3.4 Mecanismos de crescimento dos nanofilmes
3.4.1 Crescimento linear
O crescimento linear é observado em nanofilmes construídos a partir de pares de polieletrólitos fortes, como por exemplo, poli(estireno sulfonato de sódio) (SPS) e poli(cloreto de dialildimetilamônio) (PDAC) ou polieletrólitos fracos com alta densidade de carga, uma vez que o excesso de densidade de carga dos segmentos das cadeias poliméricas impede que ocorra a difusão de cadeias livres destes polieletrólitos.
Neste tipo de crescimento, as cadeias depositadas na camada n interagem somente com as cadeias de carga oposta depositadas na camada n+1 e cada etapa de deposição resulta em um aumento constante de espessura/bicamada. A Figura 3.7 ilustra o crescimento linear de um nanofilme de SPS/PDAC.
Figura 3.7 Representação esquemática do mecanismo de crescimento linear de nanofilmes de SPS/PDAC
Vale ressaltar que um nanofilme com crescimento linear pode crescer exponencialmente quando as condições de construção dos mesmos são alteradas. Salomaki, Vinokurov e Kankare (2005) verificaram que o aumento da temperatura modificou o crescimento de nanofilmes de SPS/PDAC, tornando-o exponencial. Guzman et al., (2009) também constataram a mudança no mecanismo de crescimento de nanofilmes de SPS/PDAC através do aumento da concentração de sal (NaCl) nas soluções dos polieletrólitos.
3.4.2 Crescimento exponencial
O crescimento exponencial é observado em nanofilmes construídos com pelo menos um polieletrólito fraco. Este crescimento é caracterizado pela difusão “in” e “out” de um dos polieletrólitos, resultando em um comportamento não linear da espessura em função da deposição sequencial de bicamadas.
Picart et al. (2002) realizaram um estudo pioneiro que comprovou que polieletrólitos fracos podem difundir-se por toda a estrutura dos nanofilmes. Os autores constaram que cadeias de poli(L‐lisina) (PLL) se difundiram para dentro e fora do nanofilme construído com HA através de marcadores fluorescentes nas soluções dos polímeros.
Lavalle et al. (2004) propuseram um mecanismo de crescimento exponencial para nanofilmes construídos PLL e HA. Conforme representação esquemática apresentada na Figura 3.8, após a deposição de uma camada de HA e lavagem para retirar as cadeias fracamente
adsorvidas, a carga superficial torna-se negativa (Figura 3.8 (a)). Na sequência, ocorre a deposição da camada de PLL e parte das cadeias deste polieletrólito é complexada com a camada externa de HA e parte difunde-se para dentro do nanofilme (Figura 3.8 (b)). Estas últimas cadeias são denominadas cadeias livres, as quais não irão interagir com as cadeias de HA depositadas anteriormente. Depois, ocorre à etapa de lavagem e algumas cadeias de PLL que estão difundidas no interior do nanofilme agora migram para fora do mesmo, porém algumas cadeias não conseguem ultrapassar a barreira eletrostática formada pelo excesso de carga positiva na superfície devido à adsorção das cadeias de PLL (Figura 3.8 (c)). Por fim, ocorre a deposição da camada de HA, a qual interage com as cadeias de PLL da superfície e as que estão livres no interior do nanofilme (Figura 3.8 (d)), resultando na formação de uma bicamada através da complexação dos polieletrólitos. Nesta etapa ocorre a neutralização da barreira eletroestática formada anteriormente e inversão de carga superficial (Figura 3.8 (e)).
A espessura da nova bicamada do nanofilme de HA/PLL é proporcional a quantidade de cadeias de HA necessárias para neutralizar as cadeias de PLL da superficie e as que difundiram- se para fora do nanofilme, como ilustrado na (Figura 3.8 (d)).
Figura 3.8 Representação esquemática do mecanismo de crescimento exponencial de nanofilmes de HA/PLL, baseado na difusão do policátion. Adaptado de Lavalle et al., 2004.
Observa-se na literatura abordagens que relatam que o crescimento exponencial dos nanofilmes é finito e que este pode crescer de forma linear com a quantidade de bicamadas depositadas, no entanto, está transição de crescimento ainda não é totalmente compreendida. Tomando como exemplo o mecanismo apresentado na Figura 3.8, estima-se que quanto mais camadas são depositadas, menor será a difusão das cadeias livres de PLL pelo nanofilme , pois ocorre uma reestruturação das primeiras camadas depositadas, as quais impedem a difusão das cadeias de PLL. Esta região reestruturada aumenta com a deposição das bicamadas, tornando a espessura do nanofilme constante (Porcel et al., 2006). Outra abordagem para a mudança de crescimento exponencial para linear dos nanofilmes está relacionada com a variação de pH (Bieker e Schoenhoff, 2010; Vidyasagar et al., 2012) e adição de sal (Tang e Besseling, 2016), pois estes parâmetros influenciam as interações dos polieletrólitos devido a mudança da densidade de carga das cadeias poliméricas.
3.5 Adesão bacteriana
Na natureza, observa-se que grande parte das bactérias adere a superfícies sólidas e forma uma camada viscosa e escorregadia, conhecida como biofilme. Esta estrutura constitui um modo de crescimento que permite a sobrevivência destes micro-organismos em um ambiente hostil (Costerton, Stewart e Greenberg, 1999).
Os biofilmes são formados por microcolônias em forma de cogumelo encapsuladas em uma matriz exo-polimérica, composta principalmente por exo-polissacarídeos. As células que constituem os biofilmes apresentam alta resistência a biocidas convencionais e tratamentos antibacterianos, quando comparadas com células planctônicas (livres em solução), tornando-as muito difíceis de serem erradicadas em hospedeiros vivos (Donlan, 2002; Sauer, 2003).
O modelo mais aceito para a formação de biofilmes envolve a transição de cinco fases distintas de organização celular, apresentadas na Figura 3.9 (Sauer, 2003). Na fase (1), as células bacterianas aderem reversivelmente à superfície e podem ser removidas com facilidade. Em seguida, na fase (2), as células aderem de forma irreversível através de interações espec íficas. Na fase seguinte (3), inicia-se a primeira fase de maturação do biofilme, através do desenvolvimento de sua arquitetura. Na sequência (4), a maturação do biofilme está completa e este apresenta uma
arquitetura complexa e alta densidade celular. Finalmente, na fase de dispersão (5), ocorre a desestruturação do biofilme e dispersão de células que darão origem a novos biofilmes.
Figura 3.9 Ciclo de formação do biofilme bacteriano: (1) adesão reversível; (2) adesão irreversível; (3) início da maturação do biofilme; (4) biofilme totalmente maduro com arquitetura complexa e (5) desestruturação do biofilme e dispersão de células aptas a formar novos biofilmes. Adaptado de Sauer, 2003.
As bactérias podem ser classificadas pelas formas, e as mais comumente encontradas são esféricas (cocos), bacilos cilíndricos e espirais. Estas formas estão correlacionadas com os tipos de proteínas do citoesqueleto expressos em cada uma das espécies e as variantes que definem genótipos chamadas estirpes ou cepas. Outra classificação atribuída às bactérias esta relacionada à estrutura das mesmas, as quais podem ser gram-positivas e gram-negativas. Bactérias gram- posisitvas, como Staphylococcus aureus, apresentam uma parede celular externa composta por várias camadas de peptidoglicanos. Já as bactérias gram-negativas, como Pseudomonas
aeruginosa, apresentam uma estrutura mais complexa formada por única camada fina de
peptodoglicanos entre uma camada externa rica polissacáridos e outra interna rica em lipídios. Além disso, a parede celular destas bactérias também apresenta uma membrana, que constitui a superfície exterior da parede celular (Lichter, Van Vliet e Rubner, 2009).
A Figura 3.10 apresenta a representação esquemática das formas mais comuns e composição da parede celular das bactérias.
Figura 3.10 Representação esquemática das formas mais comuns e composição da parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas. Adaptado de Lichter, Van Vliet e Rubner, 2009.
Lichter, Van Vliet e Rubner (2009) e Seon et al. (2015) destacam que existem três estratégias para limitar a adesão bacteriana a superfícies sólidas, sendo estas:
(1) resistência à adesão: consiste na obtenção de superfícies resistentes à adesão e formação de biofilmes estáveis (Richert et al., 2004; Fu et al., 2005);
(2) morte por contato (contact killing): consiste em induzir a morte de micro-organismos (exemplo: lise celular) que aderem à superfície de materiais (Malcher et al., 2008; Cui et al., 2010);
(3) liberação de componentes antibacterianos: consiste na incorporação de componente para a funcionalização antibacteriana da superfície de materiais, incluindo proteínas (Tedjo et al., 2007), íons metálicos (Wei et al., 2009), peptídeos antibacterianos (Cado et al., 2013), entre outros.
As três estratégias citadas podem ser exploradas pela versatilidade da técnica de deposição LbL, a qual permite construir revestimentos para funcionalização antibacteriana de diversas superfícies, como alimentos, medicamentos, tecidos, entre outros. A seguir serão apresentados alguns trabalhos que relacionam a técnica de deposição LbL e atividade antibacteriana de nanofilmes. Peptidoglicanos Bacílos Esferas Membrana celular Membrana externa Espaço periplasmático Espirais
Fu et al. (2005) construíram nanofilmes de CHI e heparina (HEP) sobre politereftalato de etileno (PET) em diferentes pHs (2,9; 3,8 e 6,0) com o objetivo de obter superfícies resistentes à adesão das células bacterianas da Escherichia coli durante 4 horas. Os resultados mostram que as células bacterianas aderiram muito mais no controle (PET sem recobrimento) do que nos PET revestidos com os polieletrólitos. Além disso, o número de bactérias diminui u com a diminuição do pH e os nanofilmes construídos em pH 2,9 apresentaram os melhores resultados. Os autores atribuíram este resultado a diferença de hidrofilicidade da superfície dos nanofilmes devido à mudança do grau de ionização das cadeias de CHI, as quais assumiram uma conformação mais enovelada em pH 6,0 (menos carregadas) e foram depositadas como camadas espessas, dificultando a interpenetração com as camadas de HEP. Por outro lado, em pH mais ácido (mais carregadas) as cadeias de CHI foram depositadas como camadas finas e lineares, resultando na interpenetração dos polieletrólitos e consequentemente em superfícies mais hidrofílicas.
Malcher et al. (2008) desenvolveram nanofilmes de PLL/HA incorporados com lipossomas, compostos que desempenham o papel de reservatórios para liberação controlada, carregados com íons de prata e avaliaram seu efeito de inibição bacteriana frente à bactéria
Escherichia coli. Os autores verificaram que após 20 horas de contato dos nanofilmes com os
micro-organismos, um efeito inibitório discreto foi observado com 11 ng/cm2 de AgNO3 (ng corresponde à quantidade de AgNO3 encapsulada por cm2). Entretanto, em concentrações superiores as unidades formadoras de colônia (UFC) da Escherichia coli diminuíram drasticamente e a partir de 42 ng/cm2 de AgNO3 ocorreu a morte das mesmas
.
Além disso, os autores verificaram o efeito de inibição bacteriana de nanofilmes contendo apenas íons de prata e constataram que estes não apresentaram efeito de inibição bacteriana significativo, pois a quantidade de prata incorporada foi insuficiente para induzir a morte das bactérias.Lichter e Rubner (2009) desenvolveram uma estratégia de morte por contato para evitar a proliferação bacteriana de Staphylococcus epidermidis e Escherichia coli através da exposição de cargas catiônicas na superfície de nanofilmes de SPS/PAH. Os autores construíram nanofilmes com pH 9,3 e 15,5 bicamadas e depois imergiram estes em água ajustada a pH 2,5 durante 15 minutos. Esta imersão resultou na exposição dos grupos amino do PAH (camada do topo) não complexados com as cadeias de SPS e consequentemente na inibição do crescimento das bactérias, devido ao rompimento das membranas celulares bacterianas. Em contraste, nanofilmes que não foram imersos em soluções ácidas não apresentaram efeito significativa quando
comparados com o controle positivo (lâminas de vidro sem recobrimento). Os autores comprovaram o excesso de cargas catiônicas expostas na superfície dos nanofilmes através do uso do corante rosa de bengala, um corante aniônico que interagiu com os grupos amino protonados. Nanofilmes não tratados em pH ácido apresentaram uma absorbância máxima de 0,15, enquanto que nanofilmes tratados apresentaram absorbância máxima de 1,25, evidenciando que a simples mudança de pH modificou a estrutura das amostras, tornando-as antibacterianas.
Seon et al. (2015) destacam as principais vantagens e desvantagens das três estratégias, as quais estão apresentadas na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 Principais vantagens e desvantagens da resistência à adesão, morte por contato e liberação de componentes antibacterianos
Estratégia Vantagens Desvantagens
Resistência à adesão
Evita a adesão bacteriana a partir da primeira etapa de formação do biofilme
Não mata as bactérias
Morte por contato Efeito de inibição bacteriana constante com o tempo
Ação restrita a superfície das amostras
Liberação de componentes
antibacterianos Ação extensiva
Efeito de inibição bacteriana limitado pelo tempo de liberação, toxicidade do agente biocida e possível indução à resistência bacteriana
Uma alternativa para aumentar o efeito de inibição bacteriana de revestimentos construídos a partir da técnica de deposição LbL é a combinação das estratégias visando limitar suas desvantagens.
Li et al. (2006) construíram nanofilmes com dois mecanismos antibacterianos distintos: (1) região inferior construída com 20 bicamadas de PAH/PAA para incorporação e liberação de íons de prata e (2) região superior (externa) construída com 10 bicamadas de PAH/nanopartículas de sílica, modificada quimicamente pelo [3-(trimetoxisilil) propil] cloreto
de octadecil-dimetilamônio (OQAS), capaz de matar bactérias por contato. Os resultados mostraram que os nanofilmes construídos com os dois mecanismos foram muito eficazes contra as bactérias testadas (Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis), com percentagem superior a 99,99%.
Outros trabalhos combinaram resistência à adesão e morte por contato (Wang et al., 2013) ou ainda a liberação de dois componentes antibacterianos distintos (Min, Braatz e Hammond, 2014).
Capítulo 4
MATERIAIS E MÉTODOS 4
4.1 Materiais
Os reagentes que foram utilizados neste trabalho, bem como especificações e procedência estão listados na Tabela 4.1. Todos são de grau analítico.
Tabela 4.1 Especificações e procedência dos reagentes utilizados neste trabalho para a construção e caracterização dos nanofilmes
Reagentes Especificação Procedência
Quitosana (CHI) Baixa massa molar; MM = 50000
g/mol; 75-85% desacetilada Sigma-Aldrich (USA)
Ácido hialurônico (HA) MM ≈ 1,6x10 6
g/mol; produzido pela
bactéria Streptococcus equi Sigma-Aldrich (USA)
Poli(etileno-imina) (PEI) MM = 7,5x10 5
g/mol; 50% (m/m) em
solução aquosa Sigma-Aldrich (USA)
Poliestireno sulfonato de sódio (SPS)
MM = 70000 g/mol Sigma-Aldrich (USA)
Cloreto de sódio (NaCl) MM = 58,44 g/mol Sigma-Aldrich (USA)
Ácido clorídrico (HCl) MM = 40,00 g/mol Synth (Brasil)
Hidróxido de sódio (NaOH) MM = 36,46 g/mol Sigma-Aldrich (USA) Ácido acético glacial
(CH3COOH)
MM = 60,05 g/mol Chemco (Brasil)
Azul de alciano (C56H68Cl4CuN16S4)
MM = 1298,86 g/mol Sigma-Aldrich (USA)
Rosa de bengala (C20H2Cl4I4Na2O5)
MM = 1017,74 g/mol Sigma-Aldrich (USA)
Acetona (C3H6O) MM = 58,08 g/mol Synth (Brasil)
4.2 Métodos