Caracterização das neurotransmissões GABAérgica e glutamatérgica em um núcleo envolvido no processamento auditivo em pássaros canoros

Caracterização das neurotransmissões GABAérgica e glutamatérgica em um

núcleo envolvido no processamento auditivo em pássaros canoros

André Luiz Andreotti Dagostin

Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Fisiologia.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Maurício Xavier Leão.

RIBEIRÃO PRETO – SP 2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Dagostin, André Luiz Andreotti

Caracterização das neurotransmissões GABAérgica e glutamatérgica em

um núcleo envolvido no processamento auditivo em pássaros canoros

87p.:

Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto como parte das exigências para a obtenção do

título de Mestre em Fisiologia.

Orientador: Leão, Ricardo Maurício Xavier

1.

Neurotransmissão; 2. Eletrofisiologia; 3. GABA; 4. Glutamato; 5.

Mandarim; 6. Canto

FOLHA DE APROVAÇÃO

André Luiz Andreotti Dagostin

Caracterização das neurotransmissões GABAérgica e glutamatérgica em um

núcleo envolvido no processamento auditivo em pássaros canoros

Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto como parte das

exigências para a obtenção do título de Mestre em Fisiologia.

Aprovado em: ___/___/___

Banca examinadora

Prof. Dr. Ricardo Maurício Xavier Leão (Orientador) FMRP-USP

Assinatura___________________________________________

Profa. Dra. Eliane Comoli FMRP-USP

Assinatura___________________________________________

Prof. Dr. Christopher Kushmerick ICB-UFMG

DEDICATÓRIA

AGRADECIMENTOS

A Deus,pela vida e por colocar em meus caminhos pessoas maravilhosas, que me apoiaram e andaram comigo em algum momento na caminhada da vida, algumas das quais encontram-se abaixo.

Pai, a você devo tudo o que sou, meus valores, caráter, idéias e ambições. Não existem palavras para expressar a minha gratidão e admiração por você. Se um dia me tornar metade do que és, dar-me-ei por feliz.

Mãe, obrigado por todas as idéias, conselhos, cafunés e por que não, pelas broncas. Para mim, és um exemplo de dedicação, perseverança e aplicação no labor, tanto em casa quanto fora.

João e Eloisa, meus irmãos amados. Fontes de alegria e felicidade. Nenhum de nós é santo, mas ter vocês em minha vida, me dá um porquê a mais para continuar a batalhar e deixá-los orgulhosos de mim, da mesma forma que sou de ambos.

Família Andreotti e Dagostin, obrigado por me acolherem e constituírem ninhos aconchegantes aos quais vôo de volta sempre que possível para um alento a mais.

Minha namorada Ana Flávia, que viu todo o processo desde a entrada no mestrado até a sua conclusão. Que passou pelos bons e maus momentos de minha vida nesses anos que estamos juntos, pela compreensão e pelo amor e companheirismo em todos os momentos.

Família Winz e Nery, obrigado por me aceitarem em seu meio e serem comigo pessoas tão queridas.

Rato, Felipe, Célio, Juju, Becker, Darlan, Fran, Chile. Obrigado por todas as festas, folias, churrascos e risadas, mas principalmente pela amizade que sempre dispensaram a mim. Foz não seria tão bonita se vocês não estivessem lá.

Cláudia, Clodoaldo, Alexandre e Henrique. Grandes amigos de colégio que moram em meu coração. Sei do apoio de vocês, mesmo nos vendo uma vez a cada muitos anos.

Carla Straub. Minha amiga e confidente desde a graduação.

Forno e AZ... Companheiros de bons momentos, maus momentos, presepadas, folias, vídeo game. Todos seguimos os caminhos da pós-graduação, e ter amigos como vocês é oq eu faz da vida uma experiência sem igual.

Alessandro, Kiti, Éder e Ângela. Obrigado pelo companheirismo, conselhos, pizzas, jogos, futebol e, principalmente, amizade incondicional.

Povo das “amarelinhas”: vocês fizeram daquelas quitinetes safadas o melhor lugar para se viver em toda Cascavel!

Ernane, Augusto, Carlos e Berel. A convivência no lar deve ser harmoniosa para que nossa casa seja um porto seguro em momentos tempestuosos. Obrigado por serem as pessoas que fazem isso acontecer.

Ernane e Lígia, obrigado pelas vezes que me ouviram, que riram comigo, me apoiaram e me ajudaram. Vocês são duas pessoas que vou levar no coração para o resto da vida.

Meninão, João Paulo, João Henrique, Sevi, Renata Maria, Fabi, Fernandinha, Lys, Augusto, Ernane, Lígia, Cadu, Thiago, Elaine, Paula, Dani, Chefe, Lílian, Dezão. Kusuda, Marcelo, Roberta, Dawitt, Edu, Ângelo, Adriano, Ricardinho, Renato Rizzo, Renato Soriano e Roberta Ribeiro. Se rir é um santo remédio, viverei até os 150 anos ao lado desse povo.

Márcio, Mateus, Bruno, Leandro, Zoca, Berel, Thiago Malardo, Zé, “Meu Amigo”, Zé (de novo), Bebinho, Rodrigo, Rafa e os distantes Valtão e Felipe. Esse grupo faz a quarta feira ser o dia mais esperado da semana! A pelada no seu Luis é o highlight da semana e estes caras, jogadores de fibra com os quais tenho o prazer e orgulho de dividir a quadra!

Fernandinho, você eu só tenho a agradecer. Tu és o homem que faz chover! Obrigado pelas dicas e ajudas na hora das “adaptações técnicas”. Juntamente com Renatão, obrigado pelo companheirismo nas pedaladas dominicais.

Cláudia B. Vanzela, Elisa M. Aleixo, Fernando C. Rastello e Carlos Belini, funcionários dedicados que quebram todos os galhos e desfazem todos os nós burocráticos nessa jornada da pós-graduação.

Bioteristas de Departamento de Fisiologia, Leonardo Sidelis Filho e Eduardo Gomes, pelos cuidados dispensados aos animais.

Professores do departamento de Fisiologia, pelas aulas ministradas e conhecimento repassado.

Professor Wamberto Varanda por nos ajudar com a estrutura inicial para nossos experimentos, pelos ensinamentos repassados nesses anos de convivência e pelas memoráveis reuniões de laboratório em sua casa.

Marcelo Cairrão, obrigado pela amizade, alto astral no laboratório, pelos ensinamentos sobre hiopocampo e por confiar a mim os experimentos com a carambola!

Cadu, companheiro de laboratório, de risadas, de histórias, de almoços. Você é uma pessoa especial, meu caro. Se as pessoas fossem prestativas, compreensivas e companheiras uma centena de vezes menos que você, esse mundo certamente seria um lugar melhor.

Thiago, a organização é uma necessidade dentro do ambiente de trabalho, mas tudo que é em demasia, faz mal... Mas nem por isso deixo de gostar de você.

Dani, Você me ensinou muita coisa desde o momento que entrei no laboratório e me deu muitas dicas e conselhos a respeito de tudo dentro da universidade. Obrigado por todo o apoio e atenção!

Chefe... Deixei você por último pra fechar com chave de ouro. Você me ensinou muita coisa, me deu uma liberdade de me expressar e trabalhar que poucos dão. Foi alguém que me incentivou a sempre buscar um pouco mais, que me questionou, elogiou e confiou muito na minha pessoa. Vou sempre levar você na minha memória exatamente como você se descreveu para mim a algum tempo atrás “Não sou seu chefe, sou seu amigo que sempre tem razão”. Ricardo, muito obrigado!

CONTEÚDO

LISTA DE ABREVIATURAS ... VIII RESUMO ... XI ABSTRACT ...XIII 1 – INTRODUÇÃO... 18 O NIDOPÁLIO CAUDOMEDIAL (NCM)... 25 2 - OBJETIVO... 29 3 - METODOLOGIA ... 31 3.1 - ANIMAIS... 32 3.2 - ESTÍMULO... 32

3.3 - CONFECÇÃO DAS FATIAS... 33

3.4 - ELETROFISIOLOGIA... 35

3.4.1 - VISUALIZAÇÃO DOS NEURÔNIOS...35

3.4.2 - WHOLE CELL PATCH CLAMP...35

3.4.3 - REGISTRO DAS CORRENTES SINÁPTICAS...36

3.5 - ANÁLISE DOS DADOS... 37

3.6 - IMUNOCITOQUÍMICA... 39

4 - RESULTADOS ... 40

4.1 – EXPRESSÃO DA PROTEÍNA ZENK EM RESPOSTA AO CANTO. ... 41

4.2 – CARACTERIZAÇÃO DAS CORRENTES SINÁPTICA ESPONTÂNEAS (SPSCS) REGISTRADAS S NO NCM... 43

4.2.1 - CORRENTES PÓS-SINÁPTICAS MINIATURA (MPSCS) ...46

4.2.2 - CARACTERIZAÇÃO DOS SIPSCS E DOS SEPSCS QUANTO AO POTENCIAL DE REVERSÃO. ...50

4.3 – EFEITO DA ESTIMULAÇÃO CANORA NA NEUROTRANSMISSÃO NO NCM ... 54

4.3.1 SEGREGAÇÃO SEXUAL DOS PÁSSAROS CONTROLE E ESTIMULADOS...56

4.3.2 – ISOLAMENTO DA TRANSMISSÃO GABAÉRGICA PELO DNQX EM PÁSSAROS CONTROLE E ESTIMULADOS. ...59

4.3.3 - ISOLAMENTO DA TRANSMISSÃO GLUTAMATÉRGICA...61

4.3.4- EXCITABILIDADE AUMENTADA DOS NEURÔNIOS GLUTAMATÉRGICOS...63

4.4- NEUROTRANSMISSÃO NO NCM DE FÊMEAS SUBMETIDAS A UM ISOLAMENTO PROLONGADO DO ESTÍMULO CANORO. ... 65

5 - DISCUSSÃO... 68

5.1 – EXPRESSÃO DA PROTEÍNA ZENK EM RESPOSTA AO CANTO. ... 69

5.2 – CARACTERIZAÇÃO DAS CORRENTES SINÁPTICA ESPONTÂNEAS (SPSCS) REGISTRADAS S NO NCM... 69

5.3 – EFEITO DA ESTIMULAÇÃO CANORA NA NEUROTRANSMISSÃO NO NCM ... 73

5.4-DIFERENÇAS SEXUAIS NA RESPOSTA AO CANTO NO NCM. ... 75

5.5-CONCLUSÕES... 76

6 – TABELAS ... 77

LISTA DE ABREVIATURAS

2-AG 2-araquidonoiglicerol

aCSF Fluido Cefalorraquidiano Atificial

AMPA Ácido α-amino-3-3hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico

ANOVA Análise de Variância

ATP-Mg Adenosina Trifosfato, sal de Magnésio

BSA Albumina de Soro Bovino

CB1 Receptor Canabinóide Tipo 1

Cm Capacitância da Membrana Celular

CsMSO4 Metanosulfonato de Césio

DAB Diaminobenzidina

DIC Contraste por Interferência Diferencial DNAÁcido Desoxirribonucléico

DNQX 6,7-Dinitroquinoxalina-2,3-Diona

DSE Supressão da Excitação por Despolarização DSI Supressão da Inibição por Despolarização

EGTA Ácido Etileno Glicol-bis (2-aminoetileter)-Tetra acético

EPM Erro Padrão da Média

FC Fêmeas Controle

FE Fêmeas Estimuladas

GABA Ácido Gama-Aminobutírico

GTP Guanosina Trifosfato

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-Piperazino Etano Sulfônico

HW Half Width

ICC Imunocitoquímica

IEG Gene de Expressão Imediata

KGlu Glucontao de Potássio

LTD Depressão a Longo Prazo

LTP Potenciação a Longo Prazo

MC Machos Controle

ME Machos Estimulados

mEPSC Corrente Excitatória Pós-sináptica em miniatura mGluR1 Receptor Metabotrópico de Glutamato Tipo 1 mGluR5 Receptor Metabotrópico de Glutamato Tipo 5

mIPSC Corrente Inibitória Pós-sináptica em miniatura

PA Potencial de Ação

PBS Tampão Fosfato com Salina

PCA-Na Fosfocreatina, sal de Sódio

PLCβ Fosfolipase Cβ

RNAm Ácido Ribonucléico Mensageiro

RS Resistência em Série

sEPSC Corrente Excitatória Pós-sináptica Espontânea sIPSC Corrente Inibitória Pós-sinápticas Espontâneas sPSC Corrente Pós-sináptica Espontânea

TTX Tetrodotoxina

ZENK

Núcleos do cérebro de pássaros canoros:

Av Núcleo Avalanche

B Núcleo Basolateral

CLM Mesopálio Caudolateral

CMM Mesopálio Caudomedial

CN Núcleo Coclear

DLM Núcleo Dorsolateral do Tálamo Medial

DM Núcleo Medial Dorsal

E Núcleo Entopalial

HVC Centro Vocal Superior

L (1,2,3) Campo L (porções 1, 2 e 3)

L Area X Porção Lateral da Área X do Estriado LLD Núcleo Dorsal – Lemnisco Lateral LLI Núcleo Intermediário - Lemnisco Lateral LLV Núcleo Ventral - Lemnisco Lateral

LMAN Núcleo Magnocelular Lateral do Nidopálio Anterior LMO Núcleo Oval do Mesencéfalo

MLd Núcleo Dorsolateral do Mesencéfalo

NCM Nidopálio Caudomedial

Nif Núcleo Interfacial do Nidopálio

Ov Ovoidalis

PAm Paraambíguo

RA Núcleo Robusto do Arcopálio

RAm Retroambíguo

SO Oliva Superior

TSM Trato Septomesencefálico

DAGOSTIN, A.L.A., CARACTERIZAÇÃO DAS NEUROTRANSMISSÕES GABAÉRGICA E GLUTAMATÉRGICA EM UM NÚCLEO ENVOLVIDO NO PROCESSAMENTO AUDITIVO EM PÁSSAROS CANOROS. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

O canto em pássaros canoros é usado para a demarcação territorial e para o acasalamento. Assim, para que um indivíduo seja bem sucedido em seu contexto social, é necessário que aprenda a cantar e reconhecer o canto de sua espécie de maneira adequada. A habilidade de aprender o canto não é característica geral dos pássaros, mas sim, de um grupo específico: os pássaros canoros (subordem oscine). O circuito telencefálico responsável pelo reconhecimento do canto é presente tanto em machos quanto em fêmeas, sendo o nidopálio caudomedial (NCM) um núcleo proeminentemente relacionado a esse reconhecimento e à memória auditiva. O NCM responde especificamente ao canto da espécie induzindo a expressão do gene de expressão imediata (IEG) zenk, um fator de transcrição responsável pela expressão de diversos genes alvo. Porém, os mecanismos neurais e sinápticos no NCM e como eles respondem ao estímulo canoro são pouco conhecidos. O objetivo deste trabalho é a investigação das características da neurotransmissão dos neurônios do NCM em fatias frescas. Para isso, mandarins (Taeniopyia guttatta) adultos machos e fêmeas foram estimulados com canto específico da espécie ou mantidos em isolamento. O registro da atividade sináptica foi feito utilizando-se a técnica de patch-clamp em modo voltage clamp para registros de correntes pós-sinápticas espontâneas (sPSCs). Em nossos registros, observamos que as correntes que compõem a neurotransmissão no NCM são geradas pelos neurotransmissores GABA (sIPSCs) e glutamato (sEPSCs), sendo os sIPSCs muito mais abundantes que os sEPSCs. Os registros de correntes em miniatura (na presença de TTX) mostraram que as sEPSCs correspondem a mEPSCs, diferentemente dos sIPSCs, que são bastante sensíveis à TTX. A estimulação pelo canto aumentou a excitabilidade da rede glutamatérgica evidenciada pelo aparecimento de bursts de correntes glutamatérgicas após a desinibição por bicuculina. Em machos estimulados, essas correntes apareceram mesmo sem a inibição da transmissão GABAérgica e provavelmente são a causa do aumento da freqüência dos sISPCs no NCM desses pássaros. Experimentos em fêmeas isoladas de machos por 7 a 30 dias sugerem que a conectividade da rede glutamatérgica no NCM dependa de um contínuo estímulo canoro. Concluímos que o estímulo canoro desencadeia um aumento da excitabilidade dos neurônios glutamatérgicos no NCM que poderia representar uma forma de plasticidade induzida pelo canto relevante para o reconhecimento vocal do pássaro.

DAGOSTIN, A.L.A, CHARACTERIZATION OF THE GABAERGIC AND GLUTAMATERGIC NEUROTRANSMISSIONS WITHIN A NUCLEUS INVOLVED WITH THE AUDITORY PROCESSING IN SONGBIRDS. School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2008

The bird song is mainly used for territory delimitation and mating. Thus, to biologically succeed, the bird must learn how to sing and recognize the song from its species properly. This skill is not a general characteristic of the birds; instead it is present within one specific group: the songbirds (oscine suborder). The telencephalic circuit responsible for recognition of the song is present in both males and females, being the caudal medial nidopallium (NCM) a prominent area related to this recognition and to auditory memory. The NCM responds to the song specifically, evidenced by the expression of the immediate expression gene (IEG) zenk, a transcriptional factor responsible for the expression of a variety of genes. Notwithstanding, the neural and synaptic mechanisms of the NCM and how they behave under song stimulation are poorly understood. The aim of this work is to investigate the characteristics of the neurotransmission of the neurons within the NCM in fresh brain slices. For this, adult zebra finches (Taeniopyia guttatta) males and females were stimulated with a species-specific song or kept in isolation. The synaptic activity record was made using the patch-clamp technique in voltage-clamp mode to acquire data about the spontaneous post synaptic currents (sPSCs). We observed that the neurotransmission within the NCM is generated by the neurotransmitters GABA (sIPSCs) and glutamate (sEPSCs), being the sIPSCs much more abundant than the sEPSCs. The miniature currents records (TTX present) showed that the sEPSCs actually correspond to the mEPSCs, on the other hand, it showed that the sIPSCs are quite sensitive to TTX. The song stimulation increased the glutamatergic network excitability, evidenced by the appearance of glutamatergic current bursts after disinhibition by bicuculine. In stimulated males, sometimes, these currents appeared even with the GABAergic inhibition of the neurotransmission present. This is probably the cause of the observed increase in the sISPCs frequency in the NCM from these birds. Experiments with prolonged male-isolated females (7-30 day isolation) suggest that the connectivity of the glutamatergic network within NCM relies on a continuous song stimulus. We conclude that the song stimulus triggers an increase of the excitability of the glutamatergic neurons within the NCM that could represent some kind of song-induced plasticity relevant for the bird’s vocal recognition.

A vocalização é uma forma de comunicação amplamente usada por diversos animais, atingindo, na espécie humana, níveis extremos de complexidade tanto na produção de sons quanto nos significados embutidos neles. É evidente a importância do correto reconhecimento do padrão de sons da voz para a comunicação precisa entre dois indivíduos, bem como as características tonais e de timbre da voz, as quais representam uma assinatura específica importante para o reconhecimento individual num contexto social. A habilidade de comunicação através da vocalização, apesar de ser amplamente utilizada em mamíferos, contrasta com a habilidade restrita de seu aprendizado entre os indivíduos dessa classe, já que apenas uma espécie de primatas (humanos), os cetáceos (baleias e golfinhos - Guinee & Payne, 1988) e duas espécies de morcegos (Boughman, 1998) possuem mecanismos que os permitem aprender padrões complexos de vocalização. Por outro lado, na classe das aves, três grandes grupos possuem essa capacidade: papagaios, beija-flores e passeriformes pertencentes à sobordem oscine (também conhecidos como pássaros canoros).

A subordem dos oscinos (ordem passeriformes) é o grupo mais amplamente utilizado para pesquisas em neurobiologia do canto, sendo os canários (Serinus canaria), mandarins (Taeniopygia guttata) e manons (Lonchura domestica) os mais largamente utilizados (Brenowitz & Beecher, 1995). Esses animais possuem uma forma similar de aprendizado do canto, onde um modelo, como por exemplo um tutor ou até mesmo um canto gravado, servem para ensinar o animal a vocalizar, porém, cada espécie tem suas preferências inatas em relação à estrutura do canto que preferem aprender. Testes onde animais são treinados para pressionar diferentes botões, sendo que cada um dos botões é responsável pela produção de um canto, entre os quais, o do tutor, mostram que o botão relacionado ao canto do tutor é pressionado muitas vezes mais (cerca de 60%) do que os demais, evidenciando a preferência inata do animal (Marler, 1989).

O canto aprendido tem em geral uma duração longa que pode variar de alguns segundos até algumas dezenas de segundos, chegando até mesmo a minutos, e é diferenciado dos chamados inatos, que são vocalizações curtas e normalmente não aprendidas (Doupe & Kuhl, 1999). O canto possui uma estrutura temporal em que componentes silábicos se agrupam em motivos ou frases, que são séries de sílabas iguais ou diferentes. Diferentes espécies de pássaros podem agrupar diferentes frases em diferentes ordens ou vocalizar sílabas em várias ordens. Essa estrutura se assemelha à sintaxe (entenda-se sintaxe simplesmente como a ordem das sílabas dentro das frases) da linguagem humana, evidentemente sem as regras complexas de gramática que a regem. Porém, diferentemente da fala humana, o canto dos pássaros não possui semântica, ou seja, significado abstrato, servindo basicamente para demarcação de território e acasalamento, porém, este assunto é ainda controverso, pois existe evidência de que o canto ou outras vocalizações também podem

conferir significado num sentido mais abstrato. Por exemplo, o número de chamados no chapim-de-cabeça-negra (Poecile atricapillus), correlacionado com aparecimento de predadores, parece anunciar a presença e ameaça que diferentes predadores representam (Williams, 2004), podendo usar diferentes cantos para essas funções (Catchpole, 1983). Ao fazermos um paralelo com humanos, vemos que existem diferenças marcantes, como a produção do canto ser, na maioria das vezes, restrita aos machos, pois apenas eles possuem um aparato neural específico para essa função (ver mais abaixo). Por outro lado, semelhanças expressivas existem, como a habilidade de discriminar sons diversos e memorizar os sons específicos da espécie, aspectos essenciais para a comunicação vocal e, da mesma forma que em humanos, diferentes estruturas cerebrais de pássaros canoros têm sido descritas como participantes na discriminação de sons.

Uma das peculiaridades no uso de pássaros canoros para o estudo do reconhecimento vocal é a distância filogenética existente entre pássaros e mamíferos, o que culmina em diferenças pronunciadas entre estrutura do cérebro de um e de outro. Devido a isso, interessa-nos discutir alguns estudos a respeito da homologia entre o sistema nervoso central de humanos e outros animais. Esses estudos foram iniciados por Edinger entre 1885 e 1908, usando como base de estudos “A Origem das Espécies” de Darwin (Jarvis et al., 2005). Posteriormente, uma teoria sobre a evolução do cérebro de vertebrados formulada por estudiosos como J.B. Johnston, G.C. Huber, E.C. Crosby, C.U. Ariëns-Kappers, e C.J. Herrick dizia que as funções cerebrais se transferiam gradualmente entre diferentes áreas no decorrer da evolução (Reiner et al., 2004). Tanto é que, usando os humanos e seu córtex evoluído como base para comparação com outros indivíduos, postulou-se, no começo do século 20, que pássaros seriam seres inferiores no que diz respeito à inteligência, pois teriam suas ações embasadas em impulsos instintivos provenientes de seus gânglios da base bastante desenvolvidos, faltando-lhes base neural para cognição e aprendizado (Reiner, 2005). Nessa linha de raciocínio, acreditava-se que em répteis, apenas uma pequena porção cortical era presente, enquanto os gânglios da base ocupavam um volume desproporcionalmente maior que nos mamíferos, assim, avançando na filogenia animal, essa porção cortical haveria hipertrofiado para a formação do córtex dos mamíferos e essa proporção manter-se-ia dependendo da posição da classe dentro da linha evolutiva (Reiner et al., 2004). Devido a essas idéias inicialmente equivocadas, por muito tempo se pensou que o cérebro do pássaro seria composto basicamente de gânglios da base e seu comportamento seguiria apenas padrões pré-estabelecidos e estáticos. Entretanto, no decorrer do século XX, um grande número de evidências mostrou que o cérebro dos pássaros possui um grande território palial com funções similares ao do córtex dos mamíferos (Figura 1.1).

Figura 1.1: Em A, interpretação e nomenclatura defasadas do cérebro de pássaro (pombo); em B, interpretação e nomenclatura aceitas atualmente para o cérebro de pássaro (pombo) e em C, as áreas correspondentes em mamífero (rato). Adaptado de Jarvis et al, 2004.

Porém, anatomicamente o pálio das pássaros constitui-se de uma maneira um pouco diferente (Figura 1.2), organizando-se de forma globular (em núcleos), e seu homólogo mamífero, o córtex, organizado em estrutura laminar (Jarvis et al., 2005).

Fig 1.2: O cérebro de Mandarim (Taeniopygia guttata) em corte parassagital, sendo a região do pallium destacada em cinza e a correspondente ao NCM, listrada (Adaptado de AvianBrain.org).

Com essa visão de um pallium grande e bem desenvolvido que processa informações da mesma forma que o córtex mamífero, uma reavaliação das habilidades cognitivas das aves desde os anos 50 mostrou de maneira progressiva que estas são bem mais complexas do que inicialmente imaginado (Marler, 1955); (Thorpe, 1958). Exemplos dessas habilidades são os

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Medial Lateral

Caudal Rostral

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pombos, que conseguem memorizar até 725 padrões visuais (Von Fersen & Elius, 1989) ou corvos que fazem uso de galhos e folhas como ferramentas para obtenção de alimento e passam esse conhecimento para outros de sua espécie (Pollok et al., 2000; Hunt & Gray, 2003). Outros pássaros, como Aphelocoma californica (membro da família dos corvos) mostram memória episódica, habilidade antes atribuída apenas a humanos (Clayton & Dickinson, 1998), corujas possuem uma capacidade de localização sonora altamente sofisticada desenvolvida através da aprendizagem (Knudsen, 2002) e, finalmente, pássaros como papagaios, beija-flores e da subordem oscine que possuem a habilidade de aprendizagem vocal (Jarvis et al., 2000). O estudo do canto desses pássaros que aprendem a vocalizar (pássaros canoros) começou em 1958 com William Thorpe, que mostrou a necessidade do tentilhão (Fringilla coelebs) de ouvir a canção de um macho tutor adulto para a produção posterior de um canto individual próprio. Outros investigadores, como Peter Marler, Masakazu Konishi e Fernando Nottebohm seguiram a linha de Thorpe e abriram caminhos para uma geração de estudiosos contribuindo no estudo do comportamento e controle neural do canto (revisto em:(Brenowitz et al., 1997).

Pássaros canoros tem sido um sistema atrativo para o estudo das bases neurais do aprendizado devido à maneira com a qual aprendem a cantar imitando o pai ou um tutor, criando um padrão de canto próprio, que dura para o resto da vida do animal. O canto possui algumas características que o tornam um modelo versátil para o estudo da neurobiologia comportamental (Doupe & Kuhl, 1999; Williams, 2004), como (1) sua natureza estereotipada e mensurável; (2) a similaridade entre seu aprendizado e o aprendizado da fala humana, onde ambos aprendem essa vocalização complexa no início da vida, sendo ela dependente da escuta de um modelo (adulto) para que possa ser copiada e da escuta do seu próprio canto para que haja refino e manutenção deste na vida adulta e, para discernir qual o canto a imitar, existe uma predisposição inata para o aprendizado dos sons produzidos por indivíduos da própria espécie em detrimento daqueles produzidos por outros animais; (3) a caracterização precisa de um circuito dedicado exclusivamente à aquisição e outro à produção do canto onde centros motores e auditivos no telencéfalo interagem para controle da vocalização e (4) um período crítico para a aprendizagem desta. Em mandarins, essa aprendizagem do canto ocorre entre 30 e 95 dias, período conhecido como sensível para a aprendizagem vocal, porém, o desenvolvimento do canto acontece apenas nos machos, pois nesta espécie (como em vários outros oscinos), o tamanho dos núcleos do sistema do canto dos machos é aumentado quando comparados aos das fêmeas, que são bastante atrofiados (Nottebohm & Arnold, 1976); (MacDougall-Shackleton & Ball, 1999). Esse desenvolvimento depende de um tutor (sempre um macho) e é dividido em fases. Inicialmente, pássaros jovens apenas escutam o tutor para aquisição de um modelo de canto (aquisição de memória ou sensória). Em seguida, vem a fase sensório-motora, onde o animal começa a

vocalizar e escutar seu próprio canto. Essa retroalimentação (escutar o próprio canto) é necessária para a comparação do canto produzido com o canto aprendido (daí o nome “sensório-motora”). Esse canto inicial se desenvolve até um ponto bem estruturado, porém ainda variável. O processo estará apenas totalmente concluído quando o canto for cristalizado e se apresentar de forma estereotipada semelhante ao modelo apresentado pelo tutor. Esse processo de cristalização depende de testosterona para que seja completado (Brenowitz et al., 1997) e também da síntese local de ácido retinóico no núcleo HVC (Denisenko-Nehrbass et al., 2000).

Nos pássaros canoros, uma extensa rede de núcleos interconectados foi identificada como a responsável pelo reconhecimento, aprendizado e produção do canto, adequadamente chamada de “sistema do canto” (Nottebohm, 2000) que inexiste nos demais pássaros. O sistema do canto dos pássaros canoros consiste de três circuitos: um auditivo e dois ligados ao canto (um posterior e outro anterior). Os circuitos auditivo e vocais se comunicam sinapticamente via conexões da área auditiva do mesopálio caudolateral (CLM) para as áreas vocais do centro vocal superior (HVC) e núcleo interface (Nif) (Bauer et al., 2008) (ver tabela 6.7 para a definição das siglas).

-Vias ligadas ao canto:

As vias do canto destinadas à sua produção são exclusivas de pássaros que aprendem a vocalizar (oscinos, piscitaciformes e troquiliformes) (Jarvis et al., 2000). Nos pássaros canoros, a via posterior inicia-se no HVC, com neurônios projetando para o núcleo robusto do arcopálio (RA). Deste, projeções atingem o mesencéfalo no núcleo medial dorsal (DM) e tronco cerebral na parte traqueosiringeal do núcleo do hipoglosso (nXIIts), núcleos que controlam o órgão vocal (siringe) e os motoneurônios respiratórios. Nos pássaros canoros, esta via é responsável pela produção de vocalizações aprendidas (Nottebohm et al., 1976). A via anterior forma uma volta, iniciando na região palial, mais especificamente no núcleo magnocelular lateral do nidopálio anterior (LMAN), gânglios da base (área X), região talâmica (núcleo dorsolateral do tálamo medial - DLM) e de volta ao LMAN. Esta via é responsável pelo aprendizado vocal (Bottjer et al., 1984; Scharff & Nottebohm, 1991) e parece ter papel no contexto social, sintaxe e manutenção do canto adulto (Jarvis et al., 1998; Hessler & Doupe, 1999; Williams & Mehta, 1999; Brainard & Doupe, 2000; Kobayashi et al., 2001) (Figura 1.3A).

Figura 1.3: Esquemas dos circuitos responsáveis pelo canto. Em A, o circuito auditório de reconhecimento do canto

e, em B, as vias posterior (setas pretas) e anterior (setas brancas), além das vias de comunicação entre ambas (setas tracejadas). As siglas das estruturas apontadas estão apresentada na tabela 6.7. Modificado de Jarvis, 2005.

-Via auditiva.

Inicia nas células ciliadas auditórias, que se comunicam com o núcleo coclear (CN - tronco cerebral), núcleos da via lemnisco lateral (núcleos dorsal [LLD], intermediário [LLI] e ventral [LLV]), núcleos mesencefálicos (núcleo dorsolateral do mesencéfalo [MLd]), ovoidalis (Ov - núcleo talâmico), daí para neurônios telencefálicos primários no campo L (L2) e finalmente para neurônios secundários (L1, L3, mesopálio caudomendial [CMM], mesopálio caudolateral [CLM], NCM, shelf e cup). Dos núcleos superiores, mais especificamente da shelf adjacente ao HVC, vias descendem para a cup adjacente ao RA, e desta, de volta para os núcleos auditórios talâmicos e mesencefálicos (Mello et al, 1998). Recentemente foram identificadas conexões diretas do CMM com os núcleos vocais Nif e HVC tanto anatomicamente quanto funcionalmente (Bauer et al., 2008).

A

O Nidopálio Caudomedial (NCM)

O NCM (estrutura listrada na figura 1.2), juntamente com as demais áreas auditórias aferentes ao HVC e o resto do sistema do canto (representado na figura 1.3) é, em pássaros, considerado análogo às porções supragranulares dos córtices auditivo primário e de associação em mamíferos (Doupe & Kuhl, 1999). O NCM é facilmente identificado por ser uma região grande, com bordas ventral, dorsal e caudal definidas pela zona periventricular. Na parte rostral, seu limite é o Campo L2, porém lateralmente, seus limites não são distintos (esquema de cortes evidenciando o NCM na figura 3.2 – metodologia) (Mello & Clayton, 1994).

Quando um pássaro canoro recebe um estímulo acústico de um canto espécie-específico, seu telencéfalo é estimulado, e é o NCM a região que exibe a expressão mais robusta do gene de expressão imediata (IEG) zenk (também conhecido como zif-268, erg-1, NGFI-A e Krox-24 (Milbrandt, 1987; Christy et al., 1988; Lemaire et al., 1988; Sukhatme et al., 1988; Mello et al., 1992)). O IEG zenk é considerado um gene dependente de atividade neural e é expresso em resposta à despolarização neuronal (Milbrandt, 1987; Sukhatme et al., 1988). Ele é um fator de transcrição do tipo zinc-finger, que se liga ao seu sítio específico no DNA presente em genes distintos (Christy & Nathans, 1989; Pavletich & Pabo, 1991; Swirnoff & Milbrandt, 1995). Em mamíferos, a indução do zenk é relacionado com o fenônemo de potenciação a longo prazo (LTP) e formação de memória (Cole et al., 1989; Wisden et al., 1990; Abraham et al., 1993; Roberts et al., 1996; Jones et al., 2001). Além do zenk, o NCM expressa outros IEGs em resposta ao canto, como Arc, c-fos e c-jun (Mello & Clayton, 1994; Nastiuk et al., 1994; Bolhuis et al., 2000; Bailey & Wade, 2003; Velho et al., 2005). Para espressão de zenk e Arc no NCM, a via responsável é a iniciada com a ativação da MAP quinase (Velho et al., 2005). A expressão do zenk ocorre rápida e transientemente após o estímulo do canto (Mello et al., 1992; Mello & Clayton, 1994) tanto em machos quanto em fêmeas (Mello et al., 1992; Bailey & Wade, 2005) e é abolida quando o animal é ensurdecido (Jarvis & Nottebohm, 1997) e a expressão do mRNA zenk atinge seu pico em 30 minutos após o início do estímulo, ao passo que o da proteína ZENK ocorre entre 1 e 2 horas após o início do estímulo (Mello & Ribeiro, 1998).

Além da marcação do RNAm do zenk por hibridização in situ e da proteína por imunocitoquímica, dados eletrofisiológcos de registro multiunitário confirmam o fato de que o NCM é bastante responsivo à estímulos auditivos, em especial, àqueles específicos da espécie, o que confirma sua participação no processamento da informação sonora (Chew et al., 1995; Chew et al., 1996a; Stripling et al., 1997; Stripling et al., 2001). Evidências recentes sugerem que o NCM contenha a representação neural do canto aprendido (Bolhuis et al., 2000; Terpstra et al.,

2004; Phan et al., 2006). Recentemente, Gobes & Bolhuis (2007) mostraram que a lesão bilateral do NCM leva à uma deficiência no reconhecimento desse canto do tutor, sem prejudicar a produção do canto do animal

Quando um canto diferente é apresentado ao pássaro (seja um som reproduzido em laboratório ou o canto de um indivíduo na natureza), os neurônios do NCM são ativados e dois fenômenos ocorrem: uma resposta vigorosa de aumento

da atividade neuronal no NCM, como

visto por registros multiunitários (Chew et al., 1995) e um aumento na expressão de zenk (Mello

et al., 1992; Mello et al., 1994). Isso se deve ao fato de que neurônios do NCM de mandarins são mais responsivos a cantos de pássaros da mesma espécie do que outras classes de sons, sejam eles sons artificiais ou mesmo cantos de outras pássaros (Chew et al., 1996a), ao contrário de outros núcleos do sistema do canto, como o HVC (Margoliash, 1983), que mostram amplitudes de registro de campo in vivo similares para todos os sons testados, corroborando a hipótese de que o NCM tem função no reconhecimento do canto específico da espécie.

O NCM também apresenta plasticidade na forma de uma habituação à canção. Enquanto que a apresentação de um novo estímulo espécie-específico a um pássaro canoro desencadeia um aumento na atividade dos neurônios do NCM, à medida que o estímulo sonoro é repetidamente apresentado, a amplitude dos potenciais multiunitários registrados neste núcleo decresce, bem como a resposta unitária (figura 1.4 – Chew, Mello et al. 1995).

Figura 1.4: Registros eletrofisiológicos de NCM de mandarins evidenciando o fenômeno da habituação. Em A,

registro multiunitário da resposta à apresentação de novas canções repetidamente a 25 pássaros. Os pontos representam as médias das respostas ±EPM como função do número de repetições das canções. As amplitudes dos registros foram normalizadas com o valor obtido na primeira apresentação (100%). Em B, registros unitários de um mesmo pássaro com estimulação por uma canção apenas. Todos os pontos indicam média ± EPM. Adaptado de Chew, Mello et al. 1995.

Isso constitui o processo da habituação, que ocorre especificamente para cada um dos novos estímulos aplicados ao animal, ou seja, para cada canto novo, uma atividade aumentada é observada, seguida de decréscimo da magnitude da resposta ao estímulo conforme o número de repetições. Essas alterações podem durar até 20 horas para as canções espécie-específicas e até 4 horas para os demais sons (Chew et al., 1995) e são dependentes da síntese de proteína para a sua manutenção (Chew et al., 1996a).

Além das alterações eletrofisiológicas que ocorrem no NCM no processo de habituação, alterações em nível molecular também são observadas. Um estímulo de apenas 10 minutos já é o suficiente para que haja um aumento no RNAm do gene zenk nos neurônios do NCM, com um pico de indução desse RNAm após aplicação de um estímulo de 30 minutos (Mello & Clayton, 1994). Porém, se o estímulo for sustentado por um período maior do que o de meia hora, o que ocorre é uma diminuição nos níveis de zenk e, quanto mais prolongado o estímulo, menor a indução do RNAm, como mostrado na figura 1.5. Da mesma maneira que os registros eletrofisiológicos, os níveis de indução do RNAm do zenk são restabelecidos após um período de “treinamento” de 2,5 horas se um estímulo diferente de 30 minutos de duração é aplicado (Mello et al., 1995).

Figura 1.5: Níveis de RNAm de zenk e sua indução perante os diferentes tempos de estimulação. Cada ponto

representa a quantificação de RNAm por densitometria após uma hibridização in situ do NCM de um mandarim macho logo após o término da estimulação (círculos fechados). Os animais tidos como controle basal foram mantidos isolados de qualquer estímulo (círculos abertos) e a quantidade de zenk é mostrada como múltiplos da quantidade contada em níveis basais. Adaptado de Mello et al (1995).

Pouco se sabe quanto à fisiologia celular e sináptica dos neurônios do NCM. Pinaud et al. (2004) mostraram que aproximadamente metade dos neurônios do NCM são GABAérgicos, e que podem expressar zenk em resposta à canção. Esses neurônios parecem estar inibindo uma atividade glutamatérgica forte, pois a inibição das correntes sinápticas por bicuculina levou ao aparecimento de correntes glutamatérgicas espontâneas não vistas previamente à aplicação da droga (Pinaud et al., 2004). Alem disso, o NCM recebe intensa inervação noradrenérgica (Mello et al., 1998) e expressa a enzima aromatase em sua parte caudal (Pinaud et al., 2006). Entretanto, os substratos sinápticos da fisiologia do NCM ainda são desconhecidos.

Apesar da quantidade de informações obtidas por análise de expressão gênica e eletrofisiologia in vivo no NCM, nada se sabe sobre a fisiologia da neurotransmissão nesse núcleo. Tendo em vista a relevância desse núcleo para o reconhecimento da memória auditiva em pássaros e das potenciais correlações que podemos fazer com esses processos em mamíferos, resolvemos investigar usando técnicas eletrofisiológicas in vitro a fisiologia da neurotransmissão em fatias a fresco do NCM de mandarins (Taenopyigia guttatta) (o modelo mais utilizado no estudo da neurobiologia do canto) e sua plasticidade em resposta ao estímulo biológico, no caso, o canto específico do pássaro. Para isso, usamos pássaros em duas condições: isolados acusticamente por 12 horas (controles) e estimulados pelo canto (estimulados). Nosso paradigma é que a estimulação canora ativaria neurônios específicos do NCM (evidenciados pela expressão do IEG zenk) e alteraria sua fisiologia gerando um substrato para o fenômeno de plasticidade da habituação ao canto.

3.1 - Animais

Os animais utilizados nos experimentos foram mandarins machos e fêmeas (Taeniopygia guttata) (Figura 3.1), pássaros pertencentes à ordem passeriforme, subordem passeri (oscine), família passeridae e subfamília estrildinae, nativos da região da Austrália, Timor Leste e Indonésia, porém criados como pássaros ornamentais em todo o mundo.

Figura 3.1: Espécimes de mandarins. À esquerda, uma fêmea e à direita, um macho. Notar o dimorfismo no fenótipo

da plumagem dos animais.

Todos os espécimes foram adquiridos de criadores locais, mantidos no biotério do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto em gaiolas com água e comida à vontade e mantidas junto à janela para um ciclo claro/escuro com luz naturalPara cada experimento, um animal foi usado por vez. Um dia antes do experimento, o animal escolhido foi retirado do biotério e transferido para uma câmara acústica (Insight Instrumentos) dentro do Laboratório de Fisiologia e Plasticidade Sináptica e mantidos dentro de uma gaiola com água e comida à vontade pelo período de uma noite. Um temporizador automático acoplado a uma luminária foram usados para ditar o ciclo claro/escuro da câmara.

3.2 - Estímulo

Na manhã do dia seguinte ao isolamento, os animais tiveram um dos dois destinos:

_Animais controle: os mandarins foram sacrificados por decapitação cerca de 15 minutos após o acender das luzes da caixa de isolamento acústico.

_ Animais estimulados: os mandarins foram estimulados acusticamente com uma reprodução de 7 canções espécie-específicas jamais ouvidas por estes animais durante 15 s em intervalos de 45 s por aproximadamente meia hora. Após uma hora do término das canções (esse

intervalo após o estímulo corresponde ao tempo necessário para que ocorra o pico de expressão do ZENK (Mello & Ribeiro, 1998)) os animais foram então sacrificados por decapitação.

O estímulo acústico foi aplicado aos animais pela reprodução de um CD contendo as canções dos mandarins por um tocador de CDs portátil conectado a duas caixas acústicas localizadas dentro da caixa de isolamento. O nível de intensidade acústica (72 - 76 dB) foi medido por um medidor de decibéis portátil (Radio Shack). As canções foram obtidas no zebrafinch song archive (http://wso.williams.edu/~hwilliam/ZFsongs/) na página da Internet da Dra. Heather Williams (Departamento de Biologia, Williams College, Williamstowm, MA. EUA). O protocolo de estimulação usado seguiu os parâmetros dos protocolos utilizados para a estimulação da expressão da proteína ZENK (Mello & Clayton, 1994).

Todo o procedimento foi aprovado de acordo com o protocolo do comitê de ética no 024/2003 aprovado pelo CETEA-FMRP.

3.3 - Confecção das fatias

Os cérebros dos mandarins foram cuidadosamente removidos após a decapitação e imediatamente colocados em solução de corte, o aCSF (artificial cerebrospinal fluid) modificado para corte (com alta sacarose – Tabela 6.2), gelado e pré-borbulhado com mistura carbogência (95%O2 e 5% CO2) para ajuste do pH (7,3 – 7,4). Depois de mergulhados no aCSF, os

hemisférios foram separados com a ajuda de uma lâmina de bisturi e colados independentemente em uma plataforma, apoiados por um bloco de agar 4% para corte em vibrátomo (Vibratome, série 1000 - manual), onde foram feitos cortes parassagitais de 200 µm de espessura orientados da porção medial para a porção lateral.

O NCM não possui limites claramente identificáveis em sua porção lateral. Devido a essa característica, em nosso protocolo de corte, retiramos de cada um dos hemisférios no máximo 4 – 5 fatias de 200 µm, como ilustrado pelos desenhos em câmara clara da figura 3.2, onde o esquema do NCM usado em nossos registros eletrofisiológicos está pintado em cinza.

Depois de cortadas as fatias, transferimo-las para um becker com a mesma solução de corte borbulhada com mistura carbogência, porém à temperatura ambiente, onde ficaram descansando por pelo menos uma hora antes dos registros.

Figura 3.2: Desenho em câmara clara de diferentes níveis do cérebro de mandarim. Os cortes são mostrados

iniciando na porção medial (mais acima) e terminando na porção lateral (abaixo). A estrutura pintada em cinza e apontada como “1” é a porção do NCM utilizável em experimentos. 1 – NCM; 2 – Terceiro ventrículo; 3 – Hipocampo; 4 – Cerebelo; 5 – Campo L. Desenho: Dr. Eric Jarvis, Duke University, NC-USA, disponibilizado em http://avianbrain.org/.

3.4 - Eletrofisiologia

3.4.1 - Visualização dos neurônios

Os neurônios do NCM foram visualizados através de um microscópio Olympus BX51WI com sistema de Contraste por Interferência Diferencial (DIC) acoplado a uma câmera Hamamatsu (modelo C7500-50) e um monitor monocromático SONY. Ao visualizar o NCM no monitor, este não apresenta uma organização celular distinta, sendo composto de neurônios homogeneamente distribuídos, como pode ser visto na figura 3.3. Todo o sistema é permanentemente mantido sobre uma mesa pneumática (TMC) para o isolamento mecânico do ambiente.

Figura 3.3: Imagem capturada com sistema DIC com uma objetiva de 60x de neurônios do NCM.

3.4.2 - Whole cell patch clamp

O sistema de registro é composto por um amplificador HEKA, modelo EPC-10, com ligação direta via fibra óptica a uma placa de aquisição integrada (LIH 1600) acoplada a um computador tipo PC para processamento e armazenamento dos dados no disco rígido para posterior análise. A configuração usada para todos os registros foi a de whole cell patch clamp, com fixação da voltagem para visualização das correntes sinápticas – voltage clamp.

Pipetas de borossilicato (DE: 1,5 mm; DI: 0,86 mm) com filamento interno (Sutter Instruments) foram confeccionadas com um puxador de pipetas Sutter P-97 e preenchidas com solução interna de pipeta contendo cloreto de césio como soluto principal (Tabela 6.3) ou

metanosulfonato de césio (Tabela 6.4), filtradas com filtros de 20µm (Millipore), resultando em pipetas com resistências entre de 3-6MΩ aproximadamente quando mergulhadas na solução de registro. A solução de perfusão da fatia usada foi o aCSF (Tabela 6.1) borbulhado com mistura carbogênica (95%O2 e 5% CO2). As soluções e drogas foram aplicadas às fatias por um sistema

de múltiplas vias impelido por força gravitacional, confeccionado no próprio laboratório. A remoção das soluções foi toda feita através de pressão negativa por bomba de sucção.

Depois da pipeta preenchida e acoplada ao probe com um eletrodo de prata cloretado, esta foi então mergulhada no aCSF do banho e uma pressão positiva aplicada através de uma seringa de 10 mL. A aproximação da pipeta ao neurônio foi feita com um micromanipulador hidráulico (Syskiu Instruments). Quando a ponta da pipeta tocava o neurônio escolhido, a pressão era inicialmente igualada à atmosférica e em seguida, aplicava-se uma leve sucção. Com isso, resistência da pipeta aumentava para algumas centenas de MΩ e a configuração cell attached era formada e a capacitância da pipeta eletronicamente cancelada. Com um pouco mais de sucção, o retalho da membrana na boca da pipeta era rompido e o modo whole cell, configurado. Os neurônios foram mantidos a -70 mV e os valores de capacitância de membrana (Cm) e resistência em séria (RS) obtidos. Os valores de RS foram constantemente monitorados e, registros com valores de RS superiores à 30 MΩ foram descartados. A maioria dos registros teve sua RS compensada digitalmente (lag de 10 µs) em até 80%.

3.4.3 - Registro das correntes sinápticas

As correntes foram filtradas low-pass a 3 KHz e adquiridas a 10 kHz. Dois registros de 60 segundos cada um foram adquiridos por condição (com ou sem droga). Os dados de corrente foram adquiridos com o software PULSE (HEKA). Todos os registros foram iniciados após 5 minutos da configuração de whole cell ter sido estabelecida, para estabilização do sistema. Para os protocolos de aplicação de droga, o registro foi feito apenas depois de 5 mL de solução com droga ter passado pelo banho (aproximadamente 4 minutos).

As correntes inibitórias pós-sinápticas espontâneas (sIPSCs) foram isoladas através da aplicação de 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX) numa concentração de 20 µM. Os registros foram feitos em um holding de -70 mV (ao menos quando indicado um valor diferente) e solução interna de pipeta com CsCl como soluto principal. As correntes excitatórias pós-sinápticas espontâneas (sEPSCs), foram isoladas pela aplicação de bicuculina 10 µM e todos os registros foram feitos a -70 mV quando o CsCl foi usado como soluto principal da solução interna de pipeta. Alguns experimentos foram conduzidos com solução interna contendo metanosulfonato

de césio como principal sal a fim de medirmos as correntes sinápticas em uma situação de baixo cloreto intracelular, assim como alguns neurônios foram registrados em current-clamp usando solução interna de pipeta com gluconato de potássio como principal soluto (tabela 6.5).

As correntes pós-sinápticas miniatura (mPSCs) foram registradas na presença de tetrodotoxina (TTX) 1 µM ao banho associada a um dos dois antagonistas (DNQX ou bicuculina) nas concentrações descritas.

3.5 - Análise dos dados

Todos os gráficos e análises estatísticas foram realizadas no programa Prism (GraphPad; versão 4.02), com exceção da análise das curvas de fração cumulativa, as quais foram feitas no Microsoft Excel. As análises consistiram de Análise de Variância (ANOVA) de duas vias quando duas variáveis foram confrontadas, teste t pareado e não pareado quando apenas uma variável foi levada em consideração e parâmetros “D” (maior diferença entre as duas distribuições) e mediana para comparação de curvas de fração cumulativa.

As análises das correntes espontâneas foram feitas no programa Mini Analysis (Synaptosoft). Os registros foram primeiramente escolhidos e transformados em um formato legível pelo sistema (ABF), em seguida, os parâmetros de análise do programa foram ajustados para cada arquivo individual e as correntes foram visualizadas uma a uma e marcadas manualmente. O programa nos retornou os dados de interesse (freqüência, amplitude e half-width [medida correspondente à largura do sPSC no ponto médio de sua amplitude]) em forma de uma tabela com as médias de cada um dos registros, de onde foram anotados e organizados em planilhas no Microsoft Excel.

A análise da cinética das correntes sinápticas em miniatura foi feita no programa Mini Analysis usando-se a média de todos os eventos registrados em um arquivo de um minuto após o isolamento farmacológico dos sIPSCs ou sEPSCs e aplicação de TTX, como mostrado na figura 2.3. A partir do traçado médio, os valores de constante de tempo (τ), decaimento e half width foram calculados e os gráficos montados no GraphPad-Prism.

Figura 2.3: Traçados individuais agrupados (A) e a média dos mesmos (B) calculados na interface de análise de grupo

do programa Mini Analysis.

Os gráficos de fração cumulativa foram construídos no GraphPad-Prism como média de vários traçados distintos gerados pelo programa Mini Analysis (Figura 2.4).

Figura 2.4: Exemplo de construção do gráfico das médias das curvas de fração cumulativa.

O nível de significância dos testes realizados foi de 0,05 e os resultados em barra são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM).

3.6 - Imunocitoquímica

Usamos a imunocitoquímica (ICC) para evidenciar a expressão do gene zenk através da marcação com diaminobenzidina (DAB) de seu transcrito ZENK. O material que utilizamos para tal foram fatias obtidas através do mesmo protocolo de corte daquelas utilizadas nos experimentos de eletrofisiologia, as quais retiramos diretamente do vibrátomo para o paraformaldeído (4%), onde permaneceram por meia hora e depois as lavamos em tampão fosfato com salina (PBS – Tabela 6.6 da lista de soluções) por 3 vezes com duração de 20 minutos cada lavagem. Depois de fixadas as fatias, as estocamos em geladeira por até quatro dias para que as reações de ICC das demais fatias coletadas durante a semana fossem desenvolvidas em conjunto.

Iniciamos as ICCs incubando as diferentes fatias em poços numa placa de cultura de acrílico e mergulhando-as em solução de H2O2 a 0,3% por 10 minutos, seguida de lavagem em

PBS, 3x por 20 minutos cada. Um bloqueador, a albumina de soro bovina (bovine serum albumine - BSA) foi adicionado e mantido por uma hora. Após essa etapa, incubamos as fatias com o anticorpo primário para ZENK (Anti-erg1, Santa Cruz Biotechnology – SC189) a uma diluição de 1:500 (estoque: 200µg/mL) em geladeira por dois dias. O passo seguinte foi a lavagem das fatias em PBS 3x por 15 minutos seguido da aplicação do anticorpo secundário biotinilado goat-anti-rabbit (Chemicon International ap132b – 2mL) diluído 1:50 durante duas horas. O preparo do complexo amplificador avidina-biotina (Vectastain Elite ABC Kit) feito pelo menos meia hora antes de sua adição, consistiu na reação de 40 µL da solução com avidina combinada com 40µL da solução com biotina com volume completado pra 1mL. Após a ligação do antígeno com o anticorpo secundário, as fatias foram lavadas em PBS 3x por 30 minutos e colocadas para reagir com o complexo AB por duas horas, com posterior lavagem com PBS 3x de 15 minutos. A reação de coloração com DAB foi feita pingando-se a solução previamente preparada (1 mg/mL de DAB, H2O2 (30%) 1:1000 em PBS) sobre as fatia montadas em uma lâmina super frost por pelo menos

5 minutos.

A montagem das lâminas com Etellan foi feita no dia seguinte, após desidratação com lavagem dos espécimes em uma série de soluções alcoólicas (70%, 90% e 100%) e deslipidização em Xilol.

4.1 – Expressão da proteína ZENK em resposta ao canto.

A expressão do gene zenk pode ser evidenciada pela marcação por imunocitoquímica de seu transcrito ZENK. Como essa proteína é expressa quando o pássaro é estimulado por um canto co-específico, sua expressão nas fatias serve como um controle da eficácia do protocolo de estimulação e do isolamento acústico do pássaro. Após um protocolo de estimulação, espera-se que a proteína ZENK seja expressa em grande quantidade; por outro lado, se o animal é mantido sem estímulo, sua expressão é esperada ser baixa.

Na figura 4.1B, observamos que no NCM de pássaros controle a expressão de ZENK é baixa, enquanto que no NCM dos pássaros estimulados é claramente maior (figura 4.1A) (pássaros controle: 85 ± 43 células marcadas, n = 5; pássaros estimulados: 411 ± 196 células marcadas, n = 4). Dentro de nossas estimativas observamos uma grande variação da resposta ao zenk intra-grupo e, um possível motivo de variação pode ter sido diferentes qualidades da marcação. Para isso comparamos 4 fatias (2 controle e 2 estimuladas) que foram submetidas ao mesmo protocolo de marcação por DAB na mesma lâmina (Figura 4.1C). Nessas fatias, fica claro que mesmo com essas variações, os pássaros estimulados apresentaram uma expressão de ZENK maior do que os controles. Esses dados mostram que tanto o isolamento acústico quanto a estimulação canoro à qual submetemos os pássaros são eficientes e que o procedimento de sacrifício do animal e obtenção das fatias não estimula a expressão de ZENK.

Figura 4.1: Número de células que expressam ZENK no NCM. ICC para ZENK mostrando células do NCM de um

pássaro estimulado marcadas positivamente (A) e ausência de marcação no NCM do pássaro controle (B). Em C, médias do número de células marcadas no NCM de mandarins machos e fêmeas pertencentes a uma mesma reação de ICC. Traços expressam médias e pontos, os valores individuais.

4.2 – Caracterização das correntes sináptica espontâneas (sPSCs) registradas s no NCM.

Quando as células do NCM dos mandarins foram mantidas em voltage clamp a -70mV, observamos quase sempre a presença de correntes sinápticas espontâneas, representadas por deflexões rápidas da corrente basal com um retorno à linha de base mais lento (Figura 4.2). Essas correntes refletem a liberação de neurotransmissores pelos neurônios que fazem sinapses com o neurônio registrado.

Figura 4.2: Exemplo de registro de sPSCs em voltage clamp de neurônio do NCM de mandarim. Registro feito a

-70 mV com solução interna de pipeta de CsCl.

Para que pudéssemos observar quais os transmissores responsáveis pelos sPSCs no NCM, aplicamos antagonistas farmacológicos dos receptores ionotrópicos glutamatérgicos AMPA/kainato (DNQX) e GABAA (bicuculina) no NCM de pássaros controle. A aplicação de bicuculina ao banho produziu uma redução significativa tanto na freqüência (de 3,0 ± 0,31 Hz para 0,5 ± 0,1 Hz [85 ± 3 %]; n = 22; p<0,001) quanto na amplitude (de 44 ± 4 pA para 25,5 ± 1,3 pA [20,5 ± 1,3 %]; n = 22; p<0,001) dos sPSCs (Figuras 4.3A [traçado] e 4.4 [gráfico]). Já a aplicação de DNQX teve um pequeno efeito inibitório, porém não significativo, sobre a freqüência e a amplitude dos sPSCs (de 4,3 ± 0,4 Hz para 3,14 ± 0,3 Hz [21,6 ± 5,5 %] e de 50,5 ± 4 pA para 40 ± 2,5 pA [16,2 ± 3,2 %] respectivamente; n = 41; p<0,05 – Figuras 4.3B [traçado] e 4.43 [gráfico]). Quando aplicamos ambos DNQX e bicuculina ao banho, os sPSCs foram totalmente bloqueados (Figura 4.3C). Assim, concluímos que os sPSCs registrados nos neurônios do NCM são gerados pela ativação de receptores glutamatérgicos e GABAérgicos, e que a transmissão GABAérgica é mais abundante do que a glutamatérgica.

Figura 4.3: Efeito dos antagonistas glutamatérgico (DNQX) e GABAérgico (bicuculina) sobre os sPSCs no NCM de mandarins. Em A, exemplo de registro em voltage clamp (-70 mV) de sPSCs (controle) seguido da aplicação de

bicuculina. Em B, exemplo de registro em voltage clamp (-70 mV) de sPSCs seguido da aplicação de DNQX. Em C, o efeito da bicuculina e DNQX aplicados juntos ao banho. A figura D mostra a fração cumulativa referente às freqüências em situação controle (sem droga), com aplicação de DNQX (GABA) e aplicação de bicuculina (Glutamato).

Figura 4.4: Neurotransmissões GABAérgica e glutamatérgica no NCM de mandarins. Gráficos das médias ±

EPM das freqüências (A) e amplitudes (B) dos sPSCs, sIPSCS e sEPSCs. Teste t pareado entre “sem droga” e “com droga” (bicuculina ou DNQX); ***=P<0,001.

A

4.2.1 - Correntes Pós-sinápticas Miniatura (mPSCs)

Visto que GABA e glutamato são os responsáveis pela transmissão espontânea que observamos no NCM, decidimos estudar as características cinéticas das correntes sinápticas inibitórias e excitatórias no NCM. Para isso, utilizamos as correntes sinápticas miniaturas registradas na presença do bloqueador de canais de sódio tetrodotoxina (TTX). As correntes miniaturas refletem a liberação de uma ou poucas vesículas por vez (quanta) e por isso são ideais para o estudo da cinética dos receptores presentes na fenda sináptica.

Observamos que as correntes GABAérgicas são muito sensíveis à aplicação de TTX, sofrendo uma grande inibição tanto da freqüência (3,1 ± 0,4 Hz para 0,2 ± 0,02 Hz; n = 17; p<0,001) quanto da amplitude (40,5 ± 4,2 pA para 30,2 ± 2,3 pA; n = 17; p<0,05) (Figura 4.5A [gráfico] e 4.6A [traçados]). As correntes glutamatérgicas por sua vez, não foram significativamente inibidas pela aplicação de TTX (freqüência de 0,78 ± 0,3 Hz e amplitude de 35,1 ± 3,7 pA apenas com bicuculina para 0,5 ± 0,2 Hz e 30,3 ± 3,1 pA com bicuculina e TTX; n = 6; p>0,05) (Figura 4.5B [gráfico] e 4.6B [traçado]). Com isso, concluímos que os sIPSCs no NCM são gerados pelo disparo de potenciais de ação de neurônios GABAérgicos, enquanto que os sEPSCs são basicamente independentes de potenciais de ação, podendo ser consideradas per se como correntes miniatura (mEPSCs) (notar a semelhança do registro dos sEPSCs e mEPSCs nas ampliações da figura 4.6B).

Figura 4.5: Sensibilidade dos sEPSCs e sIPSCs à TTX: Efeitos da aplicação de TTX 1 µM sobre a freqüência e a

amplitude dos sIPSCs (A) e sEPSCs (B). Barras expressam médias ± EPM. Teste T; *=p<0,05.

B

A

Figura 4.6: Ação da TTX sobre os sPSCs. Em B, exemplos de traçados em Voltage Clamp onde a TTX

1µM é aplicada junto com DNQX (A) ou bicuculina (B). Os quadros em B mostram em maior detalhe os formatos dos sIPSCs e mIPSCs.

A

A partir dos mesmos registros analisados para medida de freqüência amplitude dos mEPSCs e mIPSCs da figura 4.5, obtivemos off-line um traçado que representa a média das correntes miniatura em 4 células escolhidas aleatoriamente para cada uma das neurotransmissões (figura 4.7A) (vide métodos). Deste traçado, medimos os valores de amplitude, half width e ajustamos o decaimento com uma função exponencial dupla, obtendo com isso os valores das constantes de tempo (τ1 e τ2). Observamos que os mIPSCs possuem amplitude e half width maiores que as dos mEPSCs (Tabela 4.1 e Figura 4.7B). As medidas calculadas de half-width e de τ (Tabela 1 e Figura 4.5B) são menores nos mEPSCs do que nos mIPSCs, mostrando sua cinética de decaimento mais rápida.

Amplitude (pA) Half Width

τ

_{1 (ms)}

τ

_{2 (ms)}

mIPSCs 29,1 ± 1,6 12,2 ± 1 12,4 ± 1,8 40,1 ± 7,1

mEPSCs 15,8 ± 1,2*** 5 ± 0,3*** 3,4 ± 0,4** 11,6 ± 4,02*

Tabela 4.1: Valores de amplitude, half width e τ 1 e 2 para mIPSCs (4 células) e mEPSCs (4 células) do

B

_i

iii

ii

A

i ii

Figura 4.7: Cinética dos mPSCs do NCM de machos. Em Ai, o registro médio de 27 mIPSCs;

em Aii, registro médio de 20 mEPSCs, ambos de uma única célula. Rise time (10-90%): pontos amarelos; decay (90-37%): pontos lilás; pico: “X” vermelho: linha de base: “X” e linha verdes;

curva de ajuste da dupla exponencial: linha

vermelha [equação de ajuste: y = A1 * exp ( -x / tau1) + A2 * exp (-x / tau2) + Baseline]. Em Bi, as medidas de amplitude dos mIPSCs e mEPSCs, em Bii, suas half width e em Biii seus respectivos τ1 e τ2. Barras expressam médias ± EPM. Teste T. *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001.

4.2.2 - Caracterização dos sIPSCs e dos sEPSCs quanto ao potencial de reversão.

Com uma solução interna de pipeta contendo CsCl como íon principal, onde a concentração de cloreto é alta, as correntes inibitórias e excitatórias exibem padrões de sentido e reversão similares (correntes para dentro e reversão em 0mV) devido à força eletromotriz que age sobre os íons, puxando os cátions para dentro da célula e empurrando os ânions para fora dela com a mesma intensidade. Para investigar o comportamento das diferentes correntes isoladamente, sem a intervenção farmacológica, utilizamos uma solução interna de pipeta contendo, como íon principal, o metanosulfonato de césio (CsMSO4). Com ela, separamos os sIPSCs e sEPSCs de acordo com seus respectivos potenciais de reversão. Nessa solução obtivemos um potencial de reversão calculado para o cloreto de –52 mV, descontando um potencial de junção estimado em 14 mV (estimado usando-se a mobilidade do gluconato), um valor próximo ao observado experimentalmente, de -47 mV.

Para registrarmos os sEPSCs, mantivemos o neurônio no potencial de reversão observado para o cloreto (47 mV) (Figura 4.8Ai). Para registrarmos os sIPSCs, mantivemos o neurônios a -20 mV onde os sIPSCs apresentavam polaridade positiva e sEPSCs polaridade negativa (Figura 4.8Aii). Inicialmente, observamos que as freqüências dos sIPSCs e dos sEPSCs foram pouco alteradas após a aplicação de droga (Figura 4.6B). Porém, observamos uma redução não significativa da freqüência dos sIPSCs em -20mV comparados com os valores a -70mV (Tabela 4.2). O mesmo não foi observado com os sEPSCs nos diferentes potenciais. Com isso, concluímos que a interação entre as neurotransmissões (estimulação da neurotransmissão GABAérgica pela à glutamatérgica), se existir, deve ser pequena.

Tabela 2: Freqüências e amplitudes dos sIPSCs e sEPSCs registrados em diferentes potenciais antes e após a aplicação

de DNQX (sIPSCs) ou bicuculina (sEPSCs). Resultados mostrados como média ± EPM. Testes t; p>0,05.

Grupo (n) Freqüência (Hz) sIPSCs -70 mV (n = 43) 3,2 ± 1,9 sIPSCs -20 mV (n = 21) 2,0 ± 0,3 sIPSCs -20 mV [DNQX] (n = 21) 2,1 ± 0,4 sEPSCs -70 mV (n = 27) 0,5 ± 0,4 sEPSCs -47 mV (n = 3) 0,5 ± 0,1 sEPSCs -47 mV [Bicuculina] (n = 3) 0,6 ± 0,2

A

-47 mV

ii

-20 mV

i

Figura 4.8: Correntes registradas com uma solução interna de baixo cloreto (metanosulfonato de césio). Em

A, (i) registro a -47 mV, onde a corrente glutamatérgica é observada e a GABAérgica encontra-se no seu ponto de reversão e (ii) a -20 mV, onde as correntes GABAérgicas (correntes de saída) são observadas junto às glutamatérgicas (correntes de entrada) num mesmo registro. Em B, (i) freqüência dos sIPSCs num potencial de -20mV antes e após a aplicação de DNQX 20 µM e (ii) freqüência dos sEPSCs num potencial de -47mV antes e após a aplicação de bicuculina. Barras expressam médias ± EPM. ANOVA de duas vias. P>0,05.