por até 8 dias (8D) As plantas cultivadas sem N por 4dias (4D) retornaram a solução de N por mais 4 dias (4D-N4D+ As raízes das plantas foram coletadas e seu conteúdo de aminoácidos analisado via HPLC (n=5).

O asterisco(*) indica diferença significativa entre o tratamento -N e os demais controles de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 11: Teor de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja deficientes em N. Plantas de soja não

noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo NO3 -

(+N) por até 8 dias. Plantas tratadas em solução livre de N (-N) por 4dias retornaram a solução de N por mais 4 dias (-N+N). As raízes das plantas foram coletadas e seu conteúdo de ácidos orgânicos analisado via GCMS. As barras indicam o EP (n=5).

Influência do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes no tecido da folha

Tendo em vista os altos níveis de malato encontrados na seiva do xilema na condição de estresse de N e a fim de melhor compreender esse processo de reciclagem de N relacionada aos ácidos orgânicos verificamos o perfil de composição de aminoácidos e ácidos orgânicos também no tecido da folha de soja submetidas ao tratamento de ausência de N na solução nutritiva para certificar seu acúmulo ou não (sem acúmulo = metabolismo eficiente). Plantas de soja não noduladas cultivadas com solução de KNO3 (5 mM) foram transferidas para solução sem fonte de N ou mantidas em solução de NO3-. As plantas -N posteriormente foram transferidas novamente para solução contendo NO3- por mais quatro dias (recuperação +N) para recuperar seu estado de assimilação e metabolização de N. Estes tratamentos foram realizados do mesmo modo como nos experimentos envolvendo a seiva do xilema e raízes. Inclusive se trata das mesmas plantas do experimento em que coletamos as raízes dos dados apresentados anteriormente. Vale ressaltar que as folhas foram coletadas em três grupos separados (V2/V3, V4/V5 e V6/V7), de acordo com os nós em que se encontram, de modo a diferenciar resultados em função da idade da folha. Toda a parte aérea foi contemplada na coleta.

Os controles com NO3- apresentaram em sua composição de aminoácidos a maior parte formada por Asn, Glu e Gaba totalizando cerca de 50% dos aminoácidos encontrados na folha. A proporção desses aminoácidos foram as mesmas nos controles, com pequenas variações nos três grupos de folhas analisados (Figuras 12, 13 e 14). Em relação ao tratamento -N é possível observar a redução tanto da quantidade quanto da proporção de Asn, assim como occore no xilema e nas raízes, em todos os grupos. Também notamos um aumento da proporção do aminoácido Glu. Em termos quantitativos seu nível é mantido enquanto os demais aminoácidos sofrem redução, o que implica no aumento da sua procentagem na composição de aminoácidos, com exceção do grupo V6/V7 constituído por folhas mais jovens. Outra alteração que chama a atenção é o aumento expressivo de Gln no controle de recuperação após a deficiência de N, especialmente nas folhas jovens. Por se tratar de um aminoácido chave na assimilação de N formado antes de Asn, pode indicar maior atividade metabólica e portanto maior assimilação nessas folhas. Outro dado interessante é a alteração do conteúdo total de aminoácidos, que sofre redução importante no tratamento -N. Essa redução é gradual de acordo com os grupos. Quanto mais jovem são as folhas, maior é o impacto do tratamento na quantidade de aminoácidos totais/grama de peso seco. É digno de

menção que a redução de aminoácidos totais na raiz (ver Figura 10) foi pequena e não significativa, ao contrário da queda significativa na parte aérea. Este fenômeno sugere a transferência de N a partir da parte aérea para a raiz.

Os dados de ácidos orgânicos mostram que o succinato demonstrou um acúmulo em todas as idades de folha em função do tratamento -N (Figs 15, 16 e 17). O -KG também demonstra um certo acúmulo, mas somente nas folhas mais velhas (V2/V3 e V4/V5). Malato, que é o ácido orgânico mais transportado na situação de deficiência de nitrogênio, parece não aumentar seu conteúdo na folha em nenhum dos três grupos estudados possivelmente por ser rapidamente metabolizado.

Figura 12: Composição de aminoácidos em folhas de soja (V2/V3) sob condições de ausência de N na solução. Plantas de soja não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em

sua ausência (-N) por até 8 dias (8D). As plantas cultivadas sem N por até 4 dias (4D) retornaram à solução de N por até mais 4 dias (4D-N4D +N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de aminoácidos analisado via HPLC. O asterisco(*) indica diferença significativa entre o tratamento -N e os demais controles de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 13: Composição de aminoácidos em folhas de soja (V4/V5) sob condições de ausência de N na solução. Plantas de soja não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em

sua ausência (-N) por até 8 dias (8D). As plantas cultivadas sem N por até 4 dias (4D) retornaram à solução de N por até mais 4 dias (4D-N4D +N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de aminoácidos analisado via HPLC. O asterisco(*) indica diferença significativa entre o tratamento -N e os demais controles de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 14: Composição de aminoácidos em folhas de soja (V6/V7) sob condições de ausência de N na solução. Plantas de soja não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em

sua ausência (-N) por até 8 dias (8D). As plantas cultivadas sem N por até 4 dias (4D) retornaram à solução de N por até mais 4 dias (4D-N4D +N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de aminoácidos analisado via HPLC. O asterisco (*) indica diferença significativa entre o tratamento -N e os demais controles de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 15: Teor de ácidos orgânicos em folhas de plantas de soja (V2/V3) deficientes em N. Plantas de soja

não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em sua ausência (-N) por até 8 dias. As plantas cultivadas sem N por 4 dias retornaram a solução de N por mais 4 dias (-N+N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de ácidos orgânicos analisado via GCMS. As barras indicam o EP (n=5).

Figura 16: Teor de ácidos orgânicos em folhas de plantas de soja (V4/V5) deficientes em N. Plantas de soja

não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em sua ausência (-N) por até 8 dias. As plantas cultivadas sem N por 4 dias retornaram a solução de N por mais 4 dias (-N+N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de ácidos orgânicos analisado via GCMS. As barras indicam o EP (n=5).

Figura 17: Teor de ácidos orgânicos em folhas de plantas de soja (V6/V7) deficientes em N. Plantas de soja

não noduladas (V5) foram cultivadas em hidroponia em solução contendo N (+N) ou em sua ausência (-N) por até 8 dias. As plantas cultivadas sem N por 4 dias retornaram a solução de N por mais 4 dias (-N+N). As folhas das plantas foram coletadas e seu conteúdo de ácidos orgânicos analisado via GCMS. As barras indicam o EP (n=5).

Influência da nutrição nitrogenadade soja nodulada na produção de ácidos orgânicos e seu transporte no xilema

O N é o principal nutriente limitante do crescimento e desenvolvimento vegetal. Normalmente é captado no solo na forma inorgânica de nitrato ou amônia. Em solos em que a disponibilidade de N não é suficiente leguminosas como a soja podem desenvolver um processo de simbiose com microorganismos fixadores de N2. Dessa forma o nódulo se torna a principal fonte de N da planta. Como essa simbiose entre plantas de soja e bactérias do gênero

Bradyrhizobium é bastante comum e importante na agricultura essas plantas noduladas

também fizeram parte do nosso trabalho. O objetivo foi comparar os resultados obtidos com plantas não noduladas e verificar se o transporte de ácidos orgânicos em função da deficiência de N na raiz também se aplica à essas plantas. Foram utilizadas plantas noduladas cultivadas com solução sem N até o estádio de desenvolvimento V5. Portanto, as raízes estavam deficientes em N e o produto da fixação de N2 no nódulo era sua única fonte de N. Foi testado neste experimento a aplicação de NO3-(5 mM) que, de acordo com trabalhos anteriores, inibe a fixação de N2 e induz a assimilação de nitrato na raiz (Atkins et al., 1980). Desta forma, o nitrato provoca uma mudança radical na forma predominante de assimilação de N no sistema radicular.

Pelos dados obtidos para a seiva do xilema (Figura 18), foi observado que a composição de aminoácidos (mol%) para plantas noduladas cultivadas sem a presença de N mineral (Ctrl D0) tem características diferentes da composição de plantas não-noduladas cultivadas com o NO3- (cf Figura 1), principalmente pelo teor mais elevado de Gln e mais baixo de Asn. Apos transferir tais plantas para um meio com NO3- por 4 dias, o nitrato promoveu um aumento em Asn e queda em Gln em relação aos valores iniciais. Tais mudanças estão de acordo com dados anteriores do nosso laboratório que mostram uma composição de aminoácidos semelhante àquela apresentada por plantas não-noduladas cultivadas com NO3- e caracterizam a troca do processo de assimilação de fixação simbiótica para assimilação do NO3- (Puiatti e Sodek, 1999; Lima e Sodek, 2003). Entretanto, nos controles sem adição de NO3- também houve aumento de Asn e queda de Gln. Embora aos 4D estas alterações foram de forma mais discreta do que na presença do nitrato, aos 9D não houve diferença no grau de mudança entre o nitrato presente e ausente. Isto pode refletir uma diminuição na fixação de N2, pois já é conhecido que elevados teores de Gln dependem mais da fixação de N2 enquanto que da Asn dependem da assimilação do nitrato (Atkins et al., 1980; Puiatti e Sodek, 1999; Amarante e Sodek, 2006a). Por outro lado, o tratamento de

recuperação apresentou o resultado esperado, pois com o retorno da planta nodulada para o cultivo sem N mineral após 4 dias na presença do NO3-, houve um aumento em Gln e diminuição de Asn, chegando a valores próximos dos controles sem N dos dias 0 e 4. Possivelmente, a recuperação não foi total em razão da dificuldade de remover todo NO3- da vermiculita ao voltar do NO3- para o cultivo sem N. Apesar dos dados inesperados o efeito do NO3- em alterar o processo de assimilação do N foi evidenciado. Analisando a seiva do xilema não foi possível identificar diferenças significativas em relação à quantidade de aminoácidos totais nos diferentes tratamentos.

Em relação aos ácidos orgânicos, não houve grandes mudanças nos seus teores no xilema em função dos tratamentos, exceto para o malato. Neste caso houve uma queda significativa no teor de malato na presença do NO3-, pois o teor inicial no controle sem N foi bastante elevado. Após retornar à condição de cultivo sem N mineral, o teor de malato voltou para o valor elevado encontrado no controle (tratamento recuperação) (Figura 19). Este valor elevado de malato no controle e baixo na presença do NO3- significa que a planta nodulada assemelha-se à não-nodulada (cf Figura 3) quanto à resposta do malato à presença e ausência do N.

Figura 18: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja (V5) nodulada na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e com

adição de NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias (D0) por até nove dias (4D e 9D). Algumas plantas foram cultivadas

com NO3- por quatro dias e retornaram a solução sem N por mais cinco dia (4D5D+N-N). Diferenças entre os

Figura 19: Perfil de composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja (V5) nodulada na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e

com adição de NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias por até nove dias. Algumas plantas foram cultivadas com NO3-

O tecido da raiz e dos nódulos dessas plantas noduladas também foram analisados. Dessa forma é possível verificar as alterações ocorridas nos dois tecidos e tentar relacioná-las a composição de aminoácidos e ácidos orgânicos observada na seiva do xilema. De acordo com os resultados das análises da raiz não houve diferenças significativas na quantidade total de aminoácidos entre tratamentos (Figura 20). Contudo é observado um aumento da porcentagem de Asn nas plantas com adição de NO3- que está de acordo com a indução da assimilação de N pela raiz na presença do NO3-. Houve pouca variação nos outros aminoácidos. No caso dos ácidos orgânicos (Figura 21) no geral as variações observadas foram independentes do tratamento e assim podem ser relacionados com variações das condições de tempo como temperatura e umidade ao longo do experimento.

Figura 20: Perfil de composição de aminoácidos em raízes de plantas de soja nodulada (V5) na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e com adição de

NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias (D0) por até nove dias (4D e 9D). Algumas plantas foram cultivadas com NO3-

por quatro dias e retornaram a solução sem N por mais cinco dias (4D+N5D-N). Diferenças entre os tratamentos -N e +N não significativas de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 21: Perfil de composição de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja nodulada (V5) na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e com

adição de NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias por até nove dias. Algumas plantas foram cultivadas com NO3- por

A análise dos aminoácidos nos nódulos tampouco mostrou diferenças significativas no total de aminoácidos entre tratamentos e houve pouca variação na sua composição (Figura 22). A falta de resposta dos aminoácidos do nódulo a certos tratamentos que prejudicam a fixação de N2 já foi constatada antes (Souza et al., 2016). Os aminoácidos Asn, Glu e Ala foram os componentes principais com teores menores de Ser e GABA. Os ácidos orgânicos apresentaram o mesmo perfil de resposta aos tratamentos para todos os compostos (Figura 23). Houve queda no tratamento com NO3- que não foi revertido com o retorno das plantas para a solução deficiente em N. A queda do malato no tratamento com NO3- foi expressiva atingindo um valor 4 vezes menor no dia 4.

Figura 22: Perfil de composição de aminoácidos em nódulos de plantas de soja (V5) na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e com adição de

NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias por até nove dias (4D e 9D). Algumas plantas foram cultivadas com NO3- por

quatro dias e retornaram a solução sem N por mais cinco dias (4D+N5D-N). Diferenças entre os tratamentos -N e +N não significativas de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

Figura 23: Perfil de composição de ácidos orgânicos em nódulos de plantas de soja (V5) na presença e ausência de N mineral. As plantas foram cultivadas em vermiculita em solução sem N (-N) e com adição de

NO3-(5 mM) (+N) aos zero dias por até nove dias. Algumas plantas foram cultivadas com NO3- por quatro dias e

Marcação de ácidos orgânicos transportados no xilema mediante nutrição da raiz com Asp- 4-C-13C

Visando esclarecer a origem dos elevados teores de malato encontrados no xilema de plantas cultivadas na ausência de N mineral, foi conduzido o seguinte experimento com Asp marcado, tendo em vista a estreita relação entre o metabolismo de Asp e malato. Inicialmente pretendíamos alimentar as plantas com Asp marcado via pecíolo foliar, para simular o fornecimento desse aminoácido via floema para a raiz. Contudo testes preliminares com 14C mostraram que a marcação no xilema é muito mais acentuada quando o Asp é fornecido diretamente na raiz. Por esse motivo, de modo a garantir que o experimento fosse bem sucedido, o Asp marcado foi adicionado na solução nutritiva. Para este fim, plantas de soja não-noduladas foram mantidas em uma solução sem N por 48h e transferidas para uma solução contendo Asp-4-C-13C (1 mM) por mais 24h. A seiva do xilema dessas plantas foi então coletada e analisada. Na tabela II se encontram os dados do total de 13C incorporado aos compostos e sua porcentagem de incorporação relativa ao total de moléculas (enriquecimento). Observamos o enriquecimento de malato e fumarato em ambos os tratamentos com aumento da incorporação na condição -N. Também vemos a incorporação nesses dois ácidos orgânicos na mesma proporção, consistente com a reversibilidade da fumarase o que mantém estas moléculas em equilíbrio. Mas ao observar o total de 13C incorporado ao malato, este apresenta quantidade muito maior em relação ao fumarato, em função da quantidade muito superior. Nesse sentido o malato é a molécula que apresenta maior quantidade de C marcado em resposta ao tratamento -N (6,22 nmol no controle +N e 131,04 nmol no tratamento -N um aumento de cerca de 20 vezes). Apesar dessa importante marcação do malato, Asn, é de fato, a molécula que mais incorporou o 13C, tanto no tratamento +N quanto no -N (Tabela III). Contudo, a quantidade de moléculas de Asn reduziram substancialmente no tratamento -N. Outros ácidos orgânicos como -KG também tiveram suas quantidades aumentadas apesar da porcentagem de incorporação permanecer constante. Os resultados indicam uma divergência do metabolismo do Asp nas duas condições testadas. Na primeira de suficiência de N há uma maior contribuição do Asp para produção de Asn comparada a condição -N em que há um aumento importante de malato e um claro desvio de Asp para sua formação.

Tabela II: Total de 13C e % de enriquecimento encontrado nos principais ácidos orgânicos transportados na seiva do xilema após incubação de plantas intactas de soja não-nodulada com Asp- C-4- 13C na presença e ausência de N mineral. Após 48h de tratamento com a fonte de N (NO3- ou sem N) o Asp marcado

foi adicionado ao meio hidropônico e incubado por mais 24 h quando foi coletada a seiva do xilema. Os valores correspondem a média (nmol/mL ou % de enriquecimento) seguida de seu erro padrão (n=3). Os valores em negrito indicam incorporação acima de 0,5%, valores de aumento de enriquecimento abaixo dessa porcentagem não são reproduzíveis nem confiáveis segundo Parsons e Baker (1996) para o método utilizado de detecção.

nmol13C +/-s.e. 13C% +/-s.e. nmol13C +/-s.e. 13C% +/-s.e.

Lac 0.00 0.42 -0.01 0.29 0.07 0.03 0.15 0.03 Suc 0.03 0.03 0.05 0.07 0.04 0.33 0.04 0.16 Fum 0.07 0.02 1.81 0.73 0.93 0.02 4.45 0.38 Mal 6.22 2.06 2.13 0.38 131.04 7.45 4.81 0.16 aKG 0.73 0.42 2.41 1.04 21.27 1.41 2.43 0.43 Cit 46.97 2.85 6.45 1.11 22.14 3.28 4.18 0.43 +N -N

Tabela III: Total de 13C e % de enriquecimento encontrado nos principais aminoácidos transportados na seiva do xilema após incubação de plantas intactas de soja não-nodulada com Asp- C-4- 13C na presença e ausência de N mineral. Após 48h de tratamento com a fonte de N (NO3- ou sem N) o Asp marcado foi

adicionado ao meio hidropônico e incubado por mais 24 h quando foi coletada a seiva do xilema. Os valores correspondem a média (nmol/mL ou % de enriquecimento) seguida de seu erro padrão (n=3). Os valores em negrito indicam incorporação acima de 0,5%, valores de aumento de enriquecimento abaixo dessa porcentagem não são reproduzíveis nem confiáveis segundo Parsons e Baker (1996) para o método utilizado de detecção.

nmol13C +/-s.e. 13C% +/-s.e. nmol13C +/-s.e. 13C% +/-s.e.

Ala 0.07 0.00 0.19 0.01 0.15 0.00 0.45 0.05 Gly 0.04 0.00 0.31 0.03 0.04 0.02 0.22 0.24 Val -0.21 0.01 -0.14 0.03 -0.06 0.01 -0.11 0.11 Leu -0.11 0.00 -0.19 0.01 -0.04 0.00 -0.15 0.10 Ile 0.26 0.00 0.46 0.02 0.10 0.05 0.44 0.15 Gaba 0.36 0.05 0.69 0.23 0.21 0.07 2.00 0.13 Pro 0.23 0.02 1.02 0.46 0.38 0.03 2.17 0.14 Met 0.04 0.00 0.45 0.01 0.03 0.00 1.30 0.15 Ser -0.02 0.00 -0.07 0.04 0.08 0.00 0.29 0.07 Thr 0.63 0.13 3.36 0.45 0.21 0.08 2.55 0.68 Phe 0.08 0.00 0.43 0.06 0.05 0.01 0.65 0.02 Asp 52.79 6.08 6.60 0.14 21.12 0.87 7.11 0.09 Glu 0.78 0.02 1.89 0.13 0.88 0.02 2.06 0.22 Asn 804.03 155.51 12.39 0.44 341.17 3.64 12.61 0.14 +N -N

Discussão

Os ácidos orgânicos emergiram recentemente como compostos responsáveis por importantes funções fisiológicas na planta como transporte de metais e tolerância ao estresse hídrico (revisado por Schachtman e Goodger, 2008). No entanto ainda pouco se sabe sobre seu papel na reciclagem de substâncias, principalmente de N, na planta. Em um trabalho em colaboração com o nosso laboratório foi mostrado que a síntese de Ala, que tem seus níveis aumentados durante o alagamento do sistema radicular, está relacionada com a produção de ácidos orgânicos como malato e succinato na raiz (Rocha et al., 2010). No presente estudo investigamos mais profundamente essa inter-relação entre o metabolismo de aminoácidos e ácidos orgânicos em plantas de soja na ausência de N na solução. A nossa hipótese é de que quando a captação e assimilação de N pelas raízes da planta estiverem ativas os principais aminoácidos provindos do floema irão ser utilizados para produção de Asn. Ao passo que quando a assimilação de N na raiz estiver inativa esses aminoácidos formarão ácidos orgânicos como subprodutos de transaminações necessárias para formação dos demais aminoácidos demandados pela raiz (Figura 24).

Baseados em nossa hipótese foram testadas algumas situações em que a planta se encontra em um estado de insuficiência de N e a seiva do xilema dessas plantas foi analisada. Nós constatamos, em nossos controles cultivados com NO3- e mantidos nessa solução durante o experimento, que o principal componente da seiva do xilema, entre os aminoácidos, é a Asn, o que está de acordo com trabalhos anteriores (McClure e Isarael, 1979, Puiatti e Sodek, 1999). Já nas plantas deficientes em N há uma redução bastante evidente de aminoácidos totais na seiva do xilema e principalmente de Asn resultado que já era esperado e que também se confirmou (Lima e Sodek, 2003). No entanto, ao mesmo tempo em que ocorre essa redução dos aminoácidos observamos aumento nos níveis de ácidos orgânicos nessas plantas deficientes em N, principalmente do malato, ácido orgânico encontrado em maior quantidade na seiva do xilema. O aumento da produção de malato na raiz, de acordo com a nossa hipótese, seria em função da conversão do Asp, provindo do floema, nos demais aminoácidos necessários para manutenção da raiz. As análises da seiva do floema nessas plantas confirmaram a predominância de Asp e Glu, inclusive nas plantas sob estresse de N por até dois dias. Essa via de produção de aminoácidos se tornaria predominante, pois a captação de NO3- e consequentemente a sua redução via NR para assimilação pela planta estariam inativos. Essa reação de transaminação que utiliza o Asp e o -KG como esqueleto de carbono gera como subproduto o malato. O seu transporte via o xilema da planta seria

importante, pois uma vez enviado para a parte aérea o malato poderia ser convertido em Asp novamente, o qual por sua vez poderia ser enviado para a raiz fechando o ciclo como ilustrado