UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
VICENTE FRANCO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO pH E FORÇA IÔNICA NA ESTRUTURA DOS NANOFILMES MULTICAMADAS DE ÁCIDO HIALURÔNICO E QUITOSANA OBTIDOS PELA TÉCNICA DE DEPOSIÇÃO LAYER-BY-LAYER PARA APLICAÇÕES
ANTIBACTERIANAS
CAMPINAS 2016
VICENTE FRANCO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DO pH E FORÇA IÔNICA NA ESTRUTURA DOS NANOFILMES MULTICAMADAS DE ÁCIDO HIALURÔNICO E QUITOSANA OBTIDOS PELA TÉCNICA DE DEPOSIÇÃO LAYER-BY-LAYER PARA APLICAÇÕES
ANTIBACTERIANAS
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.
Orientadora: Profa. Dra. Marisa Masumi Beppu
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO VICENTE FRANCO NASCIMENTO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARISA MASUMI BEPPU.
ASSINATURA DA ORIENTADORA
CAMPINAS 2016
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta tese:
Profa. Dra. Marisa Masumi Beppu
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dra. Lucimara Gaziola de la Torre
Instituição: Instituição Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta
Instituição: Instituição Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Profa. Dra. Mariana Alteholfen da Silva
Instituição: Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR)
Profa. Dra. Eliane Gama Lucchesi
Instituição: IPEL Itibanyl Produtos Especiais LTDA
A Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe Judite pelo apoio incondicional, incentivo, amor e paciência em todos os momentos. Obrigado por tudo.
À minha namorada, Carla França, por estar ao meu lado em todos os momentos, me apoiando e incentivando, mesmo em situações difíceis. Meu eterno agradecimento amor.
À Profa. Dra. Marisa Beppu pela confiança e oportunidade de desenvolver este trabalho.
Ao prof. Dr. Marcelo Lancellotti (IB/UNICAMP) e à Dra. Eliane Lucchesi (IPEL) pelos valiosos ensinamentos das bactérias.
Ao Prof. Dr. Richard Landers (IFGW/UNICAMP) pelas análises de XPS.
À Daisy Machado (IB/UNICAMP) pelas análises de viabilidade celular.
Ao Dr. Jacobo Hernandez-Montelongo pelas análises de Kelvin Probe e pelas produtivas discussões dos resultados desta tese.
Ao técnico Eduardo Gemis e Rosane Palissari (LAMULT/ UNICAMP) pelo suporte em diversas análises.
Aos colegas e amigos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão de bolsa de estudo.
Para minha mãe e namorada, e em especial para meu querido avô Carlos (in memoriam).
RESUMO
A obtenção de superfícies antibacterianas que possam revestir diversos substratos, como alimentos, tecidos e dispositivos biomédicos é de grande relevância para evitar a sua contaminação por bactérias patogênicas. Nos últimos anos, estes revestimentos, principalmente à base de quitosana, têm sido desenvolvidos visando evitar infecções nosocomiais. A técnica de deposição layer-by-layer (LbL) é uma técnica simples e versátil que pode ser empregada na construção de tais revestimentos, principalmente a partir de interações eletrostáticas entre polieletrólitos de cargas opostas. Neste trabalho, nanofilmes de ácido hialurônico (HA) e quitosana (CHI), dois polímeros naturais biocompatíveis e biodegradáveis, foram construídos pela técnica de deposição LbL de imersão em diferentes condições de pH e força iônica (FI) visando a obtenção de superfícies resistentes à adesão e proliferação de duas bactérias patogênicas humanas importantes, sendo estas: Pseudomonas aeruginosa, gram-negativa, e
Staphylococcus aureus, gram-positiva. Os resultados mostraram que a modificação dos
parâmetros de construção, pH e FI, foi fundamental para a obtenção de nanofilmes com características distintas, como ângulo de contato, espessura, rugosidade e disponibilidade de grupos funcionais dos polieletrólitos. O efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes de HA/CHI foi avaliado pelo método de plaqueamento de superfície e os resultados indicaram que o efeito de inibição do crescimento bacteriano está diretamente relacionado com a quantidade de grupos amino livres da CHI na superfície dos nanofilmes. A redução bacteriana foi mais efetiva contra S.
aureus com diminuição de aproximadamente 3, 4 e 1,5 ciclos decimais em 4, 8 e 24 horas,
respectivamente. Contra P. aeruginosa, os nanofilmes apresentaram uma redução bacteriana inferior a 1 ciclo decimal nos tempos avaliados. Portanto, o efeito de inibição bacteriana contra S.
aureus até 24 horas sugere que os revestimentos de HA/CHI construídos pela técnica de
deposição LbL podem proteger diversos substratos, como dispositivos biomédicos, os quais são suscetíveis a proliferação bacteriana.
ABSTRACT
Fabrication of antibacterial surfaces to protect food, textiles, and biomedical devices is of great relevance. In recent years, particularly chitosan-based coatings have been developed as an attempt to prevent nosocomial infections. The layer-by-layer deposition technique (LbL) is a simple and versatile technique that can be used to produce coatings mainly from electrostatic interactions between oppositely charged polyelectrolyte. In this work, nanofilms of hyaluronic acid (HA) and chitosan (CHI), two biocompatible and biodegradable natural polymers, were assembled by LbL using different conditions of pH and ionic strength (IS) in order to obtain resistant surfaces to avoid the adhesion and proliferation of two important human pathogenic bacteria: Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, gram-negative and gram-positive bacteria, respectively. The obtained results indicated that pH and IS were key synthesis variables for obtaining different features, such as wettability, thickness, roughness and the availability of functional groups in nanofilms. The antibacterial effect of HA/CHI nanofilms was evaluated by the spread plate method for both bacteria strains; the results showed that the microbial inhibition is directly related with the amount of free amino groups on the surface of CHI nanofilms. The antibacterial effect was more effective against S. aureus with a reduction of approximately 3, 4, and 1.5 log reduction for 4, 8 and 24 hours of culture time, respectively. In the case of P.
aeruginosa, the nanofilms presented a lower bacterial reduction: 1 log reduction in times
evaluated. In conclusion, the results of the antibacterial effect against S. aureus in 24 hours, suggest that the HA/CHI nanofilms assembled by LbL can protect several substrates, such as biomedical devices, against bacterial proliferation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 Representação esquemática da construção de nanofilmes através da técnica de deposição LbL. As etapas 1 e 3 representam a adsorção de polieletrólitos de cargas opostas em um substrato carregado positivamente e as etapas 2 e 4 representam as lavagens. Adaptado de Decher, 1997...24 Figura 3.2 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é baixa . (a) polieletrólitos parcialmente carregados, (b) polieletrólitos totalmente carregados e (c) polieletrólitos com a mesma carga da superfície. Adaptado de Hoagland, 2003. ...27 Figura 3.3 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é alta. (a) polieletrólitos parcialmente carregados e (b) polieletrólitos totalmente carregados. Adaptado de Hoagland, 2003...28 Figura 3.4 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é intermediária. (a) adsorção das cadeias poliméricas por interações eletrostáticas e (b) adsorção das cadeias poliméricas pela energia de interação segmento-superfície. Adaptado de Hoagland, 2003. ...28 Figura 3.5 Estrutura química da quitina e da quitosana. Adaptado de Rabea et al., 2003. ...31 Figura 3.6 Estrutura química do ácido hialurônico. Adaptado de Milas et al., 2001. ...33 Figura 3.7 Representação esquemática do mecanismo de crescimento linear de nanofilmes de SPS/PDAC ...36 Figura 3.8 Representação esquemática do mecanismo de crescimento exponencial de nanofilmes de HA/PLL, baseado na difusão do policátion. Adaptado de Lavalle et al., 2004. ...37 Figura 3.9 Ciclo de formação do biofilme bacteriano: (1) adesão reversível; (2) adesão irreversível; (3) início da maturação do biofilme; (4) biofilme totalmente maduro com arquitetura complexa e (5) desestruturação do biofilme e dispersão de células aptas a formar novos biofilmes. Adaptado de Sauer, 2003. ...39 Figura 3.10 Representação esquemática das formas mais comuns e composição da parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas. Adaptado de Lichter, Van Vliet e Rubner, 2009. ...40
Figura 4.1 Equipamento automatizado LbL Nanostructure Pro utilizado para a construção dos nanofilmes ...47 Figura 4.2 Representação esquemática da metodologia de deposição LbL para construção dos nanofilmes ...47 Figura 4.3 Representação esquemática do ângulo de contato de superfícies (a) hidrofílicas e (b) hidrofóbicas ...49 Figura 4.4 Gráfico obtido na análise de perfilometria que mostra o deslocamento vertical entre o substrato (linha vermelha) e a amostra (linha verde), correspondendo à espessura dos nanofilmes ...50 Figura 4.5 Representação esquemática da montagem e funcionamento do AFM em modo não contato ...51 Figura 4.6 Representação esquemática do processo de XPS que mostra a ejecção de um elétron 1s após a incidência de raios X. Adaptado de Watts e Wolstenholme, 2003...53 Figura 4.7 Estrutura química dos corantes (a) rosa de bengala e (b) azul de alciano...54 Figura 4.8 Influência da sonicação em diferentes tempos no crescimento de Staphylococcus
aureus. Mesma letra indica que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3
...57 Figura 4.9 Representação esquemática da metodologia de avaliação do efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes ...58 Figura 5.1 Potencial zeta das soluções de HA e CHI em diferentes condições de pH e FI. n = 3 .60 Figura 5.2 Percentual teórico de ionização dos grupos funcionais de HA e CHI em diferentes pHs, determinado pela equação de Henderson-Hasselbach ...62 Figura 5.3 Ângulos de contato em função do número de camadas de nanofilmes de HA/CHI em diferentes condições de pH e FI. Números ímpares correspondem às camadas de HA e números pares correspondem às camadas de CHI. n = 3 ...63 Figura 5.4 Imagens das gotas na superfície: (a) do silício tratado com plasma, (b) PEI, (c) 3pH, (d) 3pH/0,1FI, (e) 5pH (f) 5pH/0,1FI ...64 Figura 5.5 Espessura em função do número de bicamadas de nanofilmes de HA/CHI em diferentes condições de pH e FI. n = 3 ...66 Figura 5.6 Desenho esquemático da conformação das cadeias de HA/CHI em diferentes condições de (a) pH e (b) adição de sal ...69
Figura 5.7 Espessura dos nanofilmes de HA/CHI e SPS/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI. n = 3 ...69 Figura 5.8 Imagens 3D de AFM dos nanofilmes 3pH de HA/CHI construídos diferentes bicamadas: (a) 3, (b) 5, (c) 7 e (d) 10 ...70 Figura 5.9 Imagens 3D de AFM dos nanofilmes 3pH/0,1FI de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas: (a) 3, (b) 5, (c) 7 e (d) 10 ...71 Figura 5.10 Imagens 3D de AFM dos nanofilmes 5pH de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas: (a) 3, (b) 5, (c) 7 e (d) 10 ...71 Figura 5.11 Imagens 3D de AFM dos nanofilmes 5pH/0,1FI de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas: (a) 3, (b) 5, (c) 7 e (d) 10 ...72 Figura 5.12 Perfil de altura dos nanofilmes de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas e condições de pH e FI. n = 3 ...73 Figura 5.13 Rugosidade em função do número de bicamadas de nanofilmes de HA/CHI e diferentes condições de pH e FI. n = 3 ...74 Figura 5.14 Espectros normalizados de FTIR-ATR dos polímeros puros e dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI ...76 Figura 5.15 Espectros normalizados de XPS das bandas de N1s dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI: 3pH, 3pH/0,1FI, 5pH e 5pH/0,1FI. As linhas contínuas correspondem às gaussianas das deconvoluções ...78 Figura 5.16 Espectros normalizados de XPS das bandas de C1s dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI: 3pH, 3pH/0,1FI, 5pH e 5pH/0,1FI. As linhas contínuas correspondem às gaussianas das deconvoluções ...80 Figura 5.17 Curvas de absorbância do corante azul de alciano em função do número de bicamadas dos nanofilmes construídos em diferentes condições de pH e FI: 3pH, 3pH/0,1FI, 5pH e 5pH/0,1FI ...81 Figura 5.18 Curvas de absorbância do corante rosa de bengala em função do número de bicamadas dos nanofilmes construídos em diferentes condições de pH e FI: 3pH, 3pH/0,1FI, 5pH e 5pH/0,1FI ...82 Figura 5.19 Absorbância máxima de azul de alciano em função do número de bicamadas de nanofilmes em diferentes condições de pH e FI. n = 3...83
Figura 5.20 Absorbância máxima de rosa de bengala em função do número de bicamadas de nanofilmes em diferentes condições de pH e FI. n = 3...83 Figura 5.21 Imagens da topografia (a, c, e, g) e potencial de superfície (b, d, f, h) dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas: 3pH (a, b), 3pH/0,1FI (c, d), 5pH (e, f) e 5pH/0,1FI (g, h) ...85 Figura 5.22 Perfis de espessura e potencial de superfície dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI ...86 Figura 5.23 Avaliação da viabilidade celular dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI em células BALB/c 3T3 incubadas por 24, 72 e 120 horas. Mesma letra indica que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...87 Figura 5.24 Efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI após 4, 8 e 24 horas de incubação com
Pseudomonas aeruginosa. n = 3 ...89
Figura 5.25 Efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI após 4, 8 e 24 horas de incubação com
Staphylococcus aureus. n = 3 ...89
Figura 5.26 Micrografias dos nanofilmes construídos com 10 bicamadas após 24 horas de contato contra Staphylococcus aureus: (a) controle (Si), (b) 3pH, (c) 3pH/0,1FI, (d) 5pH e (e) 5pH/0,1FI ...91 Figura 5.27 Absorbância líquida de RB nas últimas bicamadas dos nanofilmes de HA/CHI construídos em diferentes condições de pH e FI. Médias com a mesma letra indicam que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...92 Figura 5.28 Efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes 3pH de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas após 4, 8 e 24 horas de incubação com Staphylococcus aureus. n = 3 ...94 Figura 5.29 Absorbância líquida de rosa de bengala dos nanofilmes 3pH de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas. Médias com a mesma letra indicam que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...95 Figura 5.30 Comparativo de estabilidade entre nanofilmes 3pH não imersos (A0) e nanofilmes 3pH imersos por 24 horas em caldo Muller Hinton (A24), ambos construídos com 10 bicamadas. n = 3 ...96
Figura 8.1 Percentagem de crescimento de Pseudomonas aeruginosa após 4, 8 e 24 horas de incubação com nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI. Mesma letra indica que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...112 Figura 8.2 Percentagem de crescimento da Staphylococcus aureus após 4, 8 e 24 horas de incubação com nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI. Mesma letra indica que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...113 Figura 8.3 Percentagem de crescimento da Staphylococcus aureus após 4, 8 e 24 horas de incubação com nanofilmes 3pH de HA/CHI construídos em diferentes bicamadas. Mesma letra indica que não há diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Tukey. n = 3 ...114
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1 Exemplos de polieletrólitos fortes e fracos com suas respectivas unidades de repetição
...25
Tabela 3.2 Influência da massa molar (MM) e grau de desacetilação (GD) nas propriedades e características estruturais da quitosana (adaptado de Dash et al., 2011). ...31
Tabela 3.3 Principais vantagens e desvantagens da resistência à adesão, morte por contato e liberação de componentes antibacterianos ...42
Tabela 4.1 Especificações e procedência dos reagentes utilizados neste trabalho para a construção e caracterização dos nanofilmes ...44
Tabela 4.2 Notação adotada para representar os nanofilmes construídos em diferentes condições de pH e FI ...46
Tabela 4.3 Parâmetros, níveis e respostas utilizados para a obtenção dos dados estatísticos ...59
Tabela 5.1 Influência do pH e FI no potencial zeta da solução de HA. ...61
Tabela 5.2 Influência do pH e FI no potencial zeta da solução de CHI ...61
Tabela 5.3 Influência do pH, FI e número de bicamadas na espessura dos nanofilmes de HA/CHI ...67
Tabela 5.4 Influência do pH, FI e número de bicamadas na rugosidade dos nanofilmes de HA/CHI ...74
Tabela 5.5 Principais bandas de absorção de HA e CHI ...77
Tabela 5.6 Percentagens relativas e energia de ligação (El) dos grupos funcionais de nitrogênio dos nanofilmes construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI ...79
Tabela 5.7 Percentagens relativas e energia de ligação (El) dos grupos funcionais de carbono dos nanofilmes construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI ...80
Tabela 5.8 Ciclos de redução decimais dos nanofilmes de HA/CHI construídos com 10 bicamadas e diferentes condições de pH e FI após 4, 8 e 24 horas de incubação com P. aeruginosa e S.aureus...90
Tabela 5.9 Ciclos de redução decimais dos nanofilmes 3pH construídos em diferentes bicamadas após 4, 8 e 24 horas de incubação com S. aureus...94
Tabela 5.10 Principais caracterizações referentes à disponibilidade de carga superficial dos nanofilmes ...97
LISTA DE ABREVIAÇÕES E NOMENCLATURAS
AA – Azul de alciano
AFM – Microscopia de forca atômica AgNO3 – Nitrato de prata
ATCC – American type culture collection BE – Energia de ligação
BALB/c 3T3 – Fibroblastos murinho CH3COOH – Ácido acético
C3H6O – Acetona
C3H6O – Álcool isopropílico CHI – Quitosana
CMC – Carboximetilcelulose
COO– – Grupo carboxílico desprotonado/livre COOH – Grupo carboxílico
DOE – Planejamento de experimentos
E. coli – Escherichia coli
FTIR – Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier FI – Força iônica GD – Grau de desacetilação HA – Ácido hialurônico HCl – Ácido clorídrico HEP – Heparina kDa – Kilodalton LbL – Layer-by-layer MM – Massa molar MO – Microscopia óptica MTT – 3-brometo de (4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólio mV – Milivolts
NaCl – Cloreto de sódio NaOH – Hidróxido de sódio
NH2 – Grupo amino
NH3+ – Grupo amino protonado/livre
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa
PAA – Poli(ácido acrílico)
PAH – Poli(cloridrato de alilamina)
PDAC – Poli(cloreto de dialildimetilamônio) PEI – Poli(etilenimina)
PET – Politereftalato de etileno pH – Potencial hidrogeniônico PLL – Poli(L‐lisina)
RB – Rosa de bengala
RMS – Rugosidade média quadrática
S. aureus – Staphylococcus aureus
SPS – Poli(estireno sulfonato de sódio) UFC – Unidades formadoras de colônia
UV-Vis – Espectroscopia no ultravioleta visível
SUMÁRIO
Capítulo 1 ...20 INTRODUÇÃO ...20 1 Capítulo 2 ...22 OBJETIVOS ...22 2 Capítulo 3 ...23 REVISÃO DA LITERATURA...23 3 3.1 Técnica de deposição layer-by-layer (LbL) ...233.2 Polieletrólitos ...25
3.2.1 Fatores que afetam a adsorção de polieletrólitos ...26
3.3 Polímeros naturais ...30
3.3.1 Quitosana ...30
3.3.2 Ácido hialurônico ...33
3.3.3 Nanofilmes de ácido hialurônico e quitosana ...34
3.4 Mecanismos de crescimento dos nanofilmes ...35
3.4.1 Crescimento linear ...35 3.4.2 Crescimento exponencial...36 3.5 Adesão bacteriana ...38 Capítulo 4 ...44 MATERIAIS E MÉTODOS ...44 4 4.1 Materiais...44 4.2 Métodos...45
4.2.1 Construção dos nanofilmes...45
4.2.1.1 Limpeza dos substratos ...45
4.2.1.2 Preparação das soluções dos polímeros naturais ...45
4.2.2 Potencial zeta das soluções ...45
4.2.3 Metodologia de deposição LbL para construção dos nanofilmes ...46
4.3 Caracterizações dos nanofilmes ...48
4.3.2 Espessura ...49
4.3.3 Topografia ...50
4.3.4 Composição química por Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR-ATR) ...51
4.3.5 Composição química por Espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X ...52
4.3.6 Análise semi quantitativa dos grupos funcionais livres por incorporação de corantes iônicos ...54
4.3.7 Potencial de superfície ...55
4.3.8 Teste de viabilidade celular ...55
4.3.9 Avaliação do efeito de inibição bacteriana ...56
4.4 Microscopia óptica ...58
4.5 Análise estatística...58
Capítulo 5 ...60
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...60
5 5.1 Potencial zeta das soluções ...60
5.2 Hidrofilicidade/hidrofobicidade ...63
5.3 Espessura...66
5.4 Topografia ...70
5.5 Composição química por FTIR-ATR ...75
5.6 Composição química por XPS ...78
5.7 Análise semi quantitativa dos grupos funcionais livres por incorporação de corantes iônicos ...81
5.8 Potencial de superfície ...85
5.9 Viabilidade celular ...87
5.10 Efeito de inibição bacteriana ...88
Capítulo 6 ...98
CONCLUSÃO ...98
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS...100
Capítulo 7 ...101
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...101
7 Apêndice ...112 8
8.1 Efeito de inibição bacteriana em porcentagem ...112 Anexo ...115 9
9.1 Equação de henderson-hasselbalch ...115
Capítulo 1
INTRODUÇÃO 1
As infecções conhecidas como nosocomiais são aquelas desenvolvidas em pacientes durante a sua estadia em hospitais ou clínicas de saúde. Estas infecções são consideradas um dos principais desafios na área biomédica, uma vez que correspondem a aproximadamente 10% de todas as internações na Europa e América do Norte e pode ultrapassar 40% na Ásia, América Latina e África (Bereket et al., 2012). As infecções nosocomiais são geralmente causadas por micro-organismos oportunistas, entre os quais destacam-se as bactérias Pseudomonas
aeruginosa, bactéria gram-negativa, e Staphylococcus aureus, bactéria gram-positiva. Estas
bactérias são responsáveis por grande parte das infecções hospitalares. Sua patogenicidade é principalmente devido à capacidade de formar biofilmes, estruturas que permitem a sobrevivência destes micro-organismos em um ambiente hostil, em dispositivos biomédicos e próteses.
A concepção de revestimentos antibacterianos para controlar a colonização bacteriana tem sido objeto de numerosos esforços de investigação. As abordagens atuais para limitar esta colonização visam degradar quimicamente bactérias aderidas a superfícies sólidas ( Lichter et al., 2008). Nanofilmes multicamadas de polieletrólitos construídos pela técnica de deposição
layer-by-layer (LbL) podem ser utilizados para recobrir e funcionalizar diversas superfícies,
tornando-se uma alternativa interessante para combater a colonização e proliferação de micro-organismos. Existem três estratégias para limitar a adesão bacteriana, e estas podem ser exploradas pela técnica de deposição LbL para a construção de nanofilmes antibacterianos, sendo estas: resistência à adesão, incorporação e liberação de biocidas, como prata e cobre, ou através de superfícies que promovam a destruição das células bacterianas por contato (contact killing) (Lichter et al., 2009).
A técnica de deposição LbL é uma técnica simples e versátil que permite a construção de revestimentos por adsorção alternada de polieletrólitos de cargas opostas. A força motriz desse sistema é essencialmente eletrostática e fundamenta-se no excesso de carga para promover a neutralização e inversão da carga de cada nova camada depositada. Parâmetros como número de
bicamadas, tipos de polieletrólitos utilizados, pH e força iônica (FI) permitem o controle do processo de construção dos nanofilmes formados.
Os nanofilmes podem ser construídos a partir de polímeros de origem sintética ou natural. O ácido hialurônico (HA) (policátion) e a quitosana (CHI) (poliânion) são polímeros naturais que podem ser utilizados para construção de nanofilmes através da técnica de deposição LbL de imersão, pois estes apresentam propriedades importantes para aplicações como biomateriais. A CHI é conhecida por apresentar ação antibacteriana contra bactérias positivas e gram-negativas devido à interação eletrostática entre seus grupos amino protonados, carregados positivamente em meio ácido e moderadamente ácido, e a membrana celular das bactérias, carregada negativamente, resultando no vazamento do conteúdo citoplasmático e consequentemente na morte dos micro-organismos (Rabea et al., 2003). Já o HA, quando combinado com polieletrólitos de cargas opostas, como a CHI, é capaz de formar revestimentos altamente hidratados e não tóxicos, além de interagir com diversas células através do receptor CD44 (Culty, Nguyen e Underhill, 1992).
Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo a construção de nanofilmes de HA/CHI com propriedades estruturais, químicas e biológicas diferentes a partir da modificação de dois parâmetros (pH e FI) que controlam o grau de ionização dos polieletrólitos, visando obter revestimentos com efeito de inibição bacteriana nas primeiras 24 horas, contra Pseudomonas
aeruginosa e Staphylococcus aureus e correlacionar as propriedades destes recobrimentos com
Capítulo 2
OBJETIVOS 2
Objetivo geral:
Obtenção e caracterização de nanofilmes multicamadas de ácido hialurônico/quitosana construídos pela técnica de deposição layer-by-layer de imersão em diferentes condições de pH e força iônica visando relacionar as suas propriedades com o efeito de inibição bacteriana.
Objetivos específicos:
Caracterização química e estrutural dos nanofilmes quanto à hidrofilicidade/hidrofobicidade, espessura, topografia e disponibilidade de grupos funcionais COO- e NH3+;
Investigação da influência do pH e força iônica (NaCl) no potencial zeta, espessura e rugosidade dos nanofilmes;
Avaliação da citotoxicidade e viabilidade celular dos nanofilmes;
Avaliação do efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes frente a bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Capítulo 3
REVISÃO DA LITERATURA 3
3.1 Técnica de deposição layer-by-layer (LbL)
O conceito da técnica de deposição layer-by-layer (LbL) foi descrito pela primeira vez por Iler em 1966 (Iler, 1966), no qual o autor propôs que a adsorção alternada de partículas coloidais de cargas opostas resultaria na formação de estruturas multicamadas nanométricas . No entanto, avanços significativos só ocorreram no início da década de 1990, quando Decher e colaboradores (Decher, Hong e Schmitt, 1992) desenvolveram filmes multicamadas ultrafinos de polieletrólitos catiônicos e aniônicos em superfícies carregadas eletricamente. Desde então, ao longo das duas últimas décadas, a técnica de deposição LbL tornou-se muito versátil e amplamente difundida, com aplicações que incluem liberação sustentada de fármacos (Costa et al., 2013), encapsulação de enzimas (Sakr e Borchard, 2013), biossensores (Pan, Zhang e Li, 2013), superfícies antimicrobianas (Wang et al., 2013), lipossomas (Kaminski et al., 2016), peptídeos (Placido et
al., 2016), entre outras.
A construção de nanofilmes pelo processo de deposição LbL ocorre através da imersão de um substrato previamente carregado em soluções diluídas de polieletrólitos de cargas opostas. Inicialmente, ocorre a interação eletrostática entre o substrato e o polieletrólito, resultando na adsorção em excesso do polímero carregado e inversão da carga inicial da superfície do substrato. Na sequência, o substrato é imerso em outra solução de polieletrólito de carga oposta à primeira, e novamente ocorre a adsorção e inversão da carga superficial. Assim, tem-se a formação de uma camada dupla ou bicamada sobre o substrato. A repetição desta sequência de adsorção leva à formação de nanofilmes. Etapas de lavagem podem ser inseridas entre as imersões do substrato nas soluções dos polieletrólitos com o objetivo de remover cadeias poliméricas fracamente adsorvidas.
A Figura 3.1(a) mostra a representação esquemática do processo de deposição LbL e Figura 3.1(b) apresenta formação de uma bicamada a partir da adsorção a nível molecular de polieletrólitos de cargas oposta em um substrato carregado positivamente. Nesta figura, os contraíons foram omitidos e a estequiometria entre o substrato e o poliânion e entre os grupos carregados dos poli-íons é arbitrária (Decher, 1997).
Figura 3.1 Representação esquemática da construção de nanofilmes através da técnica de deposição LbL. As etapas 1 e 3 representam a adsorção de polieletrólitos de cargas opostas em um substrato carregado positivamente e as etapas 2 e 4 representam as lavagens. Adaptado de Decher, 1997.
A principal força motriz do processo de deposição LbL baseia-se nas interações eletrostáticas entre polieletrólitos de cargas opostas, os quais devem apresentar uma densidade mínima de carga para promover a formação dos nanofilmes através da neutralização e inversão (supercompensação) da carga inicial do substrato e das camadas posteriormente depositadas (Decher, Hong e Schmitt, 1992; Lowack e Helm, 1998). Outros mecanismos de interação também têm sido estudados, os quais incluem forças de Van der Waals (Moya et al., 2007), ligações covalentes (Ochs et al., 2010), ligações de hidrogênio (Such, Johnston e Caruso, 2011) e interações hidrofóbicas (Xu, Zhu e Sukhishvili, 2011).
A construção de nanofilmes a partir da técnica de deposição LbL apresenta algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de recobrimentos de superfícies, tais como:
1. Disponibilidade de diversos materiais de origem sintética (poli(ácido acrílico) (PAA), poli(etilenimina) (PEI)) ou natural (quitosana, alginato, ácido hialurônico);
2. Flexibilidade de utilização de substratos com formas e tamanhos irregulares (vidro, silício, titânio e fibras de algodão);
3. Controle das propriedades estruturais de polieletrólitos fracos.
(a)
3.2 Polieletrólitos
Polieletrólitos ou poli-íons são polímeros que quando dissolvidos em solventes de alta polaridade, como por exemplo, água, apresentam grupos funcionais catiônicos e aniônicos ionizados ao logo das cadeias. As interações eletrostáticas entre estes grupos, bem como com outros polieletrólitos presentes no meio, conferem a estas macromoléculas propriedades distintas daquelas observadas quando os polímeros estão neutros (Hoagland, 2003).
Os nanofilmes podem ser construídos a partir de pares de polieletrólitos fortes, fracos ou uma combinação destes. Polieletrólitos fortes apresentam alta densidade de carga independente do pH do meio e podem assumir conformações lineares e estendidas devido às fortes repulsões entre os segmentos das suas cadeias, resultando em nanofilmes mais finos (Elzbieciak et al., 2009a). Já os polieletrólitos fracos permitem o controle da densidade de carga das cadeias poliméricas através do ajuste do pH e FI, resultando em nanofilmes mais espessos e rugosos, pois estes podem assumir conformações helicoidais, devido à diminuição da repulsão eletrostática entre segmentos das suas cadeias (Elzbieciak et al., 2009b).
A Tabela 3.1 apresenta alguns exemplos de polieletrólitos fortes e fracos com suas respectivas unidades de repetição.
Tabela 3.1 Exemplos de polieletrólitos fortes e fracos com suas respectivas unidades de repetição
Polieletrólitos fortes Categoria Unidade de repetição Poli(cloreto de
dialildimetilamônio) – PDAC
Policátion sintético
Poli(estireno sulfonato de sódio) – SPS
Poliânion sintético
Polieletrólitos fracos Categoria Unidade de repetição Poli(etileno-imina) – (PEI) Policátion
sintético
Quitosana – CHI Policátion natural
Carboximetilcelulose – CMC Poliânion natural
3.2.1 Fatores que afetam a adsorção de polieletrólitos
A construção de nanofilmes a partir da técnica de deposição LbL requer a deposição sequencial de camadas de polieletrólitos de cargas opostas sobre superfícies sólidas, entretanto, a adsorção destas macromoléculas envolve vários fatores, os quais podem controlar este processo. Os principais fatores que pode afetar a adsorção dos polieletrólitos são o pH e a concentração de eletrólitos, como sais, no meio.
Quando a concentração de eletrólitos adicionados à solução é baixa, o mecanismo de adsorção dos polieletrólitos é essencialmente eletrostático, como apresentado na Figura 3.2. Polieletrólitos parcialmente carregados a partir de soluções diluídas adsorvem sobre uma superfície de carga oposta, invertendo a carga inicial do substrato (Figura 3.2 (a)). Neste caso, a quantidade necessária de polieletrólito é alta e a camada adsorvida é espessa. Quando os polieletrólitos estão completamente ionizados (Figura 3.2 (b)), ocorre novamente a inversão de carga superficial, no entanto, a quantidade adsorvida é menor, pois a interação eletrostática entre a superfície e os segmentos da cadeia do polieletrólito é maior, resultando na adsorção de uma
camada fina. Já quando o polieletrólito e a superfície tem a mesma carga, não ocorre a adsorção das cadeias poliméricas (Figura 3.2 (c)), pois as repulsões eletrostáticas não são superadas pela energia positiva de contato segmento-superfície.
Figura 3.2 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é baixa. (a) polieletrólitos parcialmente carregados, (b) polieletrólitos totalmente carregados e (c) polieletrólitos com a mesma carga da superfície. Adaptado de Hoagland, 2003.
Quando a concentração dos eletrólitos adicionados à solução é alta, a interação entre os segmentos das cadeias dos polieletrólitos e a superfície de carga oposta não é eletroestática (Figura 3.3). Polieletrólitos parcialmente carregados são adsorvidos na superfície devido à energia positiva de interação segmento-superfície (Figura 3.3 (a)). O mesmo comportamento pode ser observado para polieletrólitos completamente carregados (Figura 3.3 (b)). Em ambos os casos, isso é devido à alta concentração de eletrólitos no meio, os quais neutralizam as cargas dos segmentos das cadeias dos polieletrólitos, anulando as interações eletrostáticas e afetando a quantidade adsorvida e a espessura da camada.
Figura 3.3 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é alta. (a) polieletrólitos parcialmente carregados e (b) polieletrólitos totalmente carregados. Adaptado de Hoagland, 2003.
Em casos em que a concentração dos eletrólitos é intermediária, dois mecanismos podem dominar a adsorção dos polieletrólitos (Figura 3.4). Quando a adsorção ocorre em superfícies de cargas opostas, o mecanismo é eletroestático (Figura 3.4 (a)). Já em superfícies com a mesma carga (Figura 3.4 (b)), o polieletrólito é adsorvido através da interação segmento-superfície, em que suas cargas fixas se mantêm posicionadas o mais longe possível da superfície.
Figura 3.4 Adsorção das cadeias de polieletrólitos quando a concentração de eletrólitos é intermediária. (a) adsorção das cadeias poliméricas por interações eletrostáticas e (b) adsorção das cadeias poliméricas pela energia de interação segmento-superfície. Adaptado de Hoagland, 2003.
Compreender o mecanismo de adsorção de polieletrólitos e o papel dos parâmetros que influenciam a estrutura e as propriedades interfaciais dos nanofilmes é fundamental para concepção de novos revestimentos que possam explorar a versatilidade da técnica de deposição LbL. Neste sentido, o processo de construção dos nanofilmes usando pares de polieletrólitos fracos ou polieletrólitos fortes e fracos possibilita o controle da arquitetura dos mesmos através da modificação da densidade de carga das cadeias poliméricas por meio do ajuste de parâmetros experimentais, como pH e FI.
Shiratori e Rubner (2000) investigaram a influência da variação do pH (2,5-9,0) na espessura de nanofilmes de poli(ácido acrílico) (PAA) e poli(cloridrato de alilamina) (PAH). Os autores constataram que o pH influenciou drasticamente a espessura das bicamadas depositadas, variando de 5 Å a 80 Å. Além disso, verificaram que o mecanismo de adsorção dos polieletrólitos estava relacionado à densidade de carga das cadeias poliméricas, as quais são sensíveis à modificação do pH, possibilitando o controle da superfície e espessura dos nanofilmes. Bieker e Schoenhoff (2010) destacam que polieletrólitos fracos com alta densidade de carga se comportam como polieletrólitos fortes e como consequência obtêm-se nanofilmes mais finos devido a forte repulsão entre os mesmos.
Guzman et al. (2011) avaliaram o efeito do pH na construção de nanofilmes de poli(ácido acrílico) (PAA) (pH 2,7, 5 e 7) e quitosana (CHI) (pH 5 e 6,5). Os autores verificaram que a variação do pH afetou significativamente a densidade de carga das cadeias poliméricas, o que resultou em uma modificação das interações entre os polieletrólitos e consequentemente no crescimento do nanofilmes. O efeito do pH sobre a adsorção das camadas de CHI foi quase insignificante sob as condições utilizadas devido à rigidez das cadeias deste polímero. Como consequência, as alterações observadas na espessura das camadas depositadas foram principalmente pelo efeito do pH sobre as cadeias poliméricas do PAA. Além disso, os autores constataram que os nanofilmes com crescimento mais lento (pH elevado) apresentam uma variação quase linear da espessura com o número de bicamadas, ou seja, uma maior densidade de carga das cadeias poliméricas do PAA resultou em uma diminuição da interpenetração entre as camadas e consequentemente na construção de nanofilmes mais regulares e finos.
Além da influência do pH, alguns estudos revelaram que a adição de sal num sistema polimérico também altera a conformação e consequentemente a estrutura de nanofilmes. Richert
quitosana (CHI) em 10-2, 10-4 e 0,15 M de NaCl. Os autores observaram que nanofilmes construídos com 0,15 M de sal apresentaram maior espessura e rugosidade, pois em concentração salina muito baixa (10-4 M) as interações entre as camadas dos polieletrólitos é mais forte devido a maior disponibilidade de grupos carregados livres. Por outro lado, em concentração salina maior (0,15 M) os íons livres do sal interagem com os grupos carregados dos polieletrólitos, resultando em uma blindagem eletrostática e consequentemente na mudança de conformação das cadeias poliméricas, passando de lineares para enoveladas.
3.3 Polímeros naturais
Estudos envolvendo polímeros naturais como quitosana e ácido hialurônico, polieletrólitos fracos, têm despertado grande interesse, pois estes polímeros apresentam propriedades interessantes para aplicações como biomateriais, como biodegradabilidade e biocompatibilidade.
3.3.1 Quitosana
A quitina é um polissacarídeo natural de grande importância, identificado pela primeira vez em 1884. Este polímero natural, considerado o segundo mais abundante na natureza, pode ser extraído principalmente do exoesqueleto de crustáceos, como caranguejos e camarões (Rinaudo, 2006). O principal derivado da quitina é a quitosana (CHI), obtida através de uma reação de desacetilação em meio alcalino e temperatura elevada. Dependendo das condições desta reação é possível obter quitosanas com diferentes massas molares (MM) e graus de desacetilação (GD).
Quitosanas com diferentes MM e GD apresentam propriedades químicas e biológias diferentes. Dash et al. (2011) compilaram vários dados da influênica da MM e GD nas propiedades e características da quitosana, a qual está apresentada na Tabela 3.2.
A quitosana, composta por unidades de D-glicosamina e N-acetil-D-glicosamina, é um polímero natural insolúvel em água, mas facilmente dissolvido em soluções de ácidos fracos diluídos, comumente acético ou fórmico, devido à protonação de seus grupos amino (NH2) do carbono na posição C-2 da glicosamina (Rinaudo, 2008), que conferem a mesma um caráter catiônico (Mourya e Inamdar, 2008). A Figura 3.5 apresenta a estrutura química da quitina e quitosana.
Tabela 3.2 Influência da massa molar (MM) e grau de desacetilação (GD) nas propriedades e características estruturais da quitosana (adaptado de Dash et al., 2011).
Propriedade Caracteristícas estrurutais
Solubilidade GD Cristalinidade GD Biodegradabilidade GD MM Viscosidade GD Biocompatibilidade GD Analgésica GD Antibacteriana GD MM Antioxidante GD MM Hemostática GD
Diretamente proporcional à propriedade Inversamente proporcional à propriedade
As propriedades mais importantes da CHI são: hidrofilicidade, biodegradabilidade, biocompatibilidade, não toxicidade e antibacteriana (Kumar, 2000; Zargar, Asghari e Andamir, 2015). Tais propriedades possibilitam diversas aplicações deste polímero como biomaterial, incluindo quelação de metais pesados (Miretzky e Fernandez Cirelli, 2009), hidrogéis (Dinu et
al., 2013), scaffolds (Zakhem et al., 2015), blendas (Antunes et al., 2015) e nanopartículas (Liu et al., 2016).
Há diversos trabalhos na literatura que abordam a ação antibacteriana da CHI contra bactérias gram-positivas e gram-negativas, no entanto, o mecanismo desta ação ainda não é completamente entendido (Rabea et al., 2003). De acordo com Li, Yang e Yang (2015) alguns mecanismos têm sido propostos, porém o mais aceito para explicar o efeito de inibição bacteriana baseia-se na interação eletrostática entre os grupos amino protonados da CHI, carregados positivamente em meio ácido e moderadamente ácido e a membrana celular das bactérias, carregada negativamente, resultando no vazamento do conteúdo citoplasmático e consequentemente na morte dos micro-organismos.
Chung e Chen (2008) investigaram o efeito de inibição bacteriana da CHI com grau de desacetilação de 75 e 95% através da avaliação da taxa de mortalidade de Escherichia coli e
Staphylococcus aureus em relação as paredes celulares danificadas e o grau de vazamento de
enzimas e nucleotídeos. Os autores constataram que a adição de CHI nas suspensões bacterianas teve um impacto maior sobre a parede celular da Escherichia coli em termos de vazamento de enzimas e nucleotídeos. Além disso, os autores verificaram que o efeito de inibição bacteriana da CHI não envolveu apenas a reação com a parede celular, mas também afetou a estrutura da camada dupla de fosfolipídio, alterando a permeabilidade da membrana celular e resultando na liberação de alguns dos componentes celulares. Este efeito foi mais evidente quando a CHI com grau de desacetilação de 95% foi usada, devido a maior disponibilidade de grupos amino protonados da quitosana.
Chang et al. (2015) avaliaram o efeito do pH (5, 6 e 7) e massa molar (3,3; 7,1; 29,2; 72,1; 156 e 300 kDa) na atividade antibacteriana da CHI contra Escherichia coli e
Staphylococcus aureus. Os resultados mostraram que a atividade antibacteriana deste
polissacarídeo aumentou com o acréscimo da massa molar da CHI em pH moderadamente ácido (5 e 6). Por outro lado, em pH neutro (7) CHI com massa molar maior que 30 kDa apresentaram redução drástica do efeito de inibição bacteriana devido a diminuição da solubilidade em água.
Além disso, verificou-se pelo potencial zeta que ocorreu a diminuição da disponibilidade de grupos amino protonados em pH neutro, o que influenciou negativamente na atividade antibacteriana das CHI.
3.3.2 Ácido hialurônico
O ácido hialurônico (HA) é um mucopolissacarídeo, macromolécula do grupo das glicosaminoglicanas, composto por unidades de ácido D-glicurônico e N-acetil-glicosamina e pode ser produzido a partir de determinadas cepas de bactérias do gênero Streptococcus (Milas et
al., 2001). Este polímero é encontrado amplamente distribuído em vários tecidos conectivos de
vertebrados, principalmente na matriz extracelular. Em solução ácida ou moderadamente ácida, o HA apresenta-se como polieletrólito negativo (Berko et al., 2013). A estrutura química do ácido hialurônico está apresentada na Figura 3.6.
Figura 3.6 Estrutura química do ácido hialurônico. Adaptado de Milas et al., 2001.
O HA apresenta como principais características: biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade, o que o torna um biomaterial com potencial para diversas áreas de aplicação, as quais incluem cosméticas, medicinais e farmacêuticas (Brown e Jones, 2005). Além disso, o HA pode ser combinado com polieletrólitos catiônicos, como quitosana, para a construção de nanofilmes.
3.3.3 Nanofilmes de ácido hialurônico e quitosana
Nanofilmes de HA e CHI podem ser construídos a partir da técnica de deposição LbL para diversas aplicações biotecnológicas, devido as suas propriedades e controle do processo de deposição destes polieletrólitos através da alteração de parâmetros como pH e FI, possibilitando a obtenção de nanofilmes com propriedades químicas e estruturais diferentes visando aplicações especificas.
Kujawa et al. (2007) construiram nanofilmes de HA/CHI e HA e CHI modificada com fosforilcolina (PC) a partir de soluções ajustadas para pH 4 e 0,15 M de NaCl. Os resultados mostraram que os nanofilmes de HA/CHI-PC mantiveram-se estáveis ao longo de um ampla faixa de pH (3,0-12,0) e apresentaram uma resistência maior em condições alcalinas, quando comparados com nanofilmes de HA/CHI. Além disso, os autores observaram que quando a densidade de carga foi reduzida, devido a variação do pH das soluções dos polieletrólitos, o s nanofilmes contendo PC apresentaram propriedades de hidrogel, pois continham elevado teor de água (aproximadamente 50% em massa), uma vez que esta molécula é conhecida por interagir com as moléculas de água através de ligações de hidrogênio.
Chua et al. (2008) avaliaram a funcionalização antibacteriana de nanofilmes de HA/CHI em substratos de titânio contra as bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Os nanofilmes foram construídos com cinco bicamadas e 0,14 M de NaCl. Os resultados mostraram que a deposição das bicamadas de HA/CHI diminuiu a adesão bacteriana em aproximadamente 4 ciclos decimais na superfície dos substratos de titânio quando comparados com substratos sem revestimento. O efeito inibitório na aderência das bactérias foi atribuído ao aumento da hidrofilicidade dos nanofilmes, pois superfícies de materiais hidrofóbicos, como titânio, são mais suscetíveis à adesão de micro-organismos (Alsteens et al., 2007).
Richert et al. (2004) também avaliaram a funcionalização antimicrobiana de nanofilmes de HA/CHI, mas com objetivo de investigar a influência da força iônica na adesão da bactéria
Escherichia coli. Os autores constataram que nanofilmes construídos em concentrações mais
elevadas de sal (0,15 M NaCl) apresentaram maior resistência à adesão bacteriana, devido ao aumento da espessura dos mesmos.
Hartmann et al. (2013) estudaram a liberação de pequenos fragmentos de RNA (siRNA), componentes terapêuticos promissores, incorporados a nanofilmes de HA/CHI depositados sobre
lâminas de vidro. Os autores verificaram que os nanofilmes apresentaram uma liberação de longa duração dos siRNA, o que torna a funcionalização destes nanofilmes uma ferramenta valiosa para aplicações biomédicas. Além disso, a viabilidade celular dos nanofilmes foi testada e os resultados indicaram que estes não foram citotóxicos, devido às características dos polieletrólitos, como por exemplo, biocompatibilidade e biodegradabilidade.
Outros estudos descrevem a versatilidade de nanofilmes de HA/CHI, como por exemplo, adesão de células (Richert et al., 2004), liberação controlada de fármacos (Manna, Bharani e Patil, 2009), crescimento de osteoblastos (Zhang et al., 2013), incorporação de peptídeos antibacterianos (Cado et al., 2013), entre outros.
3.4 Mecanismos de crescimento dos nanofilmes
A deposição sequencial de polieletrólitos de cargas opostas para a construção de nanofilmes pode não ser estratificada, pois o mecanismo de crescimento de alguns sistemas poliméricos não é regular. A combinação de pares de polieletrólitos e parâmetros experimentais, como pH e FI, influenciam significativamente as interações intermoleculares das cadeias poliméricas e consequentemente a deposição das camadas. Dois mecanismos são propostos para explicar o crescimento dos nanofilmes, sendo estes: linear e exponencial.
3.4.1 Crescimento linear
O crescimento linear é observado em nanofilmes construídos a partir de pares de polieletrólitos fortes, como por exemplo, poli(estireno sulfonato de sódio) (SPS) e poli(cloreto de dialildimetilamônio) (PDAC) ou polieletrólitos fracos com alta densidade de carga, uma vez que o excesso de densidade de carga dos segmentos das cadeias poliméricas impede que ocorra a difusão de cadeias livres destes polieletrólitos.
Neste tipo de crescimento, as cadeias depositadas na camada n interagem somente com as cadeias de carga oposta depositadas na camada n+1 e cada etapa de deposição resulta em um aumento constante de espessura/bicamada. A Figura 3.7 ilustra o crescimento linear de um nanofilme de SPS/PDAC.
Figura 3.7 Representação esquemática do mecanismo de crescimento linear de nanofilmes de SPS/PDAC
Vale ressaltar que um nanofilme com crescimento linear pode crescer exponencialmente quando as condições de construção dos mesmos são alteradas. Salomaki, Vinokurov e Kankare (2005) verificaram que o aumento da temperatura modificou o crescimento de nanofilmes de SPS/PDAC, tornando-o exponencial. Guzman et al., (2009) também constataram a mudança no mecanismo de crescimento de nanofilmes de SPS/PDAC através do aumento da concentração de sal (NaCl) nas soluções dos polieletrólitos.
3.4.2 Crescimento exponencial
O crescimento exponencial é observado em nanofilmes construídos com pelo menos um polieletrólito fraco. Este crescimento é caracterizado pela difusão “in” e “out” de um dos polieletrólitos, resultando em um comportamento não linear da espessura em função da deposição sequencial de bicamadas.
Picart et al. (2002) realizaram um estudo pioneiro que comprovou que polieletrólitos fracos podem difundir-se por toda a estrutura dos nanofilmes. Os autores constaram que cadeias de poli(L‐lisina) (PLL) se difundiram para dentro e fora do nanofilme construído com HA através de marcadores fluorescentes nas soluções dos polímeros.
Lavalle et al. (2004) propuseram um mecanismo de crescimento exponencial para nanofilmes construídos PLL e HA. Conforme representação esquemática apresentada na Figura 3.8, após a deposição de uma camada de HA e lavagem para retirar as cadeias fracamente
adsorvidas, a carga superficial torna-se negativa (Figura 3.8 (a)). Na sequência, ocorre a deposição da camada de PLL e parte das cadeias deste polieletrólito é complexada com a camada externa de HA e parte difunde-se para dentro do nanofilme (Figura 3.8 (b)). Estas últimas cadeias são denominadas cadeias livres, as quais não irão interagir com as cadeias de HA depositadas anteriormente. Depois, ocorre à etapa de lavagem e algumas cadeias de PLL que estão difundidas no interior do nanofilme agora migram para fora do mesmo, porém algumas cadeias não conseguem ultrapassar a barreira eletrostática formada pelo excesso de carga positiva na superfície devido à adsorção das cadeias de PLL (Figura 3.8 (c)). Por fim, ocorre a deposição da camada de HA, a qual interage com as cadeias de PLL da superfície e as que estão livres no interior do nanofilme (Figura 3.8 (d)), resultando na formação de uma bicamada através da complexação dos polieletrólitos. Nesta etapa ocorre a neutralização da barreira eletroestática formada anteriormente e inversão de carga superficial (Figura 3.8 (e)).
A espessura da nova bicamada do nanofilme de HA/PLL é proporcional a quantidade de cadeias de HA necessárias para neutralizar as cadeias de PLL da superficie e as que difundiram-se para fora do nanofilme, como ilustrado na (Figura 3.8 (d)).
Figura 3.8 Representação esquemática do mecanismo de crescimento exponencial de nanofilmes de HA/PLL, baseado na difusão do policátion. Adaptado de Lavalle et al., 2004.
Observa-se na literatura abordagens que relatam que o crescimento exponencial dos nanofilmes é finito e que este pode crescer de forma linear com a quantidade de bicamadas depositadas, no entanto, está transição de crescimento ainda não é totalmente compreendida. Tomando como exemplo o mecanismo apresentado na Figura 3.8, estima-se que quanto mais camadas são depositadas, menor será a difusão das cadeias livres de PLL pelo nanofilme , pois ocorre uma reestruturação das primeiras camadas depositadas, as quais impedem a difusão das cadeias de PLL. Esta região reestruturada aumenta com a deposição das bicamadas, tornando a espessura do nanofilme constante (Porcel et al., 2006). Outra abordagem para a mudança de crescimento exponencial para linear dos nanofilmes está relacionada com a variação de pH (Bieker e Schoenhoff, 2010; Vidyasagar et al., 2012) e adição de sal (Tang e Besseling, 2016), pois estes parâmetros influenciam as interações dos polieletrólitos devido a mudança da densidade de carga das cadeias poliméricas.
3.5 Adesão bacteriana
Na natureza, observa-se que grande parte das bactérias adere a superfícies sólidas e forma uma camada viscosa e escorregadia, conhecida como biofilme. Esta estrutura constitui um modo de crescimento que permite a sobrevivência destes micro-organismos em um ambiente hostil (Costerton, Stewart e Greenberg, 1999).
Os biofilmes são formados por microcolônias em forma de cogumelo encapsuladas em uma matriz exo-polimérica, composta principalmente por exo-polissacarídeos. As células que constituem os biofilmes apresentam alta resistência a biocidas convencionais e tratamentos antibacterianos, quando comparadas com células planctônicas (livres em solução), tornando-as muito difíceis de serem erradicadas em hospedeiros vivos (Donlan, 2002; Sauer, 2003).
O modelo mais aceito para a formação de biofilmes envolve a transição de cinco fases distintas de organização celular, apresentadas na Figura 3.9 (Sauer, 2003). Na fase (1), as células bacterianas aderem reversivelmente à superfície e podem ser removidas com facilidade. Em seguida, na fase (2), as células aderem de forma irreversível através de interações espec íficas. Na fase seguinte (3), inicia-se a primeira fase de maturação do biofilme, através do desenvolvimento de sua arquitetura. Na sequência (4), a maturação do biofilme está completa e este apresenta uma
arquitetura complexa e alta densidade celular. Finalmente, na fase de dispersão (5), ocorre a desestruturação do biofilme e dispersão de células que darão origem a novos biofilmes.
Figura 3.9 Ciclo de formação do biofilme bacteriano: (1) adesão reversível; (2) adesão irreversível; (3) início da maturação do biofilme; (4) biofilme totalmente maduro com arquitetura complexa e (5) desestruturação do biofilme e dispersão de células aptas a formar novos biofilmes. Adaptado de Sauer, 2003.
As bactérias podem ser classificadas pelas formas, e as mais comumente encontradas são esféricas (cocos), bacilos cilíndricos e espirais. Estas formas estão correlacionadas com os tipos de proteínas do citoesqueleto expressos em cada uma das espécies e as variantes que definem genótipos chamadas estirpes ou cepas. Outra classificação atribuída às bactérias esta relacionada à estrutura das mesmas, as quais podem ser positivas e negativas. Bactérias gram-posisitvas, como Staphylococcus aureus, apresentam uma parede celular externa composta por várias camadas de peptidoglicanos. Já as bactérias gram-negativas, como Pseudomonas
aeruginosa, apresentam uma estrutura mais complexa formada por única camada fina de
peptodoglicanos entre uma camada externa rica polissacáridos e outra interna rica em lipídios. Além disso, a parede celular destas bactérias também apresenta uma membrana, que constitui a superfície exterior da parede celular (Lichter, Van Vliet e Rubner, 2009).
A Figura 3.10 apresenta a representação esquemática das formas mais comuns e composição da parede celular das bactérias.
Figura 3.10 Representação esquemática das formas mais comuns e composição da parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas. Adaptado de Lichter, Van Vliet e Rubner, 2009.
Lichter, Van Vliet e Rubner (2009) e Seon et al. (2015) destacam que existem três estratégias para limitar a adesão bacteriana a superfícies sólidas, sendo estas:
(1) resistência à adesão: consiste na obtenção de superfícies resistentes à adesão e formação de biofilmes estáveis (Richert et al., 2004; Fu et al., 2005);
(2) morte por contato (contact killing): consiste em induzir a morte de micro-organismos (exemplo: lise celular) que aderem à superfície de materiais (Malcher et al., 2008; Cui et al., 2010);
(3) liberação de componentes antibacterianos: consiste na incorporação de componente para a funcionalização antibacteriana da superfície de materiais, incluindo proteínas (Tedjo et al., 2007), íons metálicos (Wei et al., 2009), peptídeos antibacterianos (Cado et al., 2013), entre outros.
As três estratégias citadas podem ser exploradas pela versatilidade da técnica de deposição LbL, a qual permite construir revestimentos para funcionalização antibacteriana de diversas superfícies, como alimentos, medicamentos, tecidos, entre outros. A seguir serão apresentados alguns trabalhos que relacionam a técnica de deposição LbL e atividade antibacteriana de nanofilmes. Peptidoglicanos Bacílos Esferas Membrana celular Membrana externa Espaço periplasmático Espirais
Fu et al. (2005) construíram nanofilmes de CHI e heparina (HEP) sobre politereftalato de etileno (PET) em diferentes pHs (2,9; 3,8 e 6,0) com o objetivo de obter superfícies resistentes à adesão das células bacterianas da Escherichia coli durante 4 horas. Os resultados mostram que as células bacterianas aderiram muito mais no controle (PET sem recobrimento) do que nos PET revestidos com os polieletrólitos. Além disso, o número de bactérias diminui u com a diminuição do pH e os nanofilmes construídos em pH 2,9 apresentaram os melhores resultados. Os autores atribuíram este resultado a diferença de hidrofilicidade da superfície dos nanofilmes devido à mudança do grau de ionização das cadeias de CHI, as quais assumiram uma conformação mais enovelada em pH 6,0 (menos carregadas) e foram depositadas como camadas espessas, dificultando a interpenetração com as camadas de HEP. Por outro lado, em pH mais ácido (mais carregadas) as cadeias de CHI foram depositadas como camadas finas e lineares, resultando na interpenetração dos polieletrólitos e consequentemente em superfícies mais hidrofílicas.
Malcher et al. (2008) desenvolveram nanofilmes de PLL/HA incorporados com lipossomas, compostos que desempenham o papel de reservatórios para liberação controlada, carregados com íons de prata e avaliaram seu efeito de inibição bacteriana frente à bactéria
Escherichia coli. Os autores verificaram que após 20 horas de contato dos nanofilmes com os
micro-organismos, um efeito inibitório discreto foi observado com 11 ng/cm2 de AgNO3 (ng corresponde à quantidade de AgNO3 encapsulada por cm2). Entretanto, em concentrações superiores as unidades formadoras de colônia (UFC) da Escherichia coli diminuíram drasticamente e a partir de 42 ng/cm2 de AgNO3 ocorreu a morte das mesmas
.
Além disso, os autores verificaram o efeito de inibição bacteriana de nanofilmes contendo apenas íons de prata e constataram que estes não apresentaram efeito de inibição bacteriana significativo, pois a quantidade de prata incorporada foi insuficiente para induzir a morte das bactérias.Lichter e Rubner (2009) desenvolveram uma estratégia de morte por contato para evitar a proliferação bacteriana de Staphylococcus epidermidis e Escherichia coli através da exposição de cargas catiônicas na superfície de nanofilmes de SPS/PAH. Os autores construíram nanofilmes com pH 9,3 e 15,5 bicamadas e depois imergiram estes em água ajustada a pH 2,5 durante 15 minutos. Esta imersão resultou na exposição dos grupos amino do PAH (camada do topo) não complexados com as cadeias de SPS e consequentemente na inibição do crescimento das bactérias, devido ao rompimento das membranas celulares bacterianas. Em contraste, nanofilmes que não foram imersos em soluções ácidas não apresentaram efeito significativa quando
comparados com o controle positivo (lâminas de vidro sem recobrimento). Os autores comprovaram o excesso de cargas catiônicas expostas na superfície dos nanofilmes através do uso do corante rosa de bengala, um corante aniônico que interagiu com os grupos amino protonados. Nanofilmes não tratados em pH ácido apresentaram uma absorbância máxima de 0,15, enquanto que nanofilmes tratados apresentaram absorbância máxima de 1,25, evidenciando que a simples mudança de pH modificou a estrutura das amostras, tornando-as antibacterianas.
Seon et al. (2015) destacam as principais vantagens e desvantagens das três estratégias, as quais estão apresentadas na Tabela 3.3.
Tabela 3.3 Principais vantagens e desvantagens da resistência à adesão, morte por contato e liberação de componentes antibacterianos
Estratégia Vantagens Desvantagens
Resistência à adesão
Evita a adesão bacteriana a partir da primeira etapa de formação do biofilme
Não mata as bactérias
Morte por contato Efeito de inibição bacteriana constante com o tempo
Ação restrita a superfície das amostras
Liberação de componentes
antibacterianos Ação extensiva
Efeito de inibição bacteriana limitado pelo tempo de liberação, toxicidade do agente biocida e possível indução à resistência bacteriana
Uma alternativa para aumentar o efeito de inibição bacteriana de revestimentos construídos a partir da técnica de deposição LbL é a combinação das estratégias visando limitar suas desvantagens.
Li et al. (2006) construíram nanofilmes com dois mecanismos antibacterianos distintos: (1) região inferior construída com 20 bicamadas de PAH/PAA para incorporação e liberação de íons de prata e (2) região superior (externa) construída com 10 bicamadas de PAH/nanopartículas de sílica, modificada quimicamente pelo [3-(trimetoxisilil) propil] cloreto
de octadecil-dimetilamônio (OQAS), capaz de matar bactérias por contato. Os resultados mostraram que os nanofilmes construídos com os dois mecanismos foram muito eficazes contra as bactérias testadas (Escherichia coli e Staphylococcus epidermidis), com percentagem superior a 99,99%.
Outros trabalhos combinaram resistência à adesão e morte por contato (Wang et al., 2013) ou ainda a liberação de dois componentes antibacterianos distintos (Min, Braatz e Hammond, 2014).
