3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 CORRELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ANTIGLICANTE E ESTRUTURA
As Tabelas 1, 2 e 3 mostram as porcentagens de inibição na formação de AGEs fluorescentes de 15 polifenóis avaliados neste estudo, sendo 1 pertencente ao grupo dos estilbenos, 6 dos ácidos fenólicos, 2 dos flavonóis, 2 dos flavanóis e 4 das flavanonas, através de 3 modelos de glicação (BSA-frutose, BSA-MGO e arginina-MGO), nas três concentrações testadas (150, 300 e 450 µg/mL). A análise dos valores de IC50 deste estudo demonstrou uma forte correlação positiva entre os diferentes modelos de glicação utilizados: BSA-frutose e BSA-MGO (r = 0,911 e p = 0,000), BSA-frutose e arginina-MGO (r = 0,839 e p = 0,000), e BSA-MGO e arginina-MGO (r = 0,872 e p = 0,000). Estes métodos podem diferenciar de maneira exclusiva os inibidores específicos do estágio inicial (produtos de Amadori), do estágio intermediário (espécies reativas de carbonilas) e do último estágio de glicação (formação de AGEs e estruturas cross-linking) (WU e YEN, 2005).
Tabela 1. Porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes dos
polifenóis na reação de glicação pelo modelo BSA-frutose.
Polifenóis Inibição pelo modelo BSA-frutose (%)
450 µg/mL 300 µg/mL 150 µg/mL Resveratrol 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a Ácido ferúlico 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a EGCG 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a 98,3 ± 0,6a Ácido caféico 84,5 ± 0,1b 74,8 ± 0b 51,2 ± 0,3b Ácido clorogênico 84,4 ± 0,1b 58,2 ± 0,5c 27,7 ± 0,4e Epicatequina 77,3 ± 0,2c 46,5 ± 0,4f 19,7 ± 0,5g Aminoguanidina 72,3 ± 2,5d 54,3 ± 3,5cd 31,0 ± 0d Quercetina 70,3 ± 0,5d 48,8 ± 0,2ef 22,1 ± 0,2fg Ácido gálico 63,6 ± 0,1e 56,0 ± 0,3cd 36,9 ± 0,3c Naringenina 63,0 ± 2,0e 52,3 ± 4,1de 30,3 ± 2,5de Curcumina 46,7 ± 0,6f 40,0 ± 2,0g 30,7 ± 1,2d Hesperetina 45,4 ± 0,2f 40,8 ± 0,3g 24,1 ± 0,7f Rutina 40,6 ± 0,3g 34,8 ± 0,5h 4,4 ± 0,1j Ácido p-coumárico 29,5 ± 0,5h 20,9 ± 0,7i 16,5 ± 1,5h Naringina 23,7 ± 2,5i 14,0 ± 1,0j 7,7 ± 1,2i Hesperidina 11,0 ± 1,7j 6,7 ± 0,6k 1,0 ± 0k
Valores expressos em média (n = 3) ± desvio padrão e os que apresentam letras diferentes são significativamente diferentes com p < 0,05.
Tabela 2. Porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes dos
polifenóis na reação de glicação pelo modelo BSA-MGO.
Polifenóis Inibição pelo modelo BSA-MGO (%)
450 µg/mL 300 µg/mL 150 µg/mL Ácido ferúlico 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a
Resveratrol 100,0 ± 0a 100,0 ± 0a 86,0 ± 5,3b Ácido caféico 81,8 ± 0,3b 70,1 ± 0,3b 47,1 ± 0,2cde Epicatequina 81,7 ± 0,2b 72,0 ± 0,4b 52,5 ± 0,2cd Ácido clorogênico 68,8 ± 0,4c 61,3 ± 0,5c 46,4 ± 0,4de Hesperetina 68,4 ± 0,3c 60,4 ± 0,1c 52,9 ± 1,3c Quercetina 68,4 ± 0,3c 58,4 ± 0,6cd 42,9 ± 0,3ef Naringenina 64,8 ± 0,7d 53,1 ± 1,3e 31,4 ± 2,2g Aminoguanidina 63,7 ± 0,6de 47,9 ± 0,9f 23,7 ± 3,5h Curcumina 61,3 ± 1,2ef 55,0 ± 3,6de 50,3 ± 0,6cd Ácido gálico 59,8 ± 0,2f 54,4 ± 0,2e 39,1 ± 0,9f EGCG 59,1 ± 1,0f 44,5 ± 2,3fg 26,1 ± 2,6gh Rutina 50,8 ± 0,2g 44,1 ± 0,2g 30,8 ± 0,6g Ácido p-coumárico 40,8 ± 1,7h 30,1 ± 0,6h 16,5 ± 1,5h Naringina 32,9 ± 1,7i 24,4 ± 1,4i 12,4 ± 2,2i Hesperidina 12,6 ± 1,9j 6,3 ± 0,6j 2,0 ± 0j
Valores expressos em média (n = 3) ± desvio padrão e os que apresentam letras diferentes são significativamente diferentes com p < 0,05. Destaque para a aminoguanidina, controle positivo da reação.
Tabela 3. Porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes dos
polifenóis na reação de glicação pelo modelo arginina-MGO.
Polifenóis Inibição pelo modelo arginina-MGO (%)
450 µg/mL 300 µg/mL 150 µg/mL Aminoguanidina 90,1 ± 0,2a 80,3 ± 0,5a 56,2 ± 3,1b Resveratrol 84,4 ± 0,7b 78,1 ± 0,9a 62,1 ± 2,6a Ácido clorogênico 71,3 ± 0,2c 62,5 ± 0,7b 39,1 ± 0,8cd Ácido caféico 69,2 ± 0,5c 60,1 ± 0,3b 40,2 ± 1,1c Epicatequina 69,2 ± 0,3c 56,1 ± 0,4c 35,6 ± 1,0def Naringenina 65,0 ± 3,7d 61,4 ± 2,6b 52,0 ± 0,9b Ácido gálico 63,4 ± 0,3d 56,4 ± 0,2c 41,8 ± 0,1c EGCG 63,1 ± 0,7d 51,0 ± 1,1d 30,2 ± 1,9ghi
Ácido ferúlico 53,4 ± 1,4e 45,6 ± 3,1e 32,7 ± 2,5efg Rutina 51,2 ± 0,5ef 45,9 ± 0,7e 27,6 ± 0,1hi Hesperetina 49,7 ± 0,6f 46,9 ± 0,4e 37,1 ± 1,3cde Naringina 46,0 ± 0,9g 36,3 ± 0,2f 29,5 ± 2,2ghi Ácido p-coumárico 43,5 ± 0,9gh 39,1 ± 0,5f 32,0 ± 0,7fgh Quercetina 40,7 ± 0,2h 30,8 ± 1,4g 25,6 ± 0,8i Hesperidina 19,0 ± 0,8i 16,2 ± 0,8h 12,9 ± 0,4j Curcumina 8,7 ± 0,6j 7,0 ± 0i 4,0 ± 0k
Valores expressos em média (n = 3) ± desvio padrão e os que apresentam letras diferentes são significativamente diferentes com p < 0,05. Destaque para a aminoguanidina, controle positivo da reação.
Dentre os açúcares utilizados em modelos de glicação como fontes de grupos carbonilas, a frutose foi escolhida por ser altamente reativa devido à abundância de suas cadeias abertas e por corresponder ao monossacarídeo de ocorrência mais comum na dieta, inclusive devido à adição usual do xarope de frutose em bebidas industrializadas. Os metabólitos da frutose, como a frutose-6-fosfato e o gliceraldeído-3-fosfato chegam a apresentar reatividade 200 vezes superior à glicose (VISTOLI et al., 2013).O MGO, também utilizado como fonte de grupos carbonila, consiste em um potente agente eletrofílico modificador de proteínas e de DNA que prontamente reage com BSA e arginina gerando produtos de alto peso molecular por ligações cruzadas (cross-linked). A BSA, por sua vez, é utilizada nos modelos de glicação pelo seu baixo custo e alta semelhança com a albumina sérica humana, que consiste na proteína sérica mais abundante no organismo, de meia-vida longa e com forte tendência à glicação (LEE et al., 1998). Como controle positivo da reação é utilizada a aminoguanidina (AG) que previne a formação de AGEs através da captura de intermediários nos estágios iniciais da glicação (THORNALLEY, 2003).
Os resultados obtidos do modelo BSA-frutose demonstram que o resveratrol, o ácido ferúlico, a EGCG, o ácido caféico, o ácido clorogênico e a epicatequina (450 µg/mL) apresentaram porcentagens de inibição da glicação superiores que a aminiguanidina, controle positivo da reação, em 27,7%, 27,7%, 27,7%, 12,2%, 12,1% e 5%, respectivamente (p < 0,05), indicando que estes polifenóis podem atuar na prevenção da formação de AGEs fluorescentes na fase inicial da glicação (Tabela 1). Para o estágio intermediário, avaliado por BSA-MGO, os polifenóis resveratrol, ácido ferúlico, ácido caféico, epicatequina, ácido clorogênico, quercetina e hesperetina (450 µg/mL) apresentaram porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes superiores a aminoguanidina em 36,3%, 36,3%, 18,1%, 18%, 5,1%, 4,7% e 4,7%, respectivamente (p < 0,05) (Tabela 2). No modelo arginina-MGO, por sua vez, que também avalia o estágio intermediário da reação de glicação, a AG (450 µg/mL) apresentou a maior porcentagem de inibição da glicação (90,1%), seguida por resveratrol, ácido clorogênico, ácido caféico e epicatequina, que tiveram inibições de 84,4%, 71,3%, 69,2% e 69,2%, respectivamente (Tabela 3).
Observa-se que os polifenóis resveratrol, ácido caféico, ácido clorogênico e epicatequina (450 µg/mL) apresentaram as maiores porcentagens de inibição da formação de AGEs em todos os modelos de glicação avaliados, com resultados significativamente maiores (p < 0,05) do que o apresentado pela AG nos modelos BSA-frutose e BSA-MGO. Um estudo prévio também demonstrou que comparando a atividade antiglicante de flavonóides, estilbenos e oligômeros de ácido caféico, o resveratrol apresentou o maior resultado de inibição (44,2%),
superior também em relação à AG (30%), e os autores sugerem que os compostos testados suprimem a formação de AGEs in vitro através da inibição da produção de 3-deoxiglicosona na fase inicial da reação de Maillard, da eliminação de espécies reativas de oxigênio e da repressão à progressão da reação de glicação (SASAKI, CHIBA e YOSHIZAKI, 2014).
Um estudo recente realizado por Shen, Xu e Sheng (2017) identificou inibição da glicação de 98% do resveratrol no modelo BSA-MGO (300 µg/mL), resultado semelhante ao encontrado em nosso estudo, e os autores sugerem que o resveratrol pode inibir a reação de glicação diretamente através da captura do MGO por uma reação de conjugação, e indiretamente, retardando a atividade de enzimas hidrolisadoras de carboidratos (α-glucosidade e α-amilase) e eliminando espécies reativas de oxigênio.
Adicionalmente, de forma semelhante aos nossos resultados, Gugliucci e colaboradores (2009) detectaram uma maior atividade antiglicante exercida pelo ácido caféico em comparação ao ácido clorogênico, pelo modelo BSA-MGO. Um estudo prévio verificou que o ácido clorogênico ao ser adicionado ao modelo de glicação BSA-MGO compete com o MGO por sítios de proteínas reativas, e através de ligações covalentes entre o ácido clorogênico e/ou seus derivados à estrutura protéica, impede a interação de MGO com BSA e, consequentemente, a formação de AGEs fluorescentes e não-fluorescentes (FERNANDEZ- GOMEZ et al., 2015).
O ácido ferúlico (450 µg/mL) apresentou 100% de inibição da formação de AGEs nos modelos BSA-frutose e BSA-MGO, porém no modelo arginina-MGO não se destacou entre os compostos com maiores resultados (53,4%). Estudos sugerem que o ácido ferúlico pode prevenir a formação de AGEs devido a sua atividade antioxidante, ligação com grupos amino, inibição da autoxidação de açúcares e degradação precoce de produtos da reação de Maillard in vitro; além de ter apresentado efeito protetor aos hepatócitos de ratos através da preservação da membrana mitocondrial, redução da citotoxicidade por GO e MGO, e redução da carbonilação protéica (SILVAN et al., 2011; MARUF et al., 2015).
A EGCG apresentou atividade antiglicante superior à AG apenas no modelo BSA- frutose, e a quercetina e a hesperetina apresentaram o mesmo comportamento apenas no modelo BSA-MGO. Os resultados indicaram que todos os polifenóis testados inibiram a glicação de forma dose-dependente nas concentrações 150, 300 e 450 µg/mL, entretanto, na menor concentração a hesperidina inibiu apenas 1% e 2% nos modelos BSA-frutose e BSA-MGO, respectivamente. De forma semelhante, um estudo prévio demonstrou que ao se comparar o potencial inibitório da hesperidina, de seus derivados e de seus estereoisômeros na formação dos produtos de glicação avançada, a hesperetina (aglicona) apresentou o maior efeito inibitório
da glicação, enquanto que o glicosil de hesperidina apresentou o menor, avaliados pelos ensaios de RNase A-MGO e BSA-glicose. As configurações R- e S- da hesperidina e da hesperetina mostraram atividade inibitória relativamente similar contra a formação de AGEs, o que demonstra que a configuração de seus átomos no espaço não interferiu na atividade antiglicante. (LI, MITSUHASHI e UBUKATA, 2012).
Adicionalmente, os valores de IC50 dos flavonóides quercetina, rutina e epicatequina nos modelos BSA-frutose e BSA-MGO apresentaram comportamento semelhante ao encontrado por Matsuda e colaboradores (2003), apresentando a correlação entre suas atividades antiglicantes de: epicatequina > quercetina > rutina. Um estudo realizado por Bhuiyan e colaboradores (2017) avaliou a estrutura química requerida para a atividade antiglicante dos flavonóis, comparando a quercetina com rutina, morina, fisetina e kaempferol, e identificaram que a cetona no C-4 e o 3,5,4'-triol da quercetina foram essenciais para a inibição da formação de AGEs mediada por MGO, além disto as posições C-6 e C-8 do anel A foram os principais locais reativos presentes na quercetina para capturarem MGO e formarem adutos mono- e di-MGO. Outro estudo recente realizado por Liu e colaboradores (2017) avaliou a influência da quercetina na formação de componentes α-dicarbonílicos (MGO e GO) e os autores identificaram que a quercetina pode capturar MGO através do anel B para formar adutos tri-MGO mesmo quando o anel A já está ocupado com MGO.
Estudos prévios demonstraram que a atividade antiglicante dos flavonóides se comporta de forma: flavona > flavonol > flavanol > flavanona (MATSUDA et al., 2003; WU e YEN, 2005) (Figura 2). Em nosso estudo não foi encontrada a mesma ordem de atividade antiglicante das classes de flavonóides avaliado pelos valores de IC50. A ordem de atividade antiglicante das classes de flavonóides encontrada em nosso estudo, nos três modelos de glicação testados, está descrita na Figura 3. Quanto menor o valor de IC50 maior a atividade antiglicante expressa pelo composto fenólico.
Figura 2. Ordem de atividade antiglicante entre as classes de flavonóides encontrada por
Matsuda et al. (2003) e Wu e Yen (2005). Fonte: Elaborada pelo autor.
Figura 3. Ordem de atividade antiglicante entre as classes de flavonóides encontrada em nosso
estudo, avaliada pelos valores de IC50. Fonte: Elaborada pelo autor.
Os aspectos das estruturas químicas presentes nos ácidos fenólicos e flavonóides, e mais especificamente nos flavonóis e catequinas, abordados em estudos prévios que favoreceram uma maior atividade antiglicante e possivelmente justificam os resultados encontrados neste estudo estão descritos na Tabela 4. Os flavonóides que apresentaram resultados superiores aos da aminoguanidina nos respectivos modelos, com destaque para as estruturas químicas que favoreceram este resultado, encontram-se descritos na Figura 4.
Tabela 4. Aspectos da estrutura química presentes nos ácidos fenólicos e flavonóides estudados
que possivelmente favoreceram uma maior atividade antiglicante.
Classificação dos polifenóis
Aspectos da estrutura química Referências
Ácidos fenólicos
Múltiplas hidroxilas XIE e CHEN,
2013
Flavonóides Anel A como sítio ativo. SHAO et al.,
2014 Hidroxila na posição 5 do anel A.
Dupla ligação entre C-2 e C-3 no anel C.
Di hidroxilação nas posições 3ʹ e 4ʹ no anel B. XIE e CHEN, 2013
Hidroxilação nas posições 5 e 7 dos flavonóis. Hidroxilação nos anéis A e B.
Grupos galois nas catequinas.
Hidroxilas nas posições 3ʹ, 5ʹ, 5 e 7. WU e YEN, 2005
Uma única hidroxila na posição 5ʹ do anel B.
Aumento da atividade antiglicante de forma correspondente ao aumento de hidroxilas nas posições 3ʹ, 4ʹ, 5 e 7.
MATSUDA et al., 2003 Metilação ou glicosilação da hidroxila no C-3 dos flavonóis.
Figura 4. Estrutura química básica dos flavonóides e destaque para seus aspectos que
favoreceram um melhor resultado de ação antiglicante nos flavonóides investigados nos modelos de glicação descritos.
Fonte: Elaborada pelo autor.
As porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes dos 15 polifenóis verificados neste estudo nos 3 modelos de glicação testados (450 µg/mL) agrupados por grupos (estilbenos, ácidos fenólicos e derivados, e flavonóides) estão descritas na Figura 5.
Figura 5. Porcentagens de inibição da formação de AGEs fluorescentes organizadas por classes
de polifenóis. Resultados apresentados na concentração de 450 µg/mL nos modelos BSA- frutose (A), BSA-MGO (B) e arginina-MGO (C), agrupados em estilbeno, ácidos fenólicos e derivados, e flavonóides, com destaque para a aminoguanidina, controle positivo da reação. Fonte: Elaborada pelo autor.
B A
3.2 CORRELAÇÃO ENTRE ATIVIDADE ANTIGLICANTE E CAPACIDADE