CRITÉRIOS PARA DIAGNÓSTICO DE DISPLASIA EPITELIAL Alterações arquiteturais Alterações celulares

Estratificação epitelial irregular;

Hiperplasia da camada basal; Projeções epiteliais em gota; Número aumentado de figuras de mitose;

Mitoses superficiais;

Disceratose (ceratinização prematura das células);

Pérolas de ceratina.

Anisonucleose (tamanho anormal do núcleo); Pleomorfismo (forma anormal) nuclear; Anisocitose (tamanho anormal da célula);

Pleomorfismo (forma anormal) celular; Aumento da proporção núcleo-citoplasma;

Mitoses atípicas; Hipercromatismo nuclear; Aumento do número e/ou tamanho dos

Quadro 2. Critérios preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005) para a classificar o grau de displasia epitelial oral.

GRAU DE

DISPLASIA EPITELIAL CRITÉRIOS

LEVE Alterações na arquitetura epitelial limitada ao terço inferior do epitélio e poucas atipias citológicas.

MODERADA

Alterações na arquitetura epitelial estendem-se até o terço médio do epitélio e atipias citológicas em quantidade moderada.

SEVERA

Alterações na arquitetura epitelial observadas em mais de dois terços do epitélio associadas com quantidade considerada de atipias celular e nuclear.

Embora a classificação da displasia epitelial pelo sistema da OMS seja satisfatoriamente utilizada em várias pesquisas, tem sido observada uma variabilidade considerável na interpretação inter e intraexaminadores (WARNAKULASURIYA et al., 2008). Essa variabilidade é especialmente relatada na gradação das displasias epiteliais moderadas, cuja conduta clínica normalmente envolve apenas o acompanhamento da lesão. Kujan et al. (2006) relataram que grande parte das displasias epiteliais moderadas tem um potencial significativo de transformação maligna.

Em busca de atenuar essas discordâncias, tem-se sugerido a redução das categorias na gradação das displasias epiteliais para um sistema com apenas duas categorias: baixo risco e alto risco de transformação maligna. Em uma oficina coordenada pela OMS no Reino Unido para tratar questões relacionadas com as desordens potencialmente malignas, foi proposta a união dos casos diagnosticados segundo critérios morfológicos preconizados pela OMS (BARNES et al., 2005) gradados como sem displasia/com displasia questionável/displasia leve, em um grupo denominado de baixo risco; e em outro grupo, seriam agrupados os casos com displasia epitelial moderada/severa, sendo denominado de alto risco de transformação maligna (WARNAKULASURIYA et al., 2008). Assim, o sistema binário de gradação das displasias epiteliais orais foi inicialmente publicado e testado por Kujan et al. (2006), seguido por outros estudos (LIU et al., 2010; CARVALHO et al., 2012; CALDEIRA et al., 2012; NANKVELL et al., 2013).

Nankvell et al. (2013) compararam a reprodutibilidade e valor prognóstico entre o sistema binário proposto por Kujan et al. (2006) e o sistema da OMS (BARNES et al., 2005) em 141 casos de displasias epiteliais orais. Esses autores verificaram uma similaridade no valor prognóstico dos dois sistemas, porém encontraram uma reprodutibilidade maior no sistema binário.

Liu et al. (2010) analisaram 138 pacientes com desordens potencialmente malignas orais com displasia epitelial, acompanhando estes casos por cerca de 5 anos. Nesse período, 26,8% dos casos se transformaram em câncer oral, sendo os casos diagnosticados com displasias epiteliais de alto risco associados com risco 2,78 vezes maior de transformação, quando comparados aos casos de baixo risco, refletindo uma boa aplicabilidade deste sistema quanto à predição de transformação maligna.

Várias alterações relacionadas com a QA podem ser irreversíveis, mas mesmo assim os pacientes devem ser orientados a utilizar protetor solar labial e mudar os hábitos de exposição solar para prevenir maiores danos. É importante acompanhar periodicamente o paciente com QA e realizar biópsias incisionais naquelas lesões com aspecto clínico mais severo, visando prevenir sua transformação maligna. Em casos com quadro microscópico grave, com transformação maligna clara, métodos terapêuticos como a excisão cirúrgica (vermelhectomia), criocirurgia e cirurgia a laser podem ser adotados (SHAH; DOHERTY; ROSEN, 2010).

Em síntese, Jadotte e Schwartz (2012b) destacaram que a escolha da terapia deve levar em consideração o diagnóstico histológico, a experiência do dentista, o aspecto estético de acordo o desejo do paciente e os possíveis efeitos colaterais, enquanto Shah, Doherty e Rosen (2010) relatam que independente da terapia escolhida, o ideal é que o tratamento da QA seja eficaz para garantir que não haja o desenvolvimento de CCE de lábio.

Em geral, pode demorar mais de duas décadas de exposição solar crônica para que a QA sofra transformação maligna, entretanto em alguns pacientes a progressão pode ser mais rápida (JADOTTE; SCHWARTZ, 2012a). Devido a essa evolução lenta e também pelo fato dos primeiros sinais clínicos serem sutis, muitos pacientes associam a QA em seu estágio inicial com o processo de envelhecimento e negligenciam a lesão até que ela se transforme em CCE de lábio (KAUGARS et al., 2009; CAVALCANTE; ANBINDER; CARVALHO, 2008). A taxa de transformação maligna da QA varia de 10% a 30% (PIÑERA-MARQUES et al., 2010), portanto devem ser adotadas medidas preventivas, principalmente devido ao CCE de lábio ser o mais comum (SCULLY; BAGAN, 2009). A carcinogênese é iniciada quando as células normais sofrem transformação neoplásica, resultado cumulativo da desregulação de mecanismos de crescimento-regulação celular. Um determinado número de proteínas pode estar envolvido nesse processo, incluindo as galectinas (LIU; RABINOVICH, 2005).

2.2 GALECTINAS

As galectinas constituem uma família de lectinas, formalmente denominadas de lectinas tipo-S, que estão expressas em diversos tecidos humanos, bem como em vários outros organismos como outros mamíferos, esponjas, fungos, nematoides, insetos e vírus (DI LELLA et al., 2011; LARSEN et al., 2011). Dentre suas principais características, estão inclusas a sua afinidade por -galactosídeos e a presença de pelo menos um domínio de reconhecimento de carboidrato (DRC) composto por uma sequência de aproximadamente 130 aminoácidos longos (HASAN et al., 2007; BARROW; RHODES; YU, 2011; BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011). Até hoje, 15 galectinas foram identificadas em mamíferos, as quais são numeradas de acordo com a ordem cronológica de suas descobertas (DI LELLA et al., 2011; BARROW; RHODES; YU, 2011; BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011).

De acordo com suas diferenças arquiteturais, as galectinas são classificadas em três subtipos: prototípicas, quimera e tandem-repetido (VASTA, 2012). As galectinas prototípicas (-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 e -15) contém apenas 1 DRC em sua sequência polipeptídica (BRAEUER; KAMYIA; BAR-ELI, 2011). O único componente do grupo quimera é a galectina-3 que exibe estrutura única, sendo constituída por um domínio N-terminal não- lectina (com cerca de 120 aminoácidos constituídos por repetições em série de sequências curtas ricas em prolina e glicina) ligado ao DRC (LARSEN et al., 2011). As galectinas do tipo tandem-repetido (-4, -6, -8, -9 e -12) contém 2 DRCs em uma única cadeia polipeptídica, estes frequentemente diferem um do outro e são conectados por um link (YANG; RABINOVICH; LIU, 2008; BARROW et al., 2011; BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011).

As galectinas exibem diferentes preferências ao se ligarem aos carboidratos, podendo ser bivalentes ou multivalentes (BARROW; RHODES; YU, 2011). Certas galectinas com um DRC são capazes de homodimerização, enquanto a galectina-3 pode formar pentâmeros ao se ligar com carboidratos multivalentes em um processo que envolve a auto-associação da região N-terminal não-lectina (LARSEN et al., 2011). Aquelas com dois DRCs, são pelo menos proteínas bivalentes. Assim, as galectinas são capazes de formar matrizes ordenadas feitas de lectina e glicoconjugados multivalentes, denominados complexos lattices (BOSCHER; DENNIS; NABI, 2011). A Figura 1 ilustra a estrutura das galectinas e a formação de lattices.

Figura 1. Representação das galectinas com seus DRCs e suas interações com glicoproteínas e glicolipídios. (a) Galectinas Prototípicas -1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 e -15 com um DRC são capazes de homodimerização para formarem lattices de superfície celular. (b) A galectina-3 do subtipo quimera contém um DRC e um domínio N-terminal não-lectina responsável pela oligomerização (até pentâmeros) formando lattices geometricamente diferentes daqueles formados pelos outros subtipos de galectinas (c) Semelhante às galectinas prototípicas, as galectinas do tipo tandem-repetido (-4, -6, -8, - 9 e -12) possuem dois DRCs podem formar um complexo lattice.

Fonte: Adaptado de Boscher, Dennis e Nabi (2011).

As galectinas podem estar expressas intracelularmente ou serem secretadas, por vias pouco esclarecidas, para o meio extracelular (Figura 2). Intracelularmente, essas proteínas podem estar presentes no núcleo ou no citoplasma, interagindo com outras proteínas na modulação da sinalização de vários processos celulares importantes como ligação com um precursor de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) e regulação do crescimento celular. Quando em meio extracelular, essas galectinas podem se ligar a moléculas de superfície celular ou presentes na matriz extracelular, onde participam de processos de diferenciação, proliferação, apoptose e progressão do ciclo celular ou ainda participar da interação intercelular ou entre célula e matriz extracelular (LIU; RABINOVICH, 2005; COMPAGNO et al., 2013).

Figura 2. Localização das galectinas nos compartimentos celulares ou no espaço extracelular. As galectinas são sintetizadas no citosol e podem ser translocadas para o interior do núcleo ou secretadas para o espaço extracelular, onde se ligam a glicanos presentes na matriz extracelular ou na superfície das células.

Fonte: Adaptado de Vasta (2012).

Além de exercerem funções em processos fisiológicos, a expressão alterada das galectinas em células tumorais ou associadas ao estroma tumoral tem fornecido evidências que essas proteínas realizam papéis importantes na tumorigênese e progressão tumoral, incluindo assim influência na angiogênese (HSIEH et al., 2008; THIJSSEN et al., 2010), apoptose (BROWN et al., 2012), diferenciação (LIANG et al., 2008; ZHONG et al., 2010; ALVES et al., 2011), metástase (CHIANG et al., 2008; WU et al., 2009; FÍK et al., 2013) e imunidade tumoral (RUBINSTEIN et al., 2004; ITO; RALPH, 2012).

2.2.1 Galectina-1

A primeira proteína descoberta na família das galectinas foi a galectina-1, que constitui uma proteína homodimérica não covalente de 14kDa, com sítio ligante a - galactosida e reconhece, preferencialmente, complexos tipo glicanos (ITO et al., 2012). Quando sua localização é intracelular, encontra-se predominantemente em sua forma de monômero através da qual interage com outras proteínas localizadas no núcleo e no

citoplasma; em contraste, a galectina-1 extracelular geralmente forma dímeros que interagem com glicoproteínas de superfície celular (CEDENO-LAURENT; DIMITROFF, 2012).

A galectina-1 é considerada funcionalmente polivalente já que participa de diversas atividades biológicas e de desenvolvimento tecidual. Existem numerosas evidências de que a galectina-1 esteja envolvida em vários processos relacionados ao câncer como imunossupressão, angiogênese, metástase e hipóxia (ITO et al., 2012). Nesse contexto, a expressão alterada da galectina-1 tem sido demonstrada em tecidos malignos e com potencial de transformação maligna de diversas localizações anatômicas (KOHRENHAGEN et al., 2006; SAUSSEZ et al., 2008; KOHRENHAGEN et al., 2010; ITO; RALPH, 2012) incluindo em cavidade oral (LE et al., 2005; CHIANG et al., 2008; SAUSSEZ et al., 2008; HSIEH et al, 2008; DING et al., 2009; WU et al., 2009; ZHONG et al., 2010; ALVES et al., 2011; CARVALHO et al., 2012).

A função imunossupressora da galectina-1 foi amplamente pesquisada. Evidências mostram que a galectina-1 pode induzir a apoptose de células T por várias vias de sinalização dependentes da sua interação com os ligantes específicos presentes na superfície celular. De fato, a galectina-1 liga-se a várias moléculas que podem atuar como receptores na superfície das células T, incluindo CD7, CD43, CD45 e CD95 (BARROW; RHODES; YU, 2011). Além disso, a galectina-1 pode causar supressão de células T através da sua influência na produção de citocinas, dentre elas o interferon-gama (IFN- ; citocina de assinatura da resposta Th1) e interleucina 17 (IL-17; citocina relacionada com a resposta do tipo Th17) (YANG; RABINOVICH; LIU, 2008).

Recentemente, Mobergslien e Sioud (2011) verificaram, em seus experimentos in

vitro, que células dendríticas maduras e imaturas que não expressavam os genes da galectina-

1 aumentavam as respostas de células T+ alogênicas, com consequente aumento na produção de IFN- por estas últimas. A alta expressão da galectina-1 também tem sido associada com a promoção de um microambiente favorável à resposta inflamatória mediada por células Th2, com níveis elevados de interleucinas -4, -13 e -10 e ainda com o aumento do número de células T regulatórias (Tregs), fatores estes que prejudicam respostas imunes anti-tumorais eficazes (CEDENO-LAURENT; DIMITROFF, 2012).

A contribuição da galectina-1 para o privilégio imunológico dos tumores tem sido alvo de vários estudos. Através de estratégias in vitro e in vivo, Rubinstein et al. (2004) demonstraram que a inibição da atividade imunossupressora da galectina-1 em tecidos cancerosos resultou em aumento da imunidade tumoral mediada por células T, incluindo também o aumento da sobrevida de células Th1 e subsequente produção de IFN- .

Enfatizando essa função imunossupressora da galectina-1, Le et al. (2005) mostraram que a expressão da galectina-1 foi inversamente correlacionada com a quantidade de células T em CCEs de cabeça e pescoço. Recentemente, Ito e Ralph (2012) demonstraram em experimentos

in vitro que a inibição da galectina-1 está associada com a supressão de metástase em modelos

murinos de metástases pulmonares de câncer de mama e cólon. Essa supressão ocorreu devido à proteção de células T efetoras e à inibição da adesão de células malignas.

A maioria dos estudos relata que níveis aumentados da galectina-1 em células tumorais ou no estroma associado ao tumor podem ser considerados como uma indicação da progressão de tumores malignos, como também de transformação maligna. Chiang et al. (2008) avaliaram a expressão da galectina-1 em espécimes bem diferenciados de CCE orais, comparando-as com espécimes de pacientes saudáveis e observaram que a superexpressão da galectina-1 no front invasivo dos tumores foi associada com um pior prognóstico. Esses autores enfatizaram que nos casos com metástase, a expressão ocorreu apenas no front invasivo, sugerindo a participação dessa proteína na metástase de CCE oral.

No que se refere ao processo de metástase, a galectina-1 tem sido associada com algumas etapas, como na adesão das células malignas à matriz extracelular, na formação de complexos formados por células malignas associadas a plaquetas (ITO et al., 2012) ou ainda na modulação de metaloproteinases de matriz (MMPs), proteínas relacionadas com a degradação da matriz extracelular, processo ativo na invasão tumoral.

Experimentos in vitro demonstraram a associação do aumento na expressão da galectina-1 com a promoção da invasão tumoral em CCEs orais, através da regulação positiva da produção e atividade das MMP-2 e MMP-9, como também através da reorganização do citoesqueleto (WU et al., 2009).

Em seus experimentos in vitro com modelo de carcinogênese de CCE oral, Zhong et al. (2010) realizaram uma análise proteômica que revelou uma superexpressão da galectina-1 na linhagem celular analisada, sendo este dado confirmado tanto pela análise Western Blot nessa e em outra linhagem de células malignas, como também em amostras de pacientes com CCEs orais primários. Além disso, esses autores encontraram que a galectina-1 foi negativamente correlacionada com a diferenciação patológica do tumor, de forma que uma maior expressão dessa proteína poderia indicar um grau mais pobre de diferenciação patológica.

No que se refere à tumorigênese, Kohrenhagen et al. (2006) avaliaram a expressão da galectina-1 em neoplasias benignas e malignas cervicais e observaram que o aumento da expressão desta proteína, principalmente em células estromais próximas às células

neoplásicas, foi positivamente correlacionada com o aumento da gravidade do grau histológico, sugerindo que galectina-1 está envolvida com a iniciação e progressão de neoplasias cervicais. Este mesmo grupo de autores, pouco tempo depois, verificou resultados semelhantes ao constatar uma correlação positiva entre o aumento na expressão da galectina-1 (principalmente em células associadas ao estroma) e a progressão de neoplasias vulvares (KORENHAGEN et al. 2010).

A participação da galectina-1 na tumorigênese em região de cabeça e pescoço foi investigada por Saussez et al. (2008) que demonstraram um aumento na imunoexpressão da galectina-1 em CCE de laringe e hipolaringe, quando comparada ao epitélio normal e displasias epiteliais de baixo e alto grau destas regiões. Esses autores também verificaram que a progressão de displasias de alto grau para carcinomas foi correlacionada com uma mudança na localização dessa proteína do citoplasma para o núcleo.

Com relação à carcinogênese oral, Ding et al. (2009) mostraram que os maiores níveis desta proteína estavam presentes nos CCEs orais e ainda que esta proteína encontrava-se superexpressa na camada espinhosa de leucoplasias orais, quando comparada a mucosa oral normal. Este resultado se repetiu com quantificação de mRNA para galectina-1 realizada nesta mesma pesquisa.

Analisando a expressão da galectina-1 em displasias epiteliais orais, Carvalho et al. (2012) verificaram que esta proteína está mais expressa quando o epitélio está alterado, estando sua marcação restrita ao tecido epitelial e que a intensidade dessa marcação aumenta de acordo com o aumento do grau da displasia, sugerindo o envolvimento dessa proteína tanto no processo de transformação de fenótipo normal para displásico, quanto na progressão de displasias de baixo risco para displasias de alto risco.

Um dos papéis da galectina-1 na transformação neoplásica seria a ligação desta com a proteína oncogênica H-Ras, promovendo a sua fixação na membrana plasmática. O complexo galectina-1-H-Ras representa uma das etapas essenciais na transformação neoplásica (YANG; RABINOVICH; LIU, 2008). Além disso, em condições de hipóxia, altos níveis de galectina-1 têm sido observados (LE et al., 2005; ZHAO et al., 2010), fornecendo um microambiente que favorece a angiogênese, bem como tumorigênese (BRAEUER et al., 2012; ITO et al., 2012).

A superexpressão da galectina-1 em células endoteliais associadas ao tumor em CCEs orais foi verificada por Hsieh et al. (2008). Esse estudo mostrou que a galectina-1 interage com a neuropilina-1, co-receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) presente na superfície das células endoteliais e essa interação estimulou a fosforilação do receptor 2 do VEGF (VEGFR-2), ativando a via de sinalização da MAPK (proteína quinase mitogênica) e

resultou no aumento da proliferação e adesão das células endoteliais. Nessa perspectiva, estudos in vitro realizados por Thijssen et al. (2010) mostraram que em ratos knockout [galectina-1(-/-)] ocorre redução da angiogênese em vários modelos tumorais. Esses autores mostraram evidências de que a galectina-1 secretada por células tumorais pode atuar como um fator pró-angiogênico ao ser absorvida por células endoteliais associadas ao tumor, ativando a cascata Ras/Raf/ERK que resulta na estimulação de migração e proliferação de células endoteliais.

2.2.2 Galectina-3  

A galectina-3 é o único membro do grupo quimera de galectinas e é amplamente expressa em vários tipos celulares, incluindo células inflamatórias e epiteliais (LARSEN et al., 2011). O DRC da galectina-3 consiste em aproximadamente 140 resíduos de aminoácidos e quando comparado ao de outras galectinas, mostra uma sequência de aminoácidos (Asp- Trp-Gli-Arg), que se assemelha à do fator anti-apoptótico mitocondrial Bcl-2 (CEDENO- LAURENT; DIMITROFF, 2012).

Estudos recentes têm demonstrado a participação da galectina-3 em diferentes fenômenos biológicos relacionadas com o câncer (FERRAZZO et al., 2009; ALVES et al., 2011; BROWN et al., 2012; ZHANG et al., 2013), tais quais adesão celular, proliferação, diferenciação e angiogênese (PRIETO et al., 2006). Entretanto, sua função (principalmente como proteína pró ou anti-apoptótica) e expressão parecem depender do tipo celular e tecido tumoral envolvido (BROWN et al., 2012).

O compartimento celular no qual a galectina-3 está localizada também influencia na sua função (DE FARIA et al., 2010). Predominantemente, a galectina-3 se localiza no citoplasma, no entanto ela pode migrar para o núcleo ou ser secretada para o meio extracelular (BROWN et al., 2012). Quando localizada no citoplasma, essa galectina tem um importante papel em sua atividade anti-apoptótica, contudo tem sido relatado um efeito oposto quando sua localização é nuclear (HONJO et al., 2000).

Honjo et al. (2000) observaram que a expressão da galectina-3 no citoplasma aumentou durante a progressão do câncer de língua, enquanto que a expressão nuclear diminuiu consideravelmente, sendo este fato associado à sobrevida diminuída destes pacientes. O estudo de Alves et al. (2011) com CCEs de língua também avaliou a imunoexpressão da galectina-3, mostrando um decréscimo da expressão nuclear e aumento da

expressão citoplasmática desta proteína correlacionado com o aumento do grau de diferenciação histológica. Esses autores sugerem que a galectina-3 exerce uma função anti- tumoral quando presente no compartimento nuclear e favorece a progressão do tumor, quando expressa no citoplasma.

A pesquisa de Prieto et al. (2006) sugeriu uma forte associação da expressão citoplasmática e nuclear da galectina-3 com a radiação UV em lesões de áreas expostas ao sol. Esses autores demonstraram que melanomas sobre áreas expostas cronica e intermitentemente ao sol exibiam intensa expressão citoplasmática da galectina-3, quando comparados com melanomas acrais, que não expressaram a proteína. Além disso, a expressão nuclear da galectina-3 foi restrita aos melanomas cronicamente expostos ao sol, sugerindo que esta translocação nuclear está associada com lesões induzida por radiação UV crônica. Os resultados desse estudo mostraram que os melanócitos expostos à radiação UV acumularam galectina-3 com a progressão do tumor, particularmente no núcleo.

Saegusa et al. (2008) descreveram, através de experimentos in vitro e in vivo, que a galectina-3 desempenha uma função de proteção contra apoptose em ceratinócitos expostos à radiação UVB. Esses autores relataram que após exposição de ceratinócitos à radiação UVB ocorre um aumento transitório na expressão do gene da galectina-3. Em seus resultados, os ceratinócitos de camundongos galectina-3-_/- _{foram significantemente mais sensíveis a} estímulos apoptóticos induzidos por radiação UVB que ceratinócitos do tipo selvagem. Adicionalmente, neste estudo a deficiência de galectina-3 foi associada com o aumento da ativação das vias de sinalização JNK e ERK (reguladoras da apoptose), bem como uma diminuição da ativação de AKT (proteína anti-apoptótica).

Embora não haja estudos que abordem a relação entre radiação UV e galectina-3 em lesões orais, existem algumas pesquisas com essa galectina na tumorigênese oral, uma vez que evidências sugerem que sua expressão seja necessária para o início da transformação