Papel dos ácidos orgânicos no metabolismo e reciclagem de N em soja sob situações de estresse na raiz : deficiência de N e hipóxia

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

SIMONE CESPEDES VITOR

PAPEL DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS NO

METABOLISMO E RECICLAGEM DE N EM SOJA SOB

SITUAÇÕES DE ESTRESSE NA RAIZ: DEFICIÊNCIA DE N E

HIPÓXIA

CAMPINAS (2017)

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SIMONE CESPEDES VITOR

PAPEL DOS ÁCIDOS ORGÂNICOS NO METABOLISMO E

RECICLAGEM DE N EM SOJA SOB SITUAÇÕES DE ESTRESSE NA

RAIZ: DEFICIÊNCIA DE N E HIPÓXIA

Tese apresentada ao

Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de doutora em biologia vegetal.

Orientador: LADASLAV SODEK

CAMPINAS (2017)

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA SIMONE CESPEDES VITOR E ORIENTADA PELO PROF. DR. LADASLAV SODEK.

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Campinas, 26 de julho de 2017.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Ladaslav Sodek

Dra. Marina Câmara Mattos Martins Prof. Dr. Paulo Mazzafera

Prof. Dr. Halley Caixeta de Oliveira Prof. Dr. Luciano do Amarante

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

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Ao meu pai, quem Deus decidiu levar para junto de Si antes que pudesse presenciar a conclusão de mais essa etapa da minha vida,

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiro a Deus por estar ao meu lado sempre e reforçar a minha fé a cada dia.

À minha família, meus pais e irmãos, cujo amor, educação e apoio foram essenciais.

À minha nova família, Lucas, meu marido, por ser meu melhor amigo e o amor da minha vida. Sem o seu suporte e serenidade nos momentos difíceis eu haveria desistido de muitas coisas. Obrigada por me fazer seguir em frente, sempre.

Ao meu Professor Ladaslav Sodek pela oportunidade e imprescindível orientação ao longo deste trabalho. Agradeço especialmente pelas valiosas lições de ciência e paciência. Além do excelente profissional, sua calma, sensibilidade e sabedoria certamente o fazem uma pessoa incrível e exemplar. Obrigada por ser um exemplo para mim!

Aos funcionários da fisiologia vegetal pelo suporte técnico necessário para a realização dos experimentos.

Aos amigos da fisiologia vegetal pelas conversas e discussões, pela companhia no dia a dia do laboratório, nos almoços e agradeço sobretudo pelos bolos!

À secretária Maria Roseli pela disponibilidade em ajudar a qualquer momento. À Sarinha pela contribuição e sugestões ao participar da minha qualificação. Ao Prof. Rafael Vasconcelos também pelas sugestões e contribuição na pré-banca. Aos Professores Halley e Sara por haverem participado da minha qualificação e pré-banca.

Aos membros da minha banca de defesa pela disponibilidade e contribuição para o trabalho.

À FAPESP pela concessão da bolsa de doutorado (processo 2013/03325-8). Ao CNPq pelo apoio financeiro.

A todos que embora não citados contribuíram de alguma forma para este trabalho. Por fim agradeço a você que me prestigia com sua leitura. Obrigada!

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RESUMO

No presente trabalho se estudou o transporte de ácidos orgânicos e aminoácidos via seiva do xilema em plantas de soja sob situações de estresse por deficiência de N e de hipóxia radicular. Observamos uma quantidade cerca de dez vezes maior de malato transportada na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob severa deficiência de N. Plantas noduladas cuja única fonte de N é provida pela fixação de N2 nos nódulos também mostraram um maior conteúdo de malato no xilema. Quando essas raízes são supridas com nitrato ou amônio a quantidade de malato diminuiu. Em plantas noduladas e não noduladas sob hipóxia também foi encontrada uma grande quantidade de malato no xilema acompanhada de succinato. A nossa proposta foi descobrir a origem desse malato transportado. O aminoácido Asp foi o principal componente transportado na seiva do floema a partir das folhas para a raiz em condições suficientes de N e de disponibilidade de O2, assim como nas duas situações de estresse: deficiência de N e hipóxia radicular, nas quais a constituição da seiva do floema foi mantida. Dessa forma esse aminoácido é um candidato a prover o esqueleto de C para formação de malato nas raízes. A incubação de raízes de plantas intactas com 13C-Asp mostrou que o malato foi prontamente marcado na seiva do xilema de plantas deficientes em N bem como em fragmentos de raízes isolados sob hipóxia. Plantas cultivadas com níveis suficientes de N na solução transportam quantidades substanciais de asparagina (Asn), que foi bastante reduzida em plantas privadas de N e sob hipóxia. A nossa hipótese é de que Asp fornecido pelo floema seria convertido em Asn nas raízes quando a captação e assimilação de N nas raízes estão ativas e dessa forma transportaria N para as folhas a partir da raiz. No entanto se o metabolismo de N na raiz estiver prejudicado o Asp provindo das folhas forneceria N para raiz mediante reações de transaminação e formaria outros aminoácidos demandados pela raiz para sua manutenção durante o período de estresse. subproduto da transaminação de Asp é justamente o malato. Então de acordo com o status de N da planta o xilema contém altos níveis de Asn ou malato. No caso de hipóxia radicular a redução do metabolismo oxidativo levaria Asp a fornecer N para formação de Ala, o que resultaria na formação de malato e succinato na raiz. O transporte desses compostos para a parte aérea resultaria na oxidação dessas moléculas nas folhas, onde o metabolismo oxidativo está normal. Este trabalho mostra a importância desses ácidos orgânicos nas situações de estresse estudadas.

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ABSTRACT

In the present work we studied the translocation of organic acids and amino acids in the xylem sap of soybean plants under N deficiency and root hypoxia. We observed an important amount of malate transported in xylem sap of non-nodulated soybean plants under N depletion. Nodulated plants whose sole N source is provided by N2 fixation in nodules also showed a higher content of malate in the xylem. When roots are supplied with nitrate or ammonium the amount of malate decreased. In non-nodulated plants under hypoxia we also found a higher amount of malate together with succinate. The same was seen in nodulated plants. Our aim was then to elucidate the origin of the elevated quantities of malate transported. The amino acid Asp is the main compound transported in phloem sap from shoot to roots in N suficient nutrition or normal conditions of O2 availability, as well as in both of the stress conditions: N-free medium or root hypoxia. Thus this amino acid is a candidate to provide the C skeleton for malate formation in roots. Incubation of roots with 13C-Asp demonstrated that malate was readily labeled in the xylem sap of plants deprived of nitrate, as well as in root pieces under hypoxia. Plants cultivated with sufficient N levels in the nutrient solution transport substantial amounts of Asn, that is strongly reduced in plants deficient in N or under hypoxia. Our hypothesis is that Asp supplied by the phloem would be converted to Asn in roots when N uptake and assimilation in roots are active and this Asn transport N from the root to the shoot. However if N metabolism in roots is impaired, Asp would provide N to the root by transamination reactions thereby forming other amino acids demanded for root maintenance during the period of stress. Malate is a by-product of transamination with Asp. Thus, according to the N status of the plant, the xylem contains elevated levels of either asparagine or malate. Under root hypoxia the impairment of oxidative metabolism leads Asp to supply N for Ala production, and malate and succinate are formed in roots. The transport of these organic acids to the shoot would allow the oxidation of these molecules in leaves where oxidative metabolism is normal. This work demonstrates the importance of these organic acids in the stress situations studied.

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LISTA DE FIGURAS GERAL

Figura 1: Esquema representativo do processo de assimilação de N inorgânico nas plantas... 19

LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I Figura 1: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. ... 37

Figura 2: Níveis dos aminoácidos Asp e Asn na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. ... 38

Figura 3: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. ... 39

Figura 4: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas em função da fonte de N. ... 42

Figura 5: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas em função da fonte de N. ... 43

Figura 6: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas com aplicação foliar de ureia. ... 45

Figura 7: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas com aplicação foliar de ureia. ... 46

Figura 8: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plântulas (V1 e V2) de soja não noduladas na presença e ausência do N mineral. ... 48

Figura 9: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plântulas (V1 e V2) de soja não noduladas na presença e ausência do N mineral. ... 49

Figura 10: Composição de aminoácidos na raiz de soja em condições de ausência de N na solução. ... 51

Figura 11: Teor de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja deficientes em N. ... 52

Figura 12: Composição de aminoácidos em folhas de soja (V2/V3) sob condições de ausência de N na solução. ... 55

Figura 15: Teor de ácidos orgânicos em folhas de plantas de soja (V2/V3) deficientes em N. ... 58

Figura 18: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja (V5) nodulada na presença e ausência de N mineral. ... 63

Figura 19: Perfil de composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja (V5) nodulada na presença e ausência de N mineral. ... 64

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Figura 20: Perfil de composição de aminoácidos em raízes de plantas de soja nodulada (V5) na presença e

ausência de N mineral. ... 65

Figura 21: Perfil de composição de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja nodulada (V5) na presença e ausência de N mineral. ... 66

Figura 22: Perfil de composição de aminoácidos em nódulos de plantas de soja (V5) na presença e ausência de N mineral. ... 67

Figura 23: Perfil de composição de ácidos orgânicos em nódulos de plantas de soja (V5) na presença e ausência de N mineral. ... 68

Figura 24: Esquema representativo da hipótese de correlação entre o metabolismo de N e ácidos orgânicos. ... 72

Figura 25: Esquema representativo da hipótese de correlação entre o metabolismo de N e ácidos orgânicos em uma situação de insuficiência de N na raiz. ... 74

Figura 26: Esquema representativo de uma lançadeira malato-aspartado. ... 77

Figura 27: Elucidação da marcação de ácidos orgânicos com 13C a partir do Asp-4-13C via reações do ciclo de Krebs. ... 80

LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO II Figura 1: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não-noduladas e aminoácidos totais em plantas sob hipóxia. ... 90

Figura 2: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob hipóxia radicular. ... 91

Figura 3: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não-noduladas (V5) sob recuperação do estresse de hipóxia na raiz. ... 94

Figura 4: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas (V5) sob recuperação do estresse de hipóxia radicular. ... 95

Figura 5: Composição de aminoácidos na raiz de soja sob estresse de hipóxia em plantas não noduladas. ... 97

Figura 6: Teor de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja não-nodulada sob estresse de hipóxia radicular. ... 98

Figura 7: Composição de aminoácidos em folha de soja (V2/V3) sob estresse de hipóxia. ... 100

Figura 10: Teor de ácidos orgânicos em folhas (V2/V3) de plantas de soja sob estresse de hipóxia radicular. ... 103

Figura 13: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja noduladas (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 107

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Figura 14: Perfil de composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja noduladas (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 108 Figura 15: Perfil de composição de aminoácidos em nódulos de plantas de soja (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 109 Figura 16: Perfil de composição de ácidos orgânicos em nódulos de plantas de soja (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 110 Figura 17: Perfil de composição de aminoácidos em raízes de plantas de soja noduladas (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 111 Figura 18: Perfil de composição de ácidos orgânicos em raízes de plantas de soja noduladas (V5) sob estresse de hipóxia radicular. ... 112 Figura 19: Esquema representativo da hipótese da relação entre o metabolismo de N e ácidos orgânicos em uma situação de hipóxia na raiz. ... 116

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LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I

Tabela I: Perfil de composição de aminoácidos presentes no floema de plantas de soja não-noduladas sob deficiência de N. ... 40 Tabela II: Total de 13C e % de enriquecimento encontrado nos principais ácidos orgânicos transportados na seiva do xilema após incubação de plantas intactas de soja não-nodulada com Asp- C-4- 13C na presença e ausência de N mineral. ... 70 Tabela III: Total de 13C e % de enriquecimento encontrado nos principais aminoácidos transportados na seiva do xilema após incubação de plantas intactas de soja não-nodulada com Asp- C-4- 13C na presença e ausência de N mineral. ... 70

LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II

Tabela I: Perfil de composição de aminoácidos presentes no floema de plantas de soja não-noduladas sob estresse de hipóxia radicular. ... 92 Tabela II: Incorporação de %13C nos principais ácidos orgânicos e aminoácidos em fragmentos de raízes de soja incubados com Asp-4C-13C por 6 e 24h. ... 114

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LISTA DE ABREVIATURAS

-CA - -cetoácidos

-KG - -cetoglutarato ADP – Adenosina difosfato Ala - Alanina

AlaAT – Alanina aminotransferase Arg- Arginina

AS – Asparagina sintetase Asn - Asparagina

Asp - Aspartato AT - Transaminases

ATP – Adenosina trifosfato C - Carbono

EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético FBN – Fixação biológica de nitrogênio GABA - Ácido gamma-aminobutírico GABA-T - GABA transaminase

GCMS – Cromatógrafo à gás acoplado a espectrômetro de massas Gln – Glutamina

Glu - Glutamato

GOGAT – Glutamato sintase GS – Glutamina sintetase

HPLC – Cromatografia líquida de alto desempenho Mal - Malato

MDH - Malato desidrogenase Met - metionina

N – Nitrogênio

NR – Redutase do nitrato NiR – Redutase do nitrito

NADH/NAD+ – Nicotinamida adenina dinucleotídeo O2 – Oxigênio molecular

OAA - Oxaloacetato Pro - Prolina

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Thr - Treonina

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ÍNDICE

RESUMO ... 7

ABSTRACT ... 8

LISTA DE ABREVIATURAS ... 13

INTRODUÇÃO GERAL ... 18

METABOLISMO DE NITROGÊNIO NA PLANTA ... 18

INTER-RELAÇÃO ENTRE METABOLISMO DE NITROGÊNIO E CARBONO ... 20

TRANSPORTE DE COMPOSTOS NO XILEMA ... 20

RECICLAGEM DE N NAS PLANTAS ... 21

PAPEL FISIOLÓGICO DO MALATO ... 22

OBJETIVOS GERAIS ... 24

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 24

CAPÍTULO I: OS ALTOS NÍVEIS DE MALATO TRANSPORTADO NO XILEMA DE SOJA SOB DEFICIÊNCIA SEVERA DE NITROGÊNIO SÃO ORIGINADOS DO METABOLISMO DOS AMINOÁCIDOS PROVINDOS DO FLOEMA. ... 25

INTRODUÇÃO ... 25

OBJETIVO GERAL ... 28

OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 28

MATERIAIS E MÉTODOS... 29

Cultivo das plantas ... 29

Cultivo de rizóbios ... 29

Tratamentos ... 29

Experimento nutrição foliar com ureia ... 30

Experimento com plântulas com cotilédones verdes ... 31

Coleta da seiva do xilema ... 31

Coleta da seiva do floema ... 31

Coleta da raiz ... 32

Coleta dos nódulos ... 32

Coleta das folhas ... 32

Extração em MCW ... 32

Marcação com 13C utilizando plantas intactas ... 33

Análises de aminoácidos por HPLC ... 33

Análise de ácidos orgânicos por GC-MS ... 34

Análise dos compostos marcados por GCMS ... 35

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RESULTADOS ... 36

Influência do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na seiva do xilema ... 36

Tratamento com NH4+ não altera composição de ácidos orgânicos transportados na seiva do xilema ... 41

Influência da nutrição foliar com ureia em plantas não noduladas cultivadas em solução –N na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na seiva do xilema ... 44

Composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na seiva do xilema de plantas com cotilédones ainda verdes em solução -N ... 47

Influência do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes no tecido da raiz de plantas não noduladas ... 50

Influência do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes no tecido da folha ... 53

Influência da nutrição nitrogenada de soja nodulada na produção de ácidos orgânicos e seu transporte no xilema ... 61

Marcação de ácidos orgânicos transportados no xilema mediante nutrição da raiz com Asp-4-C-13C ... 69

DISCUSSÃO ... 71

CAPÍTULO II: ÁCIDOS ORGÂNICOS PRODUZIDOS NA RAIZ DE SOJA SOB HIPÓXIA SÃO TRANSPORTADOS PARA A PARTE AÉREA PARA SEREM OXIDADOS COMO MECANISMO DE TOLERÂNCIA AO ESTRESSE. ... 81

INTRODUÇÃO ... 81

OBJETIVO GERAL ... 85

OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 85

MATERIAIS E MÉTODOS... 86

Cultivo das plantas ... 86

Tratamentos ... 86

Cultivo de rizóbios ... 87

Coleta da seiva do xilema e floema ... 87

Coleta dos nódulos, raízes e folhas ... 87

Extração em MCW ... 87

Marcação com 13C utilizando fragmentos de raízes ... 87

Análises de aminoácidos por HPLC ... 88

Análise de ácidos orgânicos por GCMS ... 88

Análise dos compostos marcados por GCMS ... 88

Análise estatística ... 88

RESULTADOS ... 89

Influência do estresse de hipóxia da raiz de soja não-nodulada na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na seiva do xilema... 89

Recuperação do estado de normóxia em plantas sob estresse de hipóxia na raiz ... 93

Efeito da hipóxia na raiz de soja não nodulada na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes no tecido da raiz ... 96

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Composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes no tecido da folha em função do efeito de

hipóxia na raiz de soja não nodulada ... 99

Plantas noduladas sob estresse de alagamento (hipóxia do sistema radicular) ... 106

Marcação de ácidos orgânicos em fragmentos de raiz sob hipóxia supridas com Asp-4C-13C ... 113

DISCUSSÃO ... 115

CONCLUSÕES ... 122

REFERÊNCIAS ... 123

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INTRODUÇÃO GERAL

Metabolismo de Nitrogênio na planta

O N é um nutriente imprescindível para o crescimento e desenvolvimento vegetal. É encontrado principalmente na composição de proteínas, mas também de outros compostos fundamentais como ácidos nucléicos e a clorofila e constitui tanto moléculas com função estrutural como sinalizadora (Marschner, 1995). As principais fontes de N utilizadas pelas plantas são o nitrato (NO3-) e o amônio (NH4+). Há uma pequena participação de aminoácidos livres que também podem ser absorvidos pela planta quando disponíveis no solo (Miller, 2007). O NO3- captado em seguida é reduzido a NH4+ para ser assimilado em aminoácidos. Essa redução é realizada em duas etapas: a primeira ocorre no citoplasma da célula mediante a enzima redutase do nitrato (NR), gerando nitrito. A segunda etapa ocorre nos plastídios, em raízes, e nos cloroplastos, em folhas, pela enzima redutase do nitrito (NiR), que por sua vez forma o NH4+ (Meyer e Stitt, 2001). Esse amônio gerado através da redução do nitrato é assimilado em aminoácidos mediante o sistema GS/GOGAT, enzimas que também se encontram localizadas em plastídeos e cloroplastos (Lee, 1980; Abrol, 1983). A glutamina sintetase (GS) incorpora o NH4+ em uma molécula de glutamato (Glu) formando glutamina (Gln). Em seguida essa molécula de Gln reage com -cetoglutarato-KG) para produzir duas moléculas de Glu. Essa reação é catalizada pela glutamina 2-oxoglutarato amino transferase (ou glutamato sintetase, GOGAT) (Lea e Miﬂin, 1974; Lea e Forde, 1994). A asparagina sintetase (AS) também é uma importante enzima no processo de assimilação de aminoácidos. Sua função consiste na transferência de um grupo amida da Gln para o aspartato (Asp) resultando na formação de asparagina (Asn) e Glu (Lam et al., 2003). Dessa forma os aminoácidos Glu, Gln e Asn exercem função especial na assimilação de N inorgânico e desempenham importante papel no transporte de N na planta. Ainda, como partes fundamentais nesse processo, o Asp e o Glu participam das reações de transaminação incorporando grupos amidas e os ácidos orgânicos, principalmente os ceto-ácidos, que são essenciais como esqueletos de carbono para a formação de aminoácidos. A figura 1 ilustra de modo simplificado o processo de assimilação.

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Figura 1: Esquema representativo do processo de assimilação de N inorgânico nas plantas. O nitrato

captado do meio pela raiz é reduzido a nitrito ainda do citoplasma da célula pela enzima redutase do nitrato (NR). Em seguida, nos plastídeos, esse nitrito é reduzido a amônio que é incorporado a uma molécula de glutamato gerando glutamina via glutamina sintetase (GS). Mediante a enzima GOGAT essa glutamina juntamente com um ácido orgânico (-KG) produzem duas moléculas de Glu, em que uma é reutilizada para manter a assimilação e a outra permanece como saldo e é utilizada pela planta. A partir desse ponto os aminoácidos podem ser usados na raiz ou transportados. Mais íons amônio podem ser incorporados e com a ação de transaminases (AT) e a participação dos ácidos orgânicos outros aminoácidos como Asn podem ser formados via asparagina sintetase (AS).

Vale ressaltar que na figura acima o metabolismo de aminoácidos está representado de modo simplificado e somente na raiz, e neste caso seus produtos seriam transportados via xilema para a parte aérea, além de utilizados pelo próprio tecido da raiz. Contudo o NO3- pode ser transportado via xilema e reduzido nas folhas. Isso depende da taxa de captação do NO3- pela planta e da capacidade de assimilação da raiz que varia de acordo com a espécie. Em relação ao NH4+ as plantas previnem seu acúmulo devido a sua toxicidade e o assimilam rapidamente já nas raízes (Marchner, 1995; Andrews, 1986; Peuke et al., 1996; Oliveira et al., 2013).

Na insuficiência de suprimento de N no solo plantas leguminosas podem se associar simbioticamente a bactérias fixadoras de N2 atmosférico (Schubert, 1986; Udvarde e Poole, 2013). Neste caso o NH4+ é o primeiro produto estável da fixação de N nos nódulos, que é excretado no citosol das células da raiz hospedeira, onde o N é assimilado em compostos orgânicos principalmente para transporte via xilema. Os principais compostos orgânicos nitrogenados transportados são ureídes, mas as amidas, como Asn, compõem parte importante dos compostos transportados. Em soja trabalhos com 15N2 mostram que o primeiro

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aminoácido a incorporar 15N é Gln, sendo inclusive seu transporte no xilema um indicador da atividade da enzima nitrogenase (Amarante e Sodek, 2006a; Justino e Sodek, 2013; Souza et al., 2016). Asn também constitui uma porcentagem importante de aminoácidos transportados em plantas noduladas (Lima e Sodek, 2003). Quando NO3- ou NH4+ estão disponíveis no solo em quantidades suficientes ocorre inibição da fixação de N2 e a planta passa a assimilar esses compostos e as amidas voltam a predominar entre os compostos nitrogenados transportados (Pate et al., 1980; Amarante et al., 2006a).

Inter-relação entre metabolismo de Nitrogênio e Carbono

O processo de assimilação de N não constitui uma cadeia linear e independente de reações que originam os aminoácidos. Existe uma inter-relação complexa com o metabolismo de C que, além de servir para produção de carboidratos, é requerido para obtenção de energia e esqueletos de C que são utilizados durante a assimilação de N, como visto anteriormente com -KG e OAA. Por esse motivo tanto os níveis de carboidratos podem interferir na produção de aminoácidos de transporte e armazenamento, como estes podem influenciar no metabolismo dos carboidratos. A regulação de enzimas chaves no metabolismo de N, por exemplo, pode ser realizada por carboidratos que estimulam enzimas como GS e inibem AS (Lam et al., 1996). Em tomate o NO3- pode estimular a produção de ácidos orgânicos e reprimir a formação de amido (Scheible et al., 1997) e alguns ácidos orgânicos, inclusive, são responsáveis por induzir a expressão e atividade da NR e regular a GOGAT (Sttit et al., 2002; Müller et al., 2001; Ferrario-Méry et al., 2001). No caso de hipóxia radicular também foi demonstrada a relação entre o metabolismo de alanina (Ala) e alguns ácidos orgânicos produzidos na raiz de modo a promover tolerância da planta durante o período de estresse (Rocha et al., 2010). Dessa forma fica evidente a importância dessa inter-relação entre o metabolismo de N e C. Contudo os trabalhos citados lidam em sua maioria com quantidades baixas de N para testar os efeitos de sua deficiência no metabolismo. Ainda é escasso o número de trabalhos que abordam a ausência completa de N do meio nutritivo para verificar o que esse estresse severo implicaria no transporte desses ácidos orgânicos via xilema e na regulação do metabolismo de N da planta.

Transporte de compostos no xilema

O sistema vascular das plantas exerce a importante função de transportar diversos compostos com a finalidade de distribuir nutrientes e íons inorgânicos para reserva e

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metabolismo nos diversos órgãos e tecidos da planta. Compostos importantes resultantes da assimilação de N, como Asn, são abundantemente transportados pelo xilema de plantas de soja (Puiatti e Sodek, 1999), assim como o nitrato que pode ser transportado para ser reduzido nas folhas (Oliveira et al., 2013a). Além dos nutrientes também são transportadas moléculas sinalizadoras, como o próprio nitrato, e hormônios relacionados a diversos tipos de estresse (Marchner, 1995; Schashtman e Goodger, 2008). A composição da seiva do xilema entre a raiz e a parte aérea pode refletir mudanças metabólicas na raiz provocadas por situações de estresse ou alterações nutricionais da planta (Amarante e Sodek, 2006). O transporte de elevadas quantidades de Ala no xilema, por exemplo, é reflexo de uma alteração metabólica importante em resposta ao alagamento do sistema radicular (estresse de hipóxia) que leva ao acúmulo de Ala na raiz (Sousa e Sodek, 2003). O teor de Gln na seiva do xilema é resultado da fixação de N2 no nódulo em leguminosas (Amarante e Sodek, 2006a; Justino e Sodek, 2013), enquanto que a relação Asp e Asn é reflexo de alteração da enzima AS na raiz e no nódulo em condições de estresse de N (Lima e Sodek, 2003; Antunes et al., 2008). Os ácidos orgânicos formam outro grupo importante de compostos transportados no xilema, porém apenas recentemente estudos revelaram possíveis funções biológicas atribuídas a esses compostos. Como revisado por Schashtman e Goodger (2008) os ácidos orgânicos foram relacionados ao transporte de metais pesados e à tolerância ao estresse hídrico, além de melhorar a captação de P e a tolerância ao Al (Schulze et al., 2002). A produção de ácidos orgânicos na raiz foi relacionada à tolerância ao Mn (Chen et al., 2015) e ao estresse de hipóxia (Rocha et al., 2010). Contudo ainda é necessário mais estudo para confirmar a importância do papel fisiológico desses compostos e principalmente verificar seu transporte no xilema e possível função na sinalização e comunicação entre raiz e parte aérea durante situações de estresse sofridas pela raiz.

Reciclagem de N nas plantas

O transporte de compostos via xilema e floema é fundamental para que ocorra a reciclagem de N nas plantas. Já citamos que o NO3- captado pode ser assimilado na raiz ou folha (Peuke et al., 1996; Oliveira et al., 2013a), no entanto, os produtos da assimilação não se restringem ao tecido onde foram assimilados. Asn, um dos principais produtos da assimilação, é um aminoácido conhecido por sua função de transporte (Lea et al., 2007), ou seja, os compostos que incorporam N circulam pela planta até atingirem um tecido que requer sua utilização para produção de outros aminoácidos. Ainda, a reciclagem de N envolve a

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remobilização de N de estruturas celulares complexas já existentes, o que ocorre geralmente em folhas senescentes, para tecidos em crescimento ou drenos. Neste caso proteínas celulares são quebradas em compostos menores e menos complexos para serem transportados via floema a outros órgãos, como folhas jovens, grãos ou raízes. A maior contribuição de proteínas remobilizadas provém de cloroplastos e a Rubisco contribui com importante fração dentre as proteínas hidrolisadas (Gregersen et al., 2008; Avila-Ospina et al., 2014). O processo de senecência e remobilização de N se trata de um evento muito complexo, no qual estruturas celulares importantes como cloroplastos são desmanteladas, enquanto toda uma maquinaria celular deve ser mantida intacta orquestrando o processo que é controlado por uma rede de genes e compostos necessários para a reciclagem do N. Os ácidos orgânicos também são bastante relevantes nesse processo e constituem esqueletos de C para remobilização de N, além de fonte de energia para o TCA nas mitocôndrias em um momento em que os cloroplastos estão prejudicados. Glu, que utiliza -KG como esqueleto de C, é o principal aminoácido transportado no floema durante a remobilização de N (Forde e Lea, 2007; Gregersen et al., 2008). O processo de senecência pode ser desencadeado por estresses bióticos e abióticos, entre eles seca, alagamento e deficiência de nutrientes como N (Avice e Etiene, 2014; Avila-Ospina et al., 2014).

Papel fisiológico do Malato

O malato é um ácido orgânico intermediário no ciclo de Krebs, importante para alimentá-lo, e responsável por fornecer energia para célula e está presente em diversos tecidos e órgãos da planta. Em plantas com metabolismo C4 e CAM é bem conhecido por ser a molécula de estoque do CO2 (Chefflings et al., 1997). Em frutos é o principal constituinte dos ácidos orgânicos que conferem sua acidez e por isso desempenha papel importante no processo de maturação (Sweetman et al., 2009; Centeno et al., 2011). Um aspecto importante das funções do malato para este trabalho é sua relação íntima com o metabolismo de N. Esse ácido orgânico executa a função de equilibrar cargas durante a captação de NO3- (Kirkby e Knight, 1977) e também participa como contra-íon na captação e transporte de cátions e manutenção do pH na célula durante assimilação de N (Stumpf e Burris, 1981; Van Beusichem et al., 1988; Touraine et al., 1992). O malato é uma molécula muito versátil e desempenha papéis fisiológicos importantes. Como equivalente de redução contribui para fornecimento de NADH para organelas através da oxidação a OAA, na folha atua como regulador osmótico controlando o fechamento estomático (revisado por Martinoia e Rentsch

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1994). Ainda, o transporte de malato, Glu e -KG entre organelas celulares já foi relacionado à regulação da assimilação de N (Martinoia e Rentsch 1994, Taniguchi e Miyake, 2012).

Há fortes indícios, portanto, de que os ácidos orgânicos possam desempenhar importante papel na assimilação e reciclagem de N pela planta. No presente trabalho estudou-se o transporte de ácidos orgânicos, principalmente do malato, no xilema de plantas de soja submetidas a dois tipos de estresse: ausência de fonte de N no meio e deficiência de O2 na solução. As duas condições apresentam respostas características em relação ao tipo do estresse, mas a captação e assimilação de N prejudicadas são comuns a ambas as situações e poderiam desencadear o aumento do transporte dos ácidos orgânicos. A hipótese de trabalho formulada é a de que a reciclagem de N e ácidos orgânicos estaria relacionada com o metabolismo dos principais aminoácidos providos pelo floema: Asp e Glu. Dessa forma, quando a raiz está em uma condição de insuficiência de N o fornecimento desses aminoácidos via floema resultaria na formação de ácidos orgânicos como co-produtos resultantes de transaminações necessárias para produção dos demais aminoácidos. Os ácidos orgânicos seriam reciclados via xilema para a parte aérea onde seriam transformados novamente em aminoácidos via reações de transaminação e reenviados via floema à raiz, assim completando o ciclo. Quando a assimilação de N estiver ativa na raiz esses aminoácidos do floema servirão principalmente como precursores de Gln e Asn e, portanto, a produção e transporte de ácidos orgânicos serão bem menores. O estado nutricional da raiz poderia então determinar a intensidade com que estes aminoácidos vindos do floema seriam metabolizados via transaminação para suprir o órgão com todos os aminoácidos necessários e desta forma influir na composição dos compostos orgânicos (aminoácidos e ácidos orgânicos) encontrados no xilema. O malato, juntamente com Asp e Glu, são compostos com potencial de sinalização para percepção do status de N da planta entre raiz e parte aérea.

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OBJETIVOS GERAIS

 Compreender a inter-relação entre o metabolismo de N e C em plantas de soja sob dois diferentes tipos de estresse na raiz: deficiência de N e hipóxia radicular.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Verificar alterações no perfil de composição dos aminoácidos e ácidos orgânicos transportados na seiva do xilema e presentes na raiz e nas folhas nas condições de estresse citadas em plantas de soja.

 Utilizar aminoácidos marcados para elucidar a origem dos elevados níveis de malato transportados no xilema durante as situações de estresse aqui estudadas.

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CAPÍTULO I: OS ALTOS NÍVEIS DE MALATO TRANSPORTADO NO XILEMA DE SOJA SOB DEFICIÊNCIA SEVERA DE NITROGÊNIO SÃO ORIGINADOS DO METABOLISMO DOS AMINOÁCIDOS PROVINDOS DO FLOEMA.

Introdução

O tecido vascular do xilema nas plantas é responsável pelo transporte de água e nutrientes captados pela raiz para a parte aérea. Metabólitos produzidos na raiz como produtos da assimilação ou reciclagem de N também são transportados via seiva do xilema. Isso pode incluir o envio de moléculas a partir da parte aérea para a raiz via floema que são metabolizadas e retornam para as folhas. Outra classe de compostos transportada é de hormônios e outras moléculas que desempenham papel importante da sinalização entre raiz e parte aérea, principalmente em situações de estresse como a seca, entre outras ( Schashtman e Goodger, 2008)

Em se tratando da soja e outras leguminosas a composição de compostos nitrogenados no xilema é alvo de muitos estudos, principalmente no que concerne à nutrição de N. Uma vez que essas plantas podem se encontrar noduladas, em função de uma associação simbiótica com bactérias fixadoras de N2, podem ser cultivadas sob completa ausência de N mineral em seu meio. Isso pois, são totalmente dependentes do N2 atmosférico como única fonte de N. Plantas não noduladas podem ser cultivadas com NO3- normalmente. Sendo assim é possível o estudo de duas formas diferentes de aquisição de N utilizando a mesma planta: fixação de N2 e assimilação de NO3-. Os compostos nitrogenados transportados no xilema dessas plantas apresentam composição bastante diferente em relação à fonte de N (Amarante et al., 2006a).

Em soja, por exemplo, plantas simbióticas transportam predominantemente ureídeos (alantoína e ácido alantóico) junto com uma quantidade menor de aminoácidos (principalmente Asn e Gln), enquanto plantas não noduladas nutridas com nitrato transportam principalmente o próprio nitrato e aminoácidos (em sua maior parte Asn) e muito pouco de ureídeos (Matsumoto et al., 1977; McClure e Israel, 1979; Streeter, 1979; Lima e Sodek, 2003; Dakora, 2000). Ao cultivar uma planta nodulada com nitrato a fixação de N2 é inibida e a composição do xilema é alterada de acordo com a encontrada em plantas não noduladas também cultivadas com nitrato. (Pate et al., 1980; Amarante et al., 2006a). O perfil de composição de aminoácidos tanto de plantas noduladas quanto das não noduladas pode ser

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alterado de acordo com diferentes situações de estresse, como deficiência de N, P or K (Sung et al., 2015). Sob estresse de N, por exemplo, ocorre uma drástica redução de Asn acompanhada de aumento de Asp (Lima e Sodek, 2003; Amarante et al., 2006; Antunes et al., 2008).

Ácidos orgânicos são encontrados na seiva do xilema de várias plantas (Kirkby e Armstrong, 1980; Cramer et al., 2005; Sung et al., 2015) inclusive em soja, em que malato e citrato se destacam (Krishnan et al., 2011). Além da sua participação no balanço de cargas (Kirkby e Armstrong, 1980; Israel e Jackson, 1982), os ácidos orgânicos parecem ser importantes no transporte no xilema de íons metálicos como Ca e Mg (Schell, 1997), Zn, Ni e Cu (Rauser, 1999; Sagardoy et al., 2011) e Fe (Alam et al., 2001; Lopes-Millan et al., 2009), o que envolve a propriedade como quelante dos ácidos orgânicos. A mesma característica também envolve o transporte de metais tóxicos como Cd (Wei et al., 2007) e Al (Watanabe e Osaki, 2002; Morita et al., 2004; Morita et al., 2008). No geral, a presença desses metais em altas concentrações na raiz leva ao aumento do nível dos ácidos orgânicos no xilema. Outro papel dos ácidos orgânicos na seiva do xilema é sua participação na tolerância de mecanismo contra o déficit hídrico. Neste caso um aumento do malato atua como sinal do estresse e participa no controle do fechamento estomático (Patonnier et al., 1999; Schachtman e Goodger, 2008; Fernie e Martinoia, 2009) provavelmente mediante um efeito do pH envolvendo ácido abscísico (Davies et al., 2005; Schachtman e Goodger, 2008).

Em mamona (Kirkby e Armstrong, 1980; Peuke et al., 1996) e tomate (Sung et al., 2015) altos níveis de ácidos orgânicos (malato e citrato) foram relatados no xilema de plantas sob baixo N sugerindo uma relação entre tais ácidos e o metabolismo de N nas raízes. Essa relação provavelmente envolve a circulação de K+ na planta (Kirkby e Armstrong, 1980). Sob suficiência de NO3- os íons captados pela raiz são transportados no xilema até a parte aérea junto com K+ (Ben Zioni et al., 1977; Kirkby e Armstrong, 1980; van Beusichem et al., 1988; Touraine et al., 1988), enquanto que sob baixos níveis de NO3- ácidos orgânicos tais como malato podem aumentar para substituir o NO3- como contra ion para K+ neste processo (Kirkby e Armstrong, 1980). O aumento da produção de malato na raiz sob baixo N pode resultar da troca do local de redução do NO3- que ocorre predominantemente nas folhas para a raiz (Kirkby e Knight, 1977; Martinoia e Rentch, 1994; Peuke et al., 1996; Wilkinson e Davies, 2002; Wilkinson et al., 2007). Está bem estabelecido que a síntese de malato acompanha a redução de NO3- para neutralizar os íons OH- formados na reação (Stitt et al., 2002).

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A clara associação da produção de malato com a redução de NO3- levanta a questão se o malato ou outros ácidos orgânicos poderiam ser produzidos na raiz e transportados no xilema em resposta a completa falta de NO3- no meio. Para responder a essa questão utilizamos plantas de soja noduladas e não noduladas, as primeiras cultivadas em um meio sem fonte de N e as últimas em solução de NO3- e posteriormente transferidas para um meio livre de N. Altos níveis de malato foram de fato encontrados na seiva do xilema de todas as plantas cultivadas sem N na solução nutritiva o que nos motivou a investigar a sua fonte. É sugerido que o metabolismo de aminoácidos proveniente do floema para as raízes pode originar os altos níveis de malato encontrado no xilema de plantas sujeitas a um estresse severo de deficiência de N.

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Objetivo Geral

Avaliar o efeito do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos transportados no xilema das plantas e elucidar suas origens.

Objetivos específicos

 Verificar os aminoácidos e ácidos orgânicos transportados no xilema em função do estresse de N na raiz.

 Comparar o transporte de aminoácidos e ácidos orgânicos em plantas cuja fonte de N é endógena (plantas noduladas e plântulas com cotilédones) e não oriunda de N externo captado pela raiz.

 Examinar o efeito de nutrição foliar com ureia como fonte de N para plantas deficientes em N nas raízes.

 Determinar os aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na raiz e na folha em função da deficiência de N.

 Prover as plantas com Asp marcado para verificar a hipótese da origem do malato a partir deste aminoácido.

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Materiais e métodos

Cultivo das plantas

Sementes de soja (Glycine max (L.) cv. IAC-23) foram germinadas em bandejas com vermiculita em casa de vegetação e após emergência da folha primária as plântulas foram transferidas para vasos de 1L (uma planta por vaso) com vermiculita. Os vasos de plantas não inoculadas (não noduladas) foram regados com 100 mL de solução completa (15 mM de NO3 -) de Hoagland e Arnon (1950-), duas vezes por semana e com água quando necessário. As plantas noduladas foram regadas com solução de Hoagland e Arnon (1950) sem N. Plantas no estádio de desenvolvimento V5 (4 trifólios abertos- Fehr et al., 1971) foram usadas nos experimentos.

Cultivo de rizóbios

Os rizóbios utilizados neste trabalho foram os da espécie Bradyrhizobium elkanii, estirpe SEMIA 5019 (SMS 463), os quais foram replicados e mantidos em meios de cultura segundo método proposto por Norris e Date (1976), com pH 6,8 - 7,0. Os meios foram preparados utilizando os seguintes reagentes: K2HPO4 (0,5 g.L-1), MgSO4.7H2O (0,8 g.L-1), NaCl (0,1 g.L-1), FeCl3.6H2O (0,01 g.L-1), extrato de levedura (0,8 g.L-1), manitol (10 g.L-1) e 5 mL de azul de bromotimol a 0,5% (p/v) em metanol. O meio sólido foi obtido adicionando-se 15 g.L-1 de ágar ao meio líquido.

Após serem autoclavados a 120ºC por 20 minutos, os meios foram inoculados em câmara de fluxo laminar e incubados à temperatura ambiente em torno de 28-30ºC. Os tubos com meio sólido foram mantidos em repouso e os frascos com meio líquido, após terem sido inoculados, foram incubados sob agitação por um período de 3 a 4 dias, quando a suspensão de bactérias atingiu uma quantidade em torno de 109 células viáveis.mL-1 (UFC - unidades formadoras de colônias). Para inoculação nas plantas foram utilizados os meios de cultura líquidos, os quais foram diluídos 10 vezes com água destilada, antes de serem aplicados.

Tratamentos

As plantas no estádio V5 foram transferidas para hidroponia em solução completa (1/3) de Hoagland e Arnon (1950) durante três a sete dias de aclimatação antes de iniciar os experimentos. Foram utilizados vasos de aproximadamente 3 L contendo três plantas por

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vaso. Cada repetição analisada constitui um pool dessas três plantas por vaso e foi obtido um mínimo de três amostras por tratamento. Após o período de aclimatação foram iniciados os tratamentos: ausência de N na solução (-N), NO3- (5 mM) na solução (+N) e NH4+ (5 mM). Também foram realizados tratamentos de recuperação em que plantas tratadas com NO3- (5 mM) foram transferidas para solução livre de N (+N-N) e vice-versa (-N+N). Para os tratamentos foi utilizada solução sem N de Hoagland e Arnon acrescidas de KNO3 (5mM) ou (NH4)2SO4 (2,5 mM). Adicionalmente foi realizado experimento de nutrição foliar com ureia e outro experimento com plântulas no estádio V1/V2 que serão melhor descritos a seguir. A aeração foi mantida durante todo o experimento com o auxílio de um compressor de ar.

As plantas noduladas foram também utilizadas no estádio V5, contudo não foram realizados experimentos em hidroponia com essas plantas. Isso pois, a manutenção do sistema radicular com os nódulos submersos na solução, mesmo com aeração, interfere na atividade da nitrogenase (Lima e Sodek, 2003). Dessa forma os tratamentos de ausência de N na solução (-N) e NO3- na solução (5 mM) (+N) foram aplicados nas plantas em vermiculita. Neste caso também foram realizados tratamentos de recuperação em que plantas tratadas com NO3- (5 mM) foram transferidas para solução livre de N (+N-N). Para mudança de meio nutricional os vasos foram mergulhados rapidamente em água por uma vez e em seguida na solução nutritiva correspondente ao seu tratamento por mais três vezes. Após esse procedimento as plantas eram regularmente regadas com sua respectiva solução até o fim do tratamento.

Experimentonutrição foliar com ureia

Foram utilizadas plantas de soja não noduladas no estádio V5 em solução de Hoagland e Arnon (1950) (1/3) livre de N. As plantas foram pulverizadas com solução de ureia (50 mM) de maneira uniforme de modo a saturar todas as folhas da planta com a solução. Foram realizados testes com diferentes concentrações de ureia para avaliar qual a maior concentração utilizada que não causaria danos foliares como queimaduras, por exemplo. A pulverização foi realizada diariamente durante o experimento no fim da tarde (16:00h). Foi adicionado o detergente Triton X-100 (0,01%), como surfactante, para otimizar a absorção da solução pela folha. Controles utilizando somente água e o surfactante foram realizados (Poole et al., 1983; Afza et al., 1987).

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Experimento com plântulas com cotilédones verdes

Plântulas de soja no estádio V1/V2 cujos cotilédones se encontravam ainda verdes foram transferidas para hidroponia em solução de Hoagland e Arnon (1950) (1/3) sem N durante três a quatro dias de aclimatação antes de iniciarmos os experimentos. Foram utilizados vasos de aproximadamente 3 L contendo três plântulas por vaso. Cada amostra analisada constitui um pool dessas três plantas por vaso. Após o período de aclimatação foram iniciados os tratamentos +N e -N com solução deficiente em N de Hoagland e Arnon acrescidas de KNO3 (5 mM) quando necessário. A aeração foi mantida durante todo o experimento com o auxílio de um compressor de ar.

Coleta da seiva do xilema

A coleta da seiva do xilema foi realizada no período entre 11:00h e 13:00h, com plantas previamente irrigadas, de acordo com McClure e Israel (1979). No caso das plantas em hidroponia a solução foi trocada por uma nova entre 24 e 36 h antes do início da coleta de seiva. O caule foi seccionado com um bisturi logo abaixo do nó cotiledonar e o local cortado foi lavado, com água destilada, e enxugado com papel filtro. Em seguida o exsudado foi coletado, através de tubos capilares, e transferido para eppendorfs mantidos no gelo. Após a coleta os frascos foram armazenados a -20°C, para as análises posteriores.

Coleta da seiva do floema

A seiva do floema foi coletada segundo método proposto por Neo e Layzell, (1997). As plantas foram seccionadas da mesma maneira descrita para a coleta do xilema. Neste caso, a parte aérea era o material vegetal de interesse. A parte aérea seccionada era borrifada com água destilada, coberta com sacos plásticos pretos e colocada em recipiente contendo solução de EDTA a 5 mM preparada em tampão de fosfato de sódio (NaH2PO4/Na2HPO4) a 5 mM, pH = 6,0 onde os caules foram novamente seccionados, em região imersa neste tampão. Imediatamente as plantas foram transferidas para tubos (tipo “falcon”) com capacidade de 13 mL, de modo que a porção cortada dos caules ficava imersa em 5 mL do tampão. Os tubos com a parte aérea das plantas foram imediatamente armazenados no escuro em câmaras com temperatura constante de 22°C, com elevada umidade durante 3 horas. Decorridas as 3 horas a parte aérea foi descartada, os tubos foram coletados e armazenados em freezer -20°C até as análises. Para as análises a solução coletada

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foi concentrada e levemente acidificada com HCl a 0,1 M (1:10), congelada e descongelada para a precipitação do EDTA (Muller e Touriane, 1992).

Coleta da raiz

A coleta da raiz foi realizada no período entre 11:00h e 16:00h depois das plantas serem submetidas aos tratamentos de interesse. As raízes foram lavadas com água destilada e em seguida “secas” em papel absorvente para retirar o excesso de água e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -20°C. Posteriormente foram maceradas e liofilizadas. Uma alíquota foi retirada e utilizada para extração.

Coleta dos nódulos

Para a coleta dos nódulos, depois das plantas serem submetidas aos tratamentos, as raízes foram lavadas para a retirada da vermiculita em água de torneira, logo em seguida em água destilada e imediatamente imersas em banho de gelo, em recipiente contendo gelo e água destilada. Em seguida, os nódulos foram destacados do sistema radicular, nódulos (e raiz) foram “secos” em papel absorvente para retirar o excesso de água e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -20°C até a extração.

Coleta das folhas

As folhas das plantas (V5) foram divididas em três grupos de acordo com o nó em que se encontravam: V2/V3 para o segundo e terceiro nós (folhas velhas), V4/V5 para o quarto e quinto (folhas do meio expandidas) e V6/V7 para o sexto e sétimo nós (folhas jovens ainda em expansão). A coleta das folhas foi realizada no período entre 11:00h e 16:00h depois das plantas serem submetidas aos tratamentos de interesse. As folhas foram lavadas com água e em seguida “secas” em papel absorvente para retirar o excesso de água e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -20°C. Posteriormente foram maceradas e liofilizadas. Uma alíquota foi retirada e utilizadas para extração com MCW.

Extração em MCW

Uma alíquota de 0,1g de massa seca (MS) ou 1g de massa fresca (MF) foi retirada do tecido coletado e macerado e a extração realizada em 10 mL de MCW

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(metanol:clorofórmio:água - 12:5:3 v/v/v) durante toda a noite em agitador. Após esse tempo os tubos foram centrifugados por 20 minutos e em seguida 8 mL desse extrato foram retirados (o volume restante foi medido e descartado) e adicionados 3 mL de água e 2 mL de clorofórmio. Os tubos foram agitados e deixados em repouso. Em seguida os tubos foram centrifugados durante 10 minutos para separação de fases. Aproximadamente 8 mL foram coletados da porção aquosa (fase superior) e a fase clorofórmica (inferior) foi descartada. Para concentrar o extrato e remover resíduo de clorofórmio o extrato foi mantido em banho-maria a 40°C por toda a noite perdendo cerca de 20 a 25% do volume inicial. Posteriormente as amostras foram retiradas do banho, e os tubos em que estavam contidas foram vedados e armazenados em freezer -20°C até as análises. No extrato MCW foram analisados aminoácidos e ácidos orgânicos.

Marcação com 13C utilizando plantas intactas

O experimento com aminoácido marcado foi realizado em plantas intactas com o objetivo de detectar compostos marcados transportados no xilema. Plantas em hidroponia (V4) foram previamente submetidas ao tratamento -N por 48 h e posteriormente transferidas para uma solução nova com adição de Asp-4-C-13C (99 atomo %) (1 mM) + cloranfenicol (50

M). Controles foram mantidos em solução +N (KNO3 5 mM) e igualmente transferidas para solução nova contendo Asp-4-C-13C (1 mM). Após 24 h a seiva do xilema destas plantas foi coletada como já descrito anteriormente. As amostras foram analisadas em GCMS conforme descrito a seguir.

Análises de aminoácidos por HPLC

A separação e análise de aminoácidos foram conduzidas com base no sistema OPA (o-ftaldialdeídeo) (Jarrett et al., 1986) conforme modificado no nosso laboratório (Puiatti e Sodek, 1999). De acordo com este método, os aminoácidos são primeiro transformados nos respectivos derivados OPA e separados em seguida por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). A concentração de aminoácidos (totais) foi ajustada para a faixa de 0,2 a 1,0 mol.mL-1 através de diluição com água. Para quantificação dos aminoácidos foi utilizado padrão (Sigma AA18) na concentração de 50 nmol.mL-1. Uma alíquota de 20 L de cada amostra é misturada com 60 L do reagente OPA (50 mg de OPA dissolvidos inicialmente em 1 mL de metanol, depois acrescidos de 6,5 mL de tampão

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borato-NaOH pH 9,5 e, no dia de uso, mais 10L.mL-1 de 2-mercaptoetanol). Após 2 min de reação com OPA, uma alíquota de 10 L foi injetada na coluna do HPLC. A coluna (ODS-2 Superpac, tipo C18, 250 x 4,6 mm) foi eluída, com fluxo de 0,8 mL/min por um gradiente formado por quantidades crescentes de metanol 65% (= B) em relação ao tampão fosfato pH 7,2 (= A – Na2HPO4 50 mM, NaOAc 50 mM, HAc 1,5 mL, tetrahidrofurano 20 mL e metanol 20 mL em 1 litro de água). O gradiente foi programado para aumentar a proporção de B em relação a A de 20 a 58% nos primeiros 35 min, seguido por um aumento de 58 a 75% durante o período de 35 a 40 min. e finalmente de 75 a 100% de 40 a 60 min.

A saída da coluna foi monitorada por um detector de fluorescência (Shimadzu modelo 10AXL) ajustado em 265 nm (luz de excitação) e 450 nm (luz de emissão). O sinal do monitor foi processado por um registrador/integrador (CROMATOPAC C-R6A, Shimadzu).

Análise de ácidos orgânicos por GC-MS

A técnica para a derivatização dos ácidos orgânicos seguida pela separação e análise no GCMS foi baseada no mesmo método usado para aminoácidos descrito por Godber e Parsons (1998). De acordo com este procedimento, as amostras são secas em microtubos eppendorf por evaporação sob jato de N2 e retomadas em 30 L de piridina (Merck, super seco). Quando se tratava de amostras de seiva do xilema, foi em seguida adicionado 100 L de HCl 0,1 M e a amostra seca novamente (procedimento necessário para evitar interferência de uma substância desconhecida – possivelmente bicarbonato (Silvester et al., 1996) – no processo de derivatização). Para transformar os ácidos orgânicos nos derivados tert-butildimetilsilil (tBDMS) adicionou-se 30 L N-metil-N (tert-butildimetilsilil) trifluoracetamida (MTBSTFA). Em seguida o tubo foi fechado e aquecido em banho seco a 70°C por 30 min. Após esfriar a temperatura ambiente o conteúdo foi transferido para “inserts” de 100 L e inseridos em frascos apropriados para análise no GCMS.

A análise por GCMS foi conduzida utilizando o sistema de cromatografia gasosa, da marca Shimadzu, modelo 2010A acoplada ao espectrômetro de massas quadrupolo modelo QP2010. O sistema de cromatografia gasosa é equipado com uma coluna capilar DB5 com as dimensões 30 m x 0,32 mm (granulação 0,25 m). Os ácidos orgânicos foram separados em gradiente de temperatura de 100 a 300°C com taxa de aumento de 6°C.min-1, usando hélio como gás de arraste (fluxo de 45 cm.s-1). As temperaturas do injetor, forno da coluna e interface do GCMS foram 290°C, 100°C e 250°C respectivamente. A fonte de íons foi

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mantida a 200°C. Os espectra de massa são registrados por impacto de eletros (EI) em 70 eV utilizando o modo SIM (valores m/z específicos dos fragmentos de cada ácido orgânico). Os valores m/z foram estabelecidos após testes preliminares com padrões de ácidos orgânicos e correspondem ao principal fragmento M-57. O detector foi configurado para medir este fragmento mais o valor M+1 (massa do fragmento mais 1). Até o momento o método foi configurado para os seguintes ácidos orgânicos: lactato, piruvato, succinato, fumarato, malato, oxalaocetato, -KG e citrato. Os picos foram identificados por seu espectra de massas e tempo de retenção e quantificados pela sua área em relação à área do padrão (mistura de padrões com 20 nmol de cada componente).

Análise dos compostos marcados por GCMS

O grau de enriquecimento em 13C para cada componente foi calculado pela relação (M+1):M do fragmento M-57 empregando a fórmula (Godber e Parsons, 1998):

%enriquecimento = 100 x (Re – Rc)/[1 + (Re – Rc)], na qual Re e Rc são a relação de

massa (M+1)/M da amostra marcada e controle não-marcada, respectivamente.

Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise de variância e, nos casos significativos, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, pelo uso do software estatístico VARPC, desenvolvido pelo professor e orientador deste trabalho, Dr. Ladaslav Sodek, do Departamento de Biologia Vegetal do Instituto do Biologia, da Universidade Estadual de Campinas.

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Resultados

Influência do estado nutricional da raiz de soja na composição de aminoácidos e ácidos orgânicos presentes na seiva do xilema

Com o intuito de testar a nossa hipótese de inter-relação entre o metabolismo de aminoácidos e ácidos orgânicos durante a situação de déficit na captação e assimilação de nitrogênio, plantas de soja não noduladas cultivadas em solução de KNO3 (5 mM) foram transferidas para solução sem fonte de N por até oito dias. Plantas controle foram mantidas em solução de NO3-. Nestes controles a captação e assimilação de N estão ativos e a planta se encontra em um estado de suficiência de N, o oposto do que ocorre nas plantas sem fonte de N na solução, nas quais a captação e assimilação de N na raiz estão inativos. Ao analisarmos a seiva do xilema das plantas controle dia zero (D0) cultivadas com NO3- (Figura 1) observamos em sua composição de aminoácidos uma maior porcentagem de Asn (84,9%), seguida de Gln (4,1%). Essa predominância de Asn na seiva do xilema de soja cultivada na presença do NO3- já é conhecida e está de acordo com dados da literatura (McClure e Isarael, 1979; Puiatti e Sodek, 1999; Lima e Sodek, 2003). As plantas deficientes em N apresentam redução dessa porcentagem de Asn, após quatro dias de tratamento (65%), e aumento de Asp que passa a ser o segundo aminoácido mais abundante (13,5%). Essa redução do nível de Asn foi gradual ao longo dos oito dias de experimento e ocorreu juntamente com a redução do nível de aminoácidos totais. Em relação à composição de aminoácidos no xilema ao longo dos 8 dias do experimento as plantas com NO3- (Ctrl, 4,6 e 8 dias) apresentaram o perfil esperado de maior porcentagem de Asn (~80%), com pouca variação. Para dar maior suporte aos dados plantas que haviam sido transferidas para solução sem N por quatro dias voltaram para solução contendo NO3- por até maisquatro dias a fim de recuperar seu estado de assimilação e metabolização de N. Já nos dois primeiros dias constatamos a recuperação do perfil de composição de aminoácidos nessas plantas, assim como o nível de aminoácidos totais. Esses dados indicam que as alterações do perfil foram de fato causadas pela falta de N na solução. Ademais de modo bastante interessante foi observado um aumento de Asp nas plantas insuficientes em nitrato, acompanhado de uma redução dos níveis de Asn, o que fica bem evidente na figura 2.

Em se tratando dos ácidos orgânicos podemos observar que seus níveis tendem a aumentar na seiva do xilema nas plantas deficientes em N (Figura 3), ao contrário do que ocorre com os aminoácidos. Nessas plantas tratadas com solução –N os níveis da maioria dos

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ácidos orgânicos se encontram mais elevados, principalmente do malato, que apresenta maior quantidade dentre os ácidos orgânicos analisados. As plantas que retornaram para a solução contendo NO3- por até quatro dias tiveram seus níveis de ácidos orgânicos reduzidos rapidamente, sendo comparáveis aos níveis de plantas tratadas com NO3- durante todo o período do experimento. Também fica evidente que no oitavo dia de tratamento as plantas sem N já têm seus níveis de ácidos orgânicos bastante reduzidos, assim como ocorre com os aminoácidos totais, mas ainda superiores aos de plantas com NO3-.

Figura 1: Perfil de composição de aminoácidos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. O Ctrl 0 corresponde a plantas cultivadas em solução de NO-3 (5 mM). Estas plantas foram

submetidas ao tratamento com solução sem N (-N) durante quatro dias (4D) e posteriormente com solução de NO-3 (5 mM) (+N) por mais dois (2D) ou quatro dias para recuperação. Plantas controle foram tratadas com

solução de NO-3 (5 mM) e ausência de N por até oito dias (8D). Cada repetição foi constituída por um pool de

três plantas (n=3). O asterisco(*) indica diferença significativa entre o tratamento -N e os controles de acordo com teste Tukey (p5%, n=5).

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Figura 2: Níveis dos aminoácidos Asp e Asn na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. As plantas foram tratadas com solução sem N (-N) durante quatro dias e posteriormente com

solução de NO3-(5 mM) (+N) por mais dois ou quatro dias. Plantas controle foram tratadas com solução de NO3

-(5 mM) e ausência de N por até oito dias. Cada repetiçãofoi constituída por um pool de três plantas. As barras indicam o EP (n=3).

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Figura 3: Composição de ácidos orgânicos na seiva do xilema de plantas de soja não noduladas sob deficiência de N. O controle dia 0 corresponde a plantas cultivadas em solução de NO-3 (5 mM). Estas plantas

foram submetidas ao tratamento com solução sem N durante (-N) durante quatro dias e posteriormente com solução de NO3-(5 mM) (+N) por mais dois ou quatro dias. Plantas controle foram tratadas com solução de NO3

(5 mM) e ausência de N por até oito dias. Cada amostra foi constituída por um pool de três plantas. As barras indicam o EP (n=3).

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A seiva do floema de plantas de soja cultivadas com NO3- e sem N por até quatro dias também foi examinada e mostra a predominância de Asp, no perfil de composição dos aminoácidos constituindo cerca de 30% da seiva, seguida de Glu (~28%) (Tabela I). Após dois dias de tratamento sem N ainda prevalece essa composição. Após o quarto dia foi possível constatar alterações como a predominância de Glu e redução significativa de Asp. Mas os resultados indicam que durante a situação de estresse na qual há ausência de captação de N a principal fonte de N para a raiz parece provir da parte aérea na forma de Asp e Glu.

Tabela I: Perfil de composição de aminoácidos presentes no floema de plantas de soja não-noduladas sob deficiência de N. As plantas foram tratadas com solução sem N (-N) por até quatro dias e plantas controle com

solução de NO-3 (5 mM) (+N) . Cada amostra foi constituída por um pool de duas plantas (n=3).

AA Ctrl +N D0 2D+N 2D-N 4D+N 4D-N Asp 33,6 31,2 27,5 30,5 10,5 Glu 28,8 28,1 22,4 24,2 19,9 Asn 13,8 19,1 13,0 16,3 8,9 Ser 9,6 8,1 8,6 9,0 12,7 Gln 0,0 0,0 0,0 1,2 0,0 Ala 1,7 1,6 1,0 2,0 16,8 Gaba 1,8 1,8 1,6 7,3 15,2 Outros 10,8 10,2 26,0 9,5 16,1 (mol%)