desvios padrões sobre o número de leucócitos (mm3) durante os pós-testes.
Grupos Tempo de coleta (minutos)
0 15 30 60 120 Controle 7,2 (±1,0) 6,6 (±1,0) 5,7 (±1,1) 5,2 (±1,0) 5,2 (±0,9)
0% 10,1 (±1,5) 8,3 (±1,6) 6,8 (±1,5) 5,2 (±1,0) 7,8 (±1,5) 5% 11,7 (±2,2) 10,6 (±2,0) 7,1(±1,7) 6,3 (±1,1) 8,5 (±1,3) 50% 13,8 (±1,8) 10,4 (±2,1) 7,0 (±1,5) 6,1 (±1,1) 7,8 (±1,2)
Para o grupo controle, verificou-se uma queda gradual sobre o número de leucócitos e na concentração de lactato sanguíneo até o final do período de recuperação. Para os grupos de 0% e 5% de carga, o número de leucócitos caiu gradativamente ate uma hora após o término da natação. Após este período, observou-se um novo pico celular - leucocitose tardia. Os níveis de lactato sanguíneo permaneceram superiores aos valores de base cerca de 2 horas após o término do exercício.
Figura 1: Número de leucócitos versus concentração de lactato sangüíneo em diferentes fases da recuperação.
y = 0,06 x
3- 1,1 x
2+ 5,7 x R
2= 0,91
Lactato (mMol/L) 12 10 8 6 4 2 0 Leuc ó c it os ( m m 3) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 MonócitosObservou-se uma queda no número de monócitos para todos os grupos que se exercitaram sobre as diferentes fases da recuperação em relação ao controle. Os menores valores foram verificados após 30 minutos de exercício para o grupo de 0% (
↓
64%), 15 minutos para o grupo de 5% (↓
72%) e 60 minutos para o grupo de 50% de carga (↓
98%) conforme Tabela 4. Para todos os grupos que realizaram exercício, as distribuições destas células sugerem uma relação inversa com a concentração de lactato sangüíneo (R2= 0,46).Tabela 5: Médias e desvios padrões sobre a porcentagem de monócitos durante os pós-testes.
Grupos Tempo de Coleta (minutos)
0 15 30 60 120
Controle 3,0 (±1,41) 4,7 (±3,8) 5,0 (±3,94) 5,7 (±3,74) 4,2 (±2,44) 0% 3,7 (±2,0) 3,4 (±3,37) 1,8 (±1,99) 2,4 (±2,84) 2,1 (±2,33)
5% 1,8 (±0,92) 1,3 (±1,06) 2,1(±1,29) 1,90 (±2,13) 1,30 (±1,16) 50% 2,5 (±1,51) 1,1 (±1,49) 2,2 (±1,93) 0,1 (±0,32) 0,3 (±0,67)
Figura 2: Porcentagem de monócitos versus concentração de lactato sangüíneo em diferentes fases da recuperação.
y = 0,04 x
3- 0,6 x
2+ 2,5 x R
2= 0,46
Lactato (mMol/L) 12 10 8 6 4 2 0 M onóc it os ( % ) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 LinfócitosObservou-se uma forte relação entre a distribuição de linfócitos e os níveis de lactato sangüíneo (R2=0,90). O pico no número de linfócitos foi observado imediatamente após o exercício. Os valores desta célula permaneceram acima dos basais até 2 horas após o exercício (Tabela 5 e Figura 3). O aumento de maior magnitude, comparado ao grupo controle, foi de 15% (tempo 30), 14% (tempo 120) e 17% (tempo 15) para os grupos de 0%, 5% e 50% de carga, respectivamente.
Tabela 6: Médias e desvios padrões sobre a porcentagem diferencial de linfócitos sangüíneosdurante os pós-testes.
Grupos Tempo de Coleta (minutos)
0 15 30 60 120
Controle 80,0 (±7,04) 75,0 (±8,97) 70,8 (±13,46) 69,1 (±12,41) 69,5 (±7,71) 0% 82,6 (±5,44) 80,2 (±7,32) 81,4 (±5,91) 73,8 (±7,0) 76,1 (±8,02) 5% 81,1 (±5,76) 84,5 (±7,23) 79,4 (±6,54) 75,0 (±6,2) 79,4 (±7,89) 50% 89,5 (±12,90) 87,8 (±6,48) 82,4 (±6,31) 78,9 (±9,05) 76,7 (±12,5)
Figura 3: Porcentagem de linfócitos versus concentração de lactato sangüíneo em diferentes fases de recuperação.
y = 0,9 x
3- 14,0 x
2+ 64,0 x R
2= 0,90
Lactato (mMol/L) 12 10 8 6 4 2 0 Li nfó c it o s ( % ) 110 100 90 80 70 60 50 40 NeutrófilosO número de neutrófilos permaneceu abaixo dos valores pré-exercício durante o período de recuperação em relação controle. As maiores reduções foram verificadas para o grupo que realizou exercício com carga de 50%. O número celular aproximou-se dos valores basais 2 horas após o término do exercício. Assim como
os monócitos, a distribuição dos neutrófilos foi inversa à concentração do lactato sanguíneo (R2= 0,82).
Tabela 7: Médias e desvios padrões sobre a porcentagem de neutrófilos durante os pós-testes.
Grupos Tempo de Coleta (minutos)
0 15 30 60 120 Controle 16,3 (±5,33) 19,6 (±7,62) 23,1 (±10,0) 23,8 (±7,87) 23,6 (±10,5)
0% 13,6 (±5,25) 15,70 (±7,93) 16,3 (±5,5) 23,1 (±7,2) 21,4 (±7,4) 5% 16,7 (±5,6) 13,8 (±7,07) 18,2 (±5,88) 21,8 (±6,76) 18,8 (±7,67) 50% 6,6 (±3,66) 10,5 (±6,06) 15,7 (±7,29) 20,9 (±9,12) 22,7 (±12,13)
Figura 4: Porcentagem de neutrófilos versus concentração de lactato sangüíneo em diferentes fases de recuperação.
y = 0,3 x
3- 4,5 x
2+ 17,8 x R
2= 0,81
Lactato (mMol/L) 12 10 8 6 4 2 0 N e u tró fi lo s (% ) 50 40 30 20 10 0 -107 DISCUSSÃO
Neste trabalho investigamos o número e tipo de leucócitos após exercício físico agudo de natação, bem como, a relação destas variáveis com as concentrações de lactato sangüíneo. O principal resultado deste trabalho sugere que o número de leucócitos apresenta uma relação curvilínea, melhor descrita segundo o modelo polinomial cúbico (R2=0,91). Os maiores valores verificados sobre o número de leucócitos aconteceram imediatamente após o exercício e foi proporcional a concentração do lactato sanguíneo, justificado pela forte relação entre eles. O aumento ocorreu na proporção de 39%, 62% e 91% para os grupos que se exercitaram com 0%, 5% e 50% de carga, respectivamente. Um novo pico no número de leucócitos circulantes foi verificado com 2 horas de recuperação do exercício, conhecido na literatura como leucocitose tardia ou atrasada (Gabriel et al 1992; Fehr, 1979; Allsop, 1992;Costa Rosa, 2002). Embora nossa investigação tenha se limitado a distribuição de leucócitos circulantes, é provável que as concentrações de lactato sanguíneo, verificados na fase de recuperação, estejam relacionadas com função destas células frente às diferentes demandas teciduais decorrentes do exercício.
Embora em nossa investigação os linfócitos representem cerca de 75% dos leucócitos, durante a recuperação para o grupo com maior variação no número de linfócitos (50% de carga), o seu número não ultrapassou 17% dos valores de base. É importante ressaltar que os leucócitos variaram em até 91% (grupo 50% de carga, tempo zero). Por outro lado, abordando modelo humano, Gray (1993) verificou aumento no número de linfócitos de 70% e Nieman (1999), aumento de 50% logo após exercício moderado. Entretanto, é provável que a pequena variação de linfócitos verificada em nosso trabalho seja decorrente dos elevados números destas células durante a linha de base - efeito teto. Considerando a distribuição de neutrófilos, verificou-se um padrão inverso de comportamento dos dados. Quanto maior a concentração do lactato sanguíneo, menor o número de neutrófilos no sangue periférico. A maior redução foi verificada para o grupo de 50% de carga (1 hora de recuperação) até 88% em relação ao grupo controle. Este comportamento é contrário a trabalhos em modelos humanos (Pyne, 1994; Gabriel, 1992; Field, 1991) uma vez que a subpopulação de células com maior predominância, no caso de linfócitos em ratos, tendem a elevar-se em detrimento de outros subpopulações.
Talvez essa abrupta queda esteja relacionada à resposta imediata do sistema imunitário junto ao processo inflamatório agudo muscular e/ou dano tecidual, já que alguns estudos observaram um aumento na atividade fagocítica de neutrófilos durante o exercício agudo (Hack, 1992; Lewicki, 1987; Ortega, 1993).
Monócitos distribuíram-se de maneira similar aos neutrófilos na circulação sanguínea. Embora finalizado o estresse orgânico produzido pelo exercício, o número destas células diminuiu para todos os grupos no período de recuperação, em relação ao grupo controle. A maior queda verificou-se para o grupo 50% de carga, na proporção de 98% com 1 hora de recuperação. Portanto, os resultados obtidos para monócitos também contrariam achados na literatura (Field, 1991; Bierger, 1980). Sabe-se que o exercício intenso aumenta os níveis de cortisol sangüíneo (Galbo,1983) e concentrações muito altas desse hormônio estão associadas a imunossupressão (Dufaux,Order, 1989; Dufaux, 1991). Na luz destes achados, é provável que as maiores quedas ocorridas no número de monócitos/neutrófilos para os grupos exercitados 50% de carga por influencia das elevadas concentrações de cortisol sanguíneo. Adicionalmente, diferenças metodológicas podem estar refletindo a divergência de resultados. Por exemplo, grande parte dos trabalhos utilizou delineamentos de medidas repetidas, ou seja, cada participante é seu próprio controle. Nestas condições, medidas dentre grupos, também constatamos um aumento em até 130% (grupo 50% carga).
Conforme citação anterior, nossos resultados sugerem a ocorrência da leucocitose tardia - componente bifásico. Embora as concentrações do lactato sangüíneo tenham praticamente retornado aos valores basais com 2 horas de recuperação, aconteceu um novo pico no número de leucócitos. Sendo assim, sugere-se que este aumento celular independe da concentração do lactato sangüíneo. Segundo Galbo (1993) e Suzuki (2003) o cortisol possui secreção lenta que começa cerca de 10 minutos após o início do exercício com os maiores níveis sangüíneo após o término da prática. Portanto, é provável que a liberação tardia do cortisol tenha reduzido a aderência de leucócitos no endotélio vascular (Pyne, 1994) e induzindo a leucocitose bifásica (MacCathy, Dale, 1988). De fato, em nossa investigação não constatamos este comportamento para o grupo controle.
Portanto, considerando que o exercício físico é uma intervenção não medicamentosa sobre a resposta imunitária, a prescrição do programa de atividade física com base na concentração de lactato sanguineo, poderá ser uma estratégia de
baixo custo e de fácil acesso para a população na promoção da saúde. Entretanto, novos trabalhos com modelo humano deverão ser realizados.
8 CONCLUSÕES
Com os resultados obtidos neste trabalho podemos concluir:
• Existe uma forte relação entre o número de leucócitos circulantes após exercício agudo e a concentração de lactato sangüíneo. Observamos que linfócitos tiveram sua distribuição sangüínea relacionada diretamente à concentração do lactato e monócitos e neutrófilos uma distribuição inversa.
• A leucocitose atrasada independe da concentração do lactato, uma vez que, ela aconteceu quando o lactato expressava suas menores concentrações.
• O modelo de regressão polinomial cúbico é o que melhor explica a relação entre os leucócitos e suas subpopulações com a concentração do lactato sangüíneo.
• O estudo de estratégias que atenuem os efeitos nocivos sobre o sistema imunitário refletirá na condição física e saúde humana, portanto, são necessários estudos complementares que tenham como objetivo investigar quais os principais mecanismos que explicam a relação entre os leucócitos e a concentração de lactato sangüíneo.
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