Visto que GABA e glutamato são os responsáveis pela transmissão espontânea que observamos no NCM, decidimos estudar as características cinéticas das correntes sinápticas inibitórias e excitatórias no NCM. Para isso, utilizamos as correntes sinápticas miniaturas registradas na presença do bloqueador de canais de sódio tetrodotoxina (TTX). As correntes miniaturas refletem a liberação de uma ou poucas vesículas por vez (quanta) e por isso são ideais para o estudo da cinética dos receptores presentes na fenda sináptica.
Observamos que as correntes GABAérgicas são muito sensíveis à aplicação de TTX, sofrendo uma grande inibição tanto da freqüência (3,1 ± 0,4 Hz para 0,2 ± 0,02 Hz; n = 17; p<0,001) quanto da amplitude (40,5 ± 4,2 pA para 30,2 ± 2,3 pA; n = 17; p<0,05) (Figura 4.5A [gráfico] e 4.6A [traçados]). As correntes glutamatérgicas por sua vez, não foram significativamente inibidas pela aplicação de TTX (freqüência de 0,78 ± 0,3 Hz e amplitude de 35,1 ± 3,7 pA apenas com bicuculina para 0,5 ± 0,2 Hz e 30,3 ± 3,1 pA com bicuculina e TTX; n = 6; p>0,05) (Figura 4.5B [gráfico] e 4.6B [traçado]). Com isso, concluímos que os sIPSCs no NCM são gerados pelo disparo de potenciais de ação de neurônios GABAérgicos, enquanto que os sEPSCs são basicamente independentes de potenciais de ação, podendo ser consideradas per se como correntes miniatura (mEPSCs) (notar a semelhança do registro dos sEPSCs e mEPSCs nas ampliações da figura 4.6B).
Figura 4.5: Sensibilidade dos sEPSCs e sIPSCs à TTX: Efeitos da aplicação de TTX 1 µM sobre a freqüência e a
amplitude dos sIPSCs (A) e sEPSCs (B). Barras expressam médias ± EPM. Teste T; *=p<0,05.
B
A
Figura 4.6: Ação da TTX sobre os sPSCs. Em B, exemplos de traçados em Voltage Clamp onde a TTX
1µM é aplicada junto com DNQX (A) ou bicuculina (B). Os quadros em B mostram em maior detalhe os formatos dos sIPSCs e mIPSCs.
A
A partir dos mesmos registros analisados para medida de freqüência amplitude dos mEPSCs e mIPSCs da figura 4.5, obtivemos off-line um traçado que representa a média das correntes miniatura em 4 células escolhidas aleatoriamente para cada uma das neurotransmissões (figura 4.7A) (vide métodos). Deste traçado, medimos os valores de amplitude, half width e ajustamos o decaimento com uma função exponencial dupla, obtendo com isso os valores das constantes de tempo (τ1 e τ2). Observamos que os mIPSCs possuem amplitude e half width maiores que as dos mEPSCs (Tabela 4.1 e Figura 4.7B). As medidas calculadas de half-width e de τ (Tabela 1 e Figura 4.5B) são menores nos mEPSCs do que nos mIPSCs, mostrando sua cinética de decaimento mais rápida.
Amplitude (pA) Half Width
τ
1 (ms)τ
2 (ms)mIPSCs 29,1 ± 1,6 12,2 ± 1 12,4 ± 1,8 40,1 ± 7,1
mEPSCs 15,8 ± 1,2*** 5 ± 0,3*** 3,4 ± 0,4** 11,6 ± 4,02*
Tabela 4.1: Valores de amplitude, half width e τ 1 e 2 para mIPSCs (4 células) e mEPSCs (4 células) do
B
iiii
ii
A
i iiFigura 4.7: Cinética dos mPSCs do NCM de machos. Em Ai, o registro médio de 27 mIPSCs;
em Aii, registro médio de 20 mEPSCs, ambos de uma única célula. Rise time (10-90%): pontos amarelos; decay (90-37%): pontos lilás; pico: “X” vermelho: linha de base: “X” e linha verdes;
curva de ajuste da dupla exponencial: linha
vermelha [equação de ajuste: y = A1 * exp ( -x / tau1) + A2 * exp (-x / tau2) + Baseline]. Em Bi, as medidas de amplitude dos mIPSCs e mEPSCs, em Bii, suas half width e em Biii seus respectivos τ1 e τ2. Barras expressam médias ± EPM. Teste T. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001.
4.2.2 - Caracterização dos sIPSCs e dos sEPSCs quanto ao potencial de reversão.
Com uma solução interna de pipeta contendo CsCl como íon principal, onde a concentração de cloreto é alta, as correntes inibitórias e excitatórias exibem padrões de sentido e reversão similares (correntes para dentro e reversão em 0mV) devido à força eletromotriz que age sobre os íons, puxando os cátions para dentro da célula e empurrando os ânions para fora dela com a mesma intensidade. Para investigar o comportamento das diferentes correntes isoladamente, sem a intervenção farmacológica, utilizamos uma solução interna de pipeta contendo, como íon principal, o metanosulfonato de césio (CsMSO4). Com ela, separamos os sIPSCs e sEPSCs de acordo com seus respectivos potenciais de reversão. Nessa solução obtivemos um potencial de reversão calculado para o cloreto de –52 mV, descontando um potencial de junção estimado em 14 mV (estimado usando-se a mobilidade do gluconato), um valor próximo ao observado experimentalmente, de -47 mV.Para registrarmos os sEPSCs, mantivemos o neurônio no potencial de reversão observado para o cloreto (47 mV) (Figura 4.8Ai). Para registrarmos os sIPSCs, mantivemos o neurônios a -20 mV onde os sIPSCs apresentavam polaridade positiva e sEPSCs polaridade negativa (Figura 4.8Aii). Inicialmente, observamos que as freqüências dos sIPSCs e dos sEPSCs foram pouco alteradas após a aplicação de droga (Figura 4.6B). Porém, observamos uma redução não significativa da freqüência dos sIPSCs em -20mV comparados com os valores a -70mV (Tabela 4.2). O mesmo não foi observado com os sEPSCs nos diferentes potenciais. Com isso, concluímos que a interação entre as neurotransmissões (estimulação da neurotransmissão GABAérgica pela à glutamatérgica), se existir, deve ser pequena.
Tabela 2: Freqüências e amplitudes dos sIPSCs e sEPSCs registrados em diferentes potenciais antes e após a aplicação
de DNQX (sIPSCs) ou bicuculina (sEPSCs). Resultados mostrados como média ± EPM. Testes t; p>0,05.
Grupo (n) Freqüência (Hz) sIPSCs -70 mV (n = 43) 3,2 ± 1,9 sIPSCs -20 mV (n = 21) 2,0 ± 0,3 sIPSCs -20 mV [DNQX] (n = 21) 2,1 ± 0,4 sEPSCs -70 mV (n = 27) 0,5 ± 0,4 sEPSCs -47 mV (n = 3) 0,5 ± 0,1 sEPSCs -47 mV [Bicuculina] (n = 3) 0,6 ± 0,2
A
-47 mVii
-20 mVi
Figura 4.8: Correntes registradas com uma solução interna de baixo cloreto (metanosulfonato de césio). Em
A, (i) registro a -47 mV, onde a corrente glutamatérgica é observada e a GABAérgica encontra-se no seu ponto de reversão e (ii) a -20 mV, onde as correntes GABAérgicas (correntes de saída) são observadas junto às glutamatérgicas (correntes de entrada) num mesmo registro. Em B, (i) freqüência dos sIPSCs num potencial de -20mV antes e após a aplicação de DNQX 20 µM e (ii) freqüência dos sEPSCs num potencial de -47mV antes e após a aplicação de bicuculina. Barras expressam médias ± EPM. ANOVA de duas vias. P>0,05.
Como é sabido que sinalização retrógrada por neurotransmissores liberados por despolarização neuronal inibem a neurotransmissão GABAérgica quando o neurônio pós-sináptico é despolarizado (Kreitzer & Regehr, 2001; Ohno-Shosaku et al., 2001; Wilson & Nicoll, 2001), decidimos, estudar porque a -20mV a freqüência observada dos sIPSCs era menor do que a observada a -70mV.
Assim, testamos se o potencial do neurônio registrado teria influência na freqüência dos sIPSCs. Para tal, registramos os sIPSCs (DNQX presente) em dois potencias simétricos (-50mV e +50mV – Figura 4.9A). Observamos que a freqüência dos sIPSCs foi significativamente menor no potencial positivo do que no potencial negativo (-50 mV = 2,1 ± 0,4 Hz; +50mV = 1,1 ± 0,3 Hz; n = 6; p<0,05) (Figura 4.9Bi), enquanto que a amplitude não foi alterada (-50 mV = 36 ± 5,7 e +50 mV = 33,2 ± 7,8; p>0,05). Com isso, concluímos que o potencial da membrana do neurônio pós-sináptico inibe freqüência dos sIPSCs no NCM possivelmente por um mecanismo de sinalização retrógrada semelhante ao observado no hipocampo e cerebelo de roedores.
Figura 4.9: Diferença na freqüência dos sIPSCs em potenciais de membrana com mesma força eletromotriz e sentidos opostos. Em A,
exemplos dos registros feitos a -50 mV e a +50 mV em um dos neurônios do NCM. As setas indicam em A os sIPSCs observados a +50 mV. B, valores de freqüência (i) e amplitude (ii) nos potenciais de membrana de -50 mV e +50 mV. Barras expressam médias ± EPM. n = 6 (4 machos e 2 fêmeas). Teste t; *=p<0,05.