Correlação de Spearman

A correlação entre a marcação das proteínas foi considerada positiva moderada quando confrontado os marcadores p53 e Ki-67 (r=0,515 / p=0,005) e p53 e CD105 (r=0,538 / p=0,003). A correlação positiva forte ocorreu em Ki-67 e CD105 (r=0,687 / p=0,000).

6 DISCUSSÃO

Este estudo investigou, através de análise imuno-histoquímica, as diferenças entre algumas NGS, em comparação com GN. Dentre as neoplasias estudadas, está o AP, considerada a neoplasia benigna mais comum, representando aproximadamente 60%-73% das NGS (KAUL et al., 2017; PASSI et al., 2017).

O AP mostra predileção pelo sexo feminino e tende a acometer pacientes entre a 4ª e 6ª décadas de vida (PASSI et al., 2017). Os dados encontrados no presente estudo corroboram com a literatura, também foi encontrada predileção pelo sexo feminino e média de idade de 38,7 anos. Quando se avalia os casos de AP que recidivaram, observa-se média de idade de 56,2 anos.

Com relação ao tempo de evolução, observou-se média de 5 anos para o AP e média de 12 anos para o APR. Essa diferença de tempo de evolução pode refletir na idade mais avançada em que o APR é diagnosticado. Esses dados diferem ligeiramente da literatura, que mostra tempo médio de evolução de AP de 4 anos e 11 meses (OHTAKÉ et al., 2002). Já para APR, apresenta grande variabilidade, de 51 meses a 10 anos (LASKAWI; SCHOTT; SCHRÖDER, 1998; SUH et al., 2009). Quanto aos casos de CEAP, o tempo médio de evolução foi de 17,5 anos, mais longo quando comparado com as outras neoplasias estudadas, tendo em vista que se soma ao tempo de evolução do AP prévio. Na literatura, esse tempo pode chegar a variar de um mês até 52 anos (OLSEN; LEWIS, 2001).

Sabe-se que pode acontecer evolução do AP para CEAP, o que é mais comum de acontecer quando consideramos os APs que tendem a recidivar ou possuem longo tempo de evolução (NAGAO et al., 1981).Devido ao fato de evoluir a partir de um AP, encontramos neste estudo a mesma predileção pelo sexo feminino, e idade de acometimento maior do que o AP (58,8 anos). Esses resultados são consistentes com outros estudos (GEDLICKA et al., 2010; MARIANO et al., 2015; TARAKJI et al., 2012).

Quanto a localização anatômica, considerando a totalidade das neoplasias estudadas, a GP foi a mais acometida, seguida pela glândula submandibular. Outros estudos mostram essa mesma sequência (FREITAS et al., 2005a; SOARES et al., 2009; SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011). Nas NGS, cerca de 70% dos casos acomete a GP e 10% a glândula submandibular (SPEIGHT; BARRETT, 2020).

Devido à dificuldade de diagnóstico, e de determinação do prognóstico das NGS, técnicas moleculares vêm sendo estudadas para contribuir com a elucidação de algumas

lacunas. Nesse contexto, muitos estudos já demonstraram que mutações envolvendo o gene supressor de tumor p53 podem desempenhar papel fundamental na patogênese das neoplasias humanas, inclusive nas NGS (FREITAS et al., 2005a; OHTAKÉ et al., 2002; TARAKJI; KUJAN; NASSANI, 2010). A expressão de p53, através de imuno-histoquímica, tanto nas NGS quanto nas GN mostram resultados conflitantes na literatura (KÄRJÄ et al., 1997). O presente trabalho apresentou baixa expressão de p53 nas GN. Esse resultado não é consistente com Deroche et al. (2008) que afirmam não haver expressão de p53 nos tecidos de GN adjacentes às neoplasias estudadas por eles. Em concordância, Ferreira et al. (2014) avaliaram a expressão de p53 em 4 casos de glândulas salivares menores adquiridas de lesões não neoplásicas e encontraram expressividade negativa (≤ 5% das células marcadas) em 100% dos casos. No entanto, a semelhança dos nossos resultados, outros estudos tem detectado a expressão de p53 em tecidos de mucosa oral normal (OGDEN et al., 1997), sendo essa marcação atribuída a uma possível estabilização da proteína p53 do tipo selvagem. Já foi apontado por alguns trabalhos que a técnica de imuno-histoquímica possui pouca especificidade para avalição da p53 mutada, uma vez que nem todas as células imunorreativas para p53 apresentam mutações, podendo ocorrer apenas estabilização ou acúmulo de proteínas nos núcleos, o que pode explicar os resultados encontrados no presente estudo (LITOFSKY; RECHT, 1997; ROSA et al., 1997). No estudo de Tarakji et al. (2012), que investigaram 27 casos de CEAP, e o tecido normal da glândula salivar adjacente ao tumor, observaram positividade fraca para as células glandulares em 55,55% dos casos. Deve-se levar em consideração que as glândulas normais estavam adjacentes ao tumor e isso pode ter influenciado no resultado. Li et al. (1995) também encontraram expressão positiva de p53 no tecido das glândulas salivares e concluíram que existe a possibilidade das células tumorais positivas para p53 estimularem as células normais da glândula salivar ao seu redor a produzirem a proteína p53.

A expressão de p53 em AP também é controversa. A porcentagem média de células marcadas encontrada nesse trabalho foi de 18,51%. Resultados próximos ao nosso já foram relatados em outros estudos, onde cerca de 18%, 29% e até 37% dos casos de AP apresentaram imunorreatividade para p53 (DEGUCHI; HAMANO; HAYASHI, 1993; GOMES et al., 2012; OHKI et al., 2001). Outros estudos também encontraram expressão positiva de p53 em AP (DEROCHE; HOSCHAR; HUNT, 2008; KÄRJÄ et al., 1997; TARAKJI; KUJAN; NASSANI, 2010). Tais resultados, levaram alguns autores a apontarem uma participação dessa proteína na transformação maligna de AP (OHKI et al., 2001; OHTAKÉ et al., 2002). Lesões com um

comportamento benigno, como o AP, podem permanecer por um longo período de tempo sem tratamento e isso pode levar a um acúmulo de mutações nos núcleos das células favorecendo então a transformação em CEAP (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010). Expressões negativas ou baixas de p53 nas células de AP também já foram relatadas (FERREIRA et al., 2014; FREITAS et al., 2005a; SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011; SOUZA et al., 2005). Para alguns autores, este achado sugere que p53 não participa do processo de patogênese do AP (ROSA et al., 1997). Contudo, outros consideram que a mutação no gene supressor de tumor Tp53 pode estar envolvido na transformação de AP em CEAP (ALVES et al., 2004).

Poucos trabalhos na literatura reportam a imunoexpressão de p53 em APR. Um estudo realizado em 2011, avaliou a expressão de p53 em 26 casos de APR e 10 casos de AP. A porcentagem média de expressão foi de 0,4% e 0,2% respectivamente. A conclusão que os autores chegaram é que APR possui um comportamento semelhante ao AP, pois os valores de média foram muito próximos (SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011). Neste estudo encontramos maior porcentagem de células marcadas no grupo de APR na comparação com AP, no entanto sem significância estatística. Vékony et al. (2008) compararam os níveis de expressão de p53 em APR e APs primários e observaram um aumento significativo nas lesões recorrentes (mediana de 1% em AP/mediana de 15% em APR). Diante disso, os autores sugeriram que a p53 pode vir a desempenhar papel relevante tanto na progressão quanto na agressividade tumoral.

Com relação a expressão de p53 em CEAP encontramos uma média de 42,76% de marcação. Esse resultado parece ser elevado, já que valores menores (cerca de 8,5%) são descritos na literatura (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010). Entretanto, algumas pesquisas encontraram resultados que corroboram com os do presente estudo. Yamamoto et al. (1996), Li et al. (1997) e Tarakji; Kujan; Nassani, (2010) observaram expressões positivas de 58%, 66,7% e 44,4% nos casos de CEAP, respectivamente. O número de núcleos corados positivamente para p53 costuma ser maior em CEAP quando essa neoplasia é comparada com AP (FREITAS et al., 2005a; TARAKJI; KUJAN; NASSANI, 2010). Assim sendo, a expressão de p53 pode vir a ser parâmetro eficiente para diferenciar casos de AP e CEAP. Alguns autores apoiam essa colocação, uma vez que consideram esse marcador útil na discriminação entre neoplasias benignas e malignas das glândulas salivares (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010; NORDKVIST et al., 2000).

Os grupos CEAP e GN apresentaram diferença estatística significativa quando realizado o teste de Mann-Whitney (p=0,010). Esse resultado é semelhante a outros na literatura

(TARAKJI et al., 2012). A expressão de p53 nas neoplasias malignas costumam ser maiores do que nas células normais, isso acontece porque as células são expostas a agentes que danificam o DNA e a reparação desse dano não acontece. Uma vez que ocorre a mutação no gene, a p53 mutante acumula-se no núcleo das células neoplásicas e passa a ser detectável pelo processo de imuno-histoquímica (NOGUEIRA et al., 2004).

Diversos mecanismos estão envolvidos na oncogênese e a proliferação celular é um deles. O anticorpo Ki-67 é considerado o marcador mais utilizado para a investigação da proliferação celular nas neoplasias (FERREIRA et al., 2014). A porcentagem média de expressão de Ki-67 encontrada nos casos de GN foi de 0,27% neste estudo. Na literatura, os resultados são semelhantes, alguns estudos mostraram expressão negativa em 100% dos casos, enquanto outros mostram menos de 5% de expressão (BUSSARI et al., 2018; FERREIRA et al., 2014; TADBIR et al., 2012).

Nos casos de AP, a proliferação celular observada foi baixa (porcentagem média de 2,87%), entretanto, semelhante à publicada por outros autores (DEROCHE; HOSCHAR; HUNT, 2008; FREITAS et al., 2005a; TADBIR et al., 2012). Expressões negativas também foram encontradas (ALVES et al., 2004; DA CRUZ PEREZ et al., 2004). Esses achados revelam uma baixa atividade proliferativa no AP, evidencia a natureza benigna da neoplasia em questão (BUSSARI et al., 2018; FERREIRA et al., 2014).

Mariano et al. (2015) analisaram o índice proliferativo em 36 casos de AP e CEAP (22 áreas contendo AP residual). Os valores encontrados para AP e CEAP foram 6,7%, e 49,3% respectivamente. O índice Ki-67 foi considerado útil na distinção entre AP e CEAP, uma vez que, a proliferação celular em CEAP é maior do que o AP. Além disso, os autores encontraram diferenças estatísticas entre os dois grupos. Este trabalho apresentou resultados similares, evidenciando a diferença nas taxas de proliferação celular entre as neoplasias benignas e malignas, a qual pode indicar a malignidade e o comportamento agressivo das lesões malignas (TADBIR et al., 2012). Outros estudos também detectaram percentual médio de proliferação mais elevado nos casos de CEAP (DÍAZ et al., 2019; KATORI; NOZAWA; TSUKUDA, 2007). A hipótese de que a expressão aumentada de Ki-67 pode estar correlacionada com uma extensão significativa do tumor também já foi apontada por alguns autores (FAUR et al., 2015).

No presente estudo não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no índice proliferativo entre AP e APR. Outros estudos na literatura têm demonstrado que o APR apresenta maior expressão de Ki-67, na comparação com AP (BANKAMP; BIERHOFF, 1999).

Isso indica um maior risco de transformação maligna, visto que, o índice Ki-67 aumenta conforme os diferentes estágios que podem proceder o AP (MARIANO et al., 2015).

Além do índice de proliferação, um fator que deve ser levado em consideração quando se avalia a invasão de uma neoplasia é o processo de angiogênese, necessário para o surgimento e progressão tumoral (KUBOTA, 2012; SOARES et al., 2007b). O anticorpo anti-CD105 é o marcador endotelial de escolha para analisar a quantidade de vasos neoformados, pois apresenta maior acurácia e especificidade quando comparado a outros marcadores (DING et al., 2006; SAAD et al., 2003). A expressão de CD105 costuma não ser significativa em glândulas salivares normais, como demonstrado em alguns estudos, que encontraram ausência de vasos sanguíneos positivos para CD105 no tecido glandular adjacente a NGS (CARDOSO et al., 2009; TADBIR et al., 2012). Neste estudo, a quantidade de neovasos encontrada foi baixa o que é esperado para um tecido não-neoplásico.

Considerando a expressão de CD105 nos tumores benignos de glândulas salivares, Soares et al. (2009) compararam 19 casos de AP e 24 casos de APR. Esses autores detectaram um número pequeno de vasos positivos para essas duas neoplasias, sendo a média em AP 4,84 e em APR 2,35. Além disso, não encontraram diferença estatística significativa para esses dois grupos (valor de p= 0,385). No presente trabalho, as médias de vasos sanguíneos positivos para AP e APR foram maiores, 6,99 e 10,56 respectivamente, com diferença significativa entre os grupos. Essa diferença na quantidade de vasos entre AP e APR pode indicar que lesões recorrentes tendem a apresentar um grau de agressividade maior (TAKEDA, 1999). Outro estudo realizado em 2015, avaliou a expressão de CD105 em 30 casos de AP. Um número pequeno de vasos positivos também foi encontrado e a média foi de 0,47. Esse resultado levou os autores a concluírem que não ocorreu estímulo angiogênico para formação de novos vasos neste tipo de neoplasia (SOARES et al., 2015). Ademais, esse valor obtido como média acaba refletindo o crescimento lento dessas lesões (SOARES et al., 2009).

O processo pelo qual uma célula tumoral assume um fenótipo angiogênico é regulado por uma mudança no equilíbrio local entre reguladores positivos (fatores angiogênicos) e negativos (fatores angiostáticos) do crescimento de microvasos, ou seja, se no microambiente tumoral houver prepoderância de fatores angiogênicos, a neovasculatura pode persistir como capilares ou diferenciar-se em vênulas maduras ou arteríolas. Entretanto, se houver predominância de fatores angiostáticos, a regressão de neovasos acontece por apoptose ou pela parada do ciclo celular nas células endoteliais (GUPTA; QIN, 2003). O estímulo angiogênico é induzido principalmente pelas células neoplásicas malignas. No entanto, em neoplasias

benignas o papel desse estímulo não é bem compreendido (FOLKMAN, 2003; GUPTA; QIN, 2003).

Soares et al. (2007b) investigaram a expressão de CD105 em 10 casos de AP e 16 casos de CEAP. A média de vasos positivos para AP foi baixa, cerca de 3,33. Para CEAP, considerando os estágios de invasão tumoral, os carcinomas intracapsulares e minimamente invasivos apresentaram uma média de 9,0 e os carcinomas amplamente invasivos 33,6. Para os autores, esses resultados podem sugerir que houve formação de novos vasos sanguíneos durante o processo de transformação maligna de AP em CEAP. No presente trabalho também foi observado aumento dos níveis de expressão quando comparados AP com CEAP. Portanto, além da participação no processo de transformação maligna, a angiogênese tumoral contribui para a agressividade e invasão tumoral nas NGS (CARDOSO et al., 2009; TADBIR et al., 2012).

A correlação de Spearman neste trabalho foi considerada positiva forte entre os marcadores Ki-67 e CD105 (r=0,687 / p=0,000), sugerindo que a expressão destes marcadores seguiu a mesma tendência entre os grupos estudados. Entretanto, alguns autores não obtiveram esse mesmo resultado quando avaliaram a expressão desses dois marcadores em amostras de AP e GN (TADBIR et al., 2012).

É importante ressaltar que algumas diferenças encontradas na expressão dos marcadores em comparação com a literatura, pode estar relacionada com as diferentes metodologias utilizadas. Além disso, algumas limitações devem ser apontadas, como a diminuta amostra e a não realização da gradação histológica das neoplasias. Ainda assim, os resultados que o presente estudo trouxe podem contribuir para um melhor entendimento das neoplasias abordadas.

7 CONCLUSÃO

Nossos resultados demonstraram que, o índice proliferativo, a presença de p53 mutante e a angiogênese são estatisticamente maiores em CEAP, quando comparado o AP e GN, demonstrando a maior agressividade e invasividade dessa lesão, pela expressão de Ki-67, p53 e CD105. Por essa razão, esses marcadores podem ser considerados úteis para discriminar neoplasias benignas e malignas das glândulas salivares.

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