Cromatografia de afinidade com cianinas

As cianinas constituem uma classe da família dos corantes polimetínicos, cuja estrutura geral está representada na figura 10. Estes corantes podem ser definidos como sais monoácidos em que dois núcleos heterocíclicos, com pelo menos um átomo de azoto, estão ligados por uma cadeia de ligações duplas conjugadas, pelo que a cadeia possui necessariamente um número ímpar de átomos de carbono. Um dos núcleos heterocíclicos funciona como doador e outro como aceitador de eletrões. Assim, cada composto é considerado como um híbrido de ressonância de duas estruturas canónicas e nenhuma fórmula única é a sua representação completa. No entanto, para simplificação, a estrutura é normalmente apresentada como possuindo um átomo de azoto terciário e o outro quaternário [53-57].

Figura 10 - Fórmula de estrutura geral das cianinas.

Esta classe de corantes absorve numa gama muito larga do espetro eletromagnético, desde 340 a 1400 nm, ou seja, desde o ultravioleta até ao infravermelho [56], passando por todas as cores da região do visível, estando a sua cor intensa relacionada com a interação de ressonância entre os átomos de azoto nos extremos da cadeia conjugada, envolvendo o movimento da carga positiva [53-55]. O comprimento de onda de absorção das cianinas é influenciado essencialmente por dois fatores: o primeiro, que é o que tem o efeito mais significativo, diz respeito à natureza do anel heterocíclico e ao número de ligações duplas conjugadas entre os dois azotos, isto é, ao comprimento da cadeia polimetínica; o outro está relacionado com a simetria, ou não, dos anéis heterocíclicos presentes, com a natureza dos grupos N-alquilo e com os substituintes presentes tanto na cadeia metínica como nos anéis. Outras variações importantes com repercussão nas propriedades das cianinas são a natureza do contra-ião, que vai condicionar a solubilidade e a facilidade de cristalização das cianinas, e a rigidificação do sistema conjugado, que, em geral, aumenta a sua estabilidade bem como o comprimento de onda de absorção [53-55].

32 De uma maneira geral, a síntese de cianinas [55,57-59] envolve várias etapas que consistem em simples adições de reagentes nucleófilos e eletrófilos, precedidas ou seguidas de reações de eliminação, via desprotonação, e remoção de grupos de saída. Os precursores chave são sais de amónio quaternários de heterociclos possuidores de grupos metilo quase

sempre na posição 2 [60] que, na presença de bases, originam bases metilénicas nucleófilas. Esta classe de corantes apresenta algumas propriedades características e que são

importantes para algumas das suas aplicações, tais como, uma absortividade molar máxima, εmáx, muito elevada, com valores de cerca de 30000 M-1cm-1 para monometinocianinas e

250000 M-1cm-1 para cadeias maiores. No entanto, para cadeias a partir das heptametinocianinas, estes valores começam a diminuir.

As cianinas são um exemplo de uma classe de corantes cujas inúmeras e diversificadas aplicações [57,59,61-63] derivam, quase exclusivamente, das suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas resultantes das transições eletrónicas do seu estado fundamental π para os seus diferentes estados excitados, e das transições entre estes [53]. Entre essas aplicações contam- -se o uso destes corantes como sensibilizadores de peliculas fotográficas, como meio de gravação em discos óticos, em tintas industriais, para capturar energia solar, em sistemas de laser, em sistemas de fotossíntese artificial, em proteómica, como materiais fotorrefrativos, como agentes antitumorais (na terapia fotodinâmica, resultando de processos como a produção de oxigénio singuleto) e como sondas fluorescentes para sistemas biológicos [57,61,62,64].

Outra aplicação das cianinas, não resultante de fenómenos derivados das transições eletrónicas mas do fato de poderem, potencialmente, estabelecer interações seletivas com biomoléculas, é o uso desta classe de corantes como ligandos em CA.

Não obstante as cianinas terem múltiplas e extensas aplicações como corantes funcionais em diversas áreas, a sua utilização como ligandos para CA e a sua imobilização em suportes cromatográficos tem sido muito pouco explorada. A relativa facilidade de síntese de diferentes cianinas estruturalmente complexas e possuidoras de um conjunto variado de particularidades estruturais com potencial para interagir de diferentes modos com substratos naturais, tornam-as atrativas para este objetivo [53]. A combinação de tipos específicos de interações hidrófobas, hidrofílicas, iónicas e interações π-π exibidas pelas diferentes porções destes corantes, poderá permitir estabelecer uma interação seletiva desejável com biomoléculas a purificar, fazendo das cianinas candidatos adequados para ligandos de afinidade [65].

33 Os primeiros estudos que envolveram este tipo de corantes mostraram que as cianinas podem ser imobilizadas covalentemente em suportes como a celulose [61,66]. Nesses estudos verificou-se que existem aminocianinas (figura 11) capazes de se ligarem a celulose microcristalina, por meio de um agente de ligação polifuncional - o cloreto de cianurilo [66].

Figura 11 - Estrutura da primeira cianina imobilizada em suportes de celulose.

Na primeira aplicação destes corantes catiónicos como ligandos em CA, procedeu-se à imobilização de um corante cianínico do tipo isotiocianato-funcionalizado (figura 12), em gel de agarose e analisou-se a capacidade deste corante, como ligando de afinidade, para purificar algumas proteínas padrão (albumina de soro bovino (BSA), tripsina e quimotripsina) [67]. Verificou-se então que esta cianina, como ligando, apresentava comportamentos cromatográficos diferentes para as três proteínas em estudo. A influência da composição da fase móvel no comportamento cromatográfico destas proteínas foi também estudada e concluiu-se que a pseudo-afinidade entre estas proteínas e os géis à base da cianina utilizada era fortemente dependente da composição da fase móvel.

Foi assim demonstrado que a cromatografia de pseudo-afinidade utilizando suportes contendo cianinas como ligandos parece proporcionar uma abordagem muito interessante para a purificação de proteínas.

Figura 12 - Estrutura da primeira cianina usada como ligando de afinidade.

Nos últimos anos tem sido explorado o uso de cianinas como ligandos de afinidade [4,68,69]. A figura 13 mostra a estrutura da tiacarbocianina usada nestes trabalhos.

34 Figura 13 - Estrutura da tiacarbocianina usada em estudos de CA.

A utilização de suportes contendo esta tiacarbocianina como ligando permitiram comprovar a sua eficácia na separação da BSA, da quimotripsina e da lisozima, a partir de uma mistura artificial, como resultado de interações de afinidade entre estas proteínas e o corante [68].