Culturas Celulares

Para os estudos in vitro realizados no âmbito deste trabalho foram efectuadas culturas das linhas celulares obtidas na American Type Culture Collection, descongeladas e propagadas após a recepção. As linhas celulares resultam da selecção, de culturas primárias, de clones capazes de sobreviver e de se multiplicarem indefinidamente. Estes clones (qualquer população de células descendentes de uma célula única ancestral) originam linhas celulares diplóides ou aneuplóides. As linhas diplóides apresentam mais de 75% das células diplóides, resistem a 30-50 gerações, são sensíveis para o isolamento de vírus e podem ser usadas na preparação de vacinas. As linhas aneuplóides ou linhas contínuas apresentam um cariótipo aneuplóide (o número de cromossomas  2n), podem derivar de tecidos neoplásicos ou de células normais mutadas e são úteis para diagnóstico, isolamento e propagação de vírus. Os fibroblastos, tipo de células predominante no organismo humano, podem sobreviver até 50 gerações. As linhas celulares imortais têm origem em células tumorais mas sofreram transformações oncogénicas. Não só crescem indefinidamente em cultura, mas também o fazem mais rapidamente, por vezes duplicando o seu número em menos de 24 horas.

De entre as várias técnicas existentes para cultura celular secundária, as mais utilizadas são cultura em suspensão e em monocamada. Esta foi a técnica aplicada às linhas celulares utilizadas no presente trabalho, uma vez que todas elas são do tipo aderente. Constituem requisitos para a cultura celular, meios de cultura apropriados com soro bovino fetal, nutrientes, factores de crescimento, antibióticos, atmosfera adequada e, neste caso, superfície de adesão. O soro bovino fetal, que representa a parte não celular do sangue, deve conter proteínas e factores necessários ao crescimento celular como insulina, transferrina, proteínas transportadoras do ferro e factores de crescimento em quantidades adequadas. O meio Eagle é, historicamente, um dos mais utilizados em culturas celulares, sendo composto por uma solução salina balanceada com vitaminas e aminoácidos. Este meio pode ser encontrado na forma básica (BEM ou, do inglês, basal Eagle’s medium), que é mais indicado para culturas de células diplóides, ou na forma modificada (MEM ou, do inglês, minimum essential medium), que contém maiores quantidades de vitaminas e de aminoácidos. O meio de Eagle tem sido modificado por vários investigadores, nomeadamente por Dulbecco (1914-2012) que obteve o DMEM, fórmula que contém quatro vezes mais vitaminas e aminoácidos do que a fórmula basal e que foi ainda enriquecida com suplementos adicionais.463 _{Outras culturas de células neoplásicas requerem a utilização de meio}

131 das condições ideais de pH, permitindo estabelecer um equilíbrio entre proliferação e actividade de biossíntese celulares.465 _{A presença de vermelho de fenol, visível na figura 43(A), constitui um}

indicador visual do pH do meio o que permite, facilmente, constatar eventuais mudanças que apontem a necessidade de mudança do mesmo.

Considerando que, para adequada cultura celular, é necessário mimetizar as condições fisiológicas normais e que nessas condições as células contactam e interagem com outras células e com a matriz extracelular, é fundamental fornecer às células em cultura, uma superfície de adesão. As células animais normais não crescem, por isso, em suspensão, apresentando-se, naturalmente, sob a forma de culturas aderentes. Já algumas células tumorais podem crescer em suspensão. Para suporte das culturas celulares são, neste contexto, utilizados frascos de vidro ou de plástico como poliestireno, PVC ou Teflon, como representados na figura 43(B), especialmente tratados de forma a melhorar a adesão celular sendo para tal carregados negativamente com SO32-

, poli lisina, dextrano, colagéneo, gelatina ou fibronectina. As células em cultura segregam colagénio e outros componentes da matriz extracelular que se ligam ao suporte.

Figura 43. Superfície de adesão utilizada em cultura celular. (A) Presença de vermelho de fenol na cultura celular;466 _{(B) T-flasks de plástico utilizados para propagação}

celular.467

As células MCF-7, representadas na figura 44 e as HFF-1 foram cultivadas em DMEM (Sigma D-5648) suplementado com 100M de piruvato de sódio (Gibco 11360), soro bovino fetal (Gibco 2010-09) (10% para as MCF-7 e 15% para as HFF-1) e 1% de antibiótico (100U/mL de penicilina e 10g/mL estreptomicina, Gibco 15140-122). As linhas celulares HCC1806, representadas na figura 45 e as HCC1954, na figura 46, foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Sigma R-4130), suplementado com 100μM de piruvato de sódio (Gibco 11360), 10% de soro bovino fetal (Gibco 2010-09) e 1% de antibiótico (100U/mL de penicilina e 10μg/mL estreptomicina, Gibco 15140-122). Posteriormente, todas as linhas celulares foram propagadas utilizando os mesmos meios de cultura mas com uma concentração de glicose inferior (5mM): Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM LG) (Gibco 31600-091) e Roswell

132 Park Memorial Institute Low Glucose (RPMI LG) (Sigma 1383). A este último meio foram adicionados 0,9g/L de D-(+)-Glicose (Sigma G7528) de modo a atingir a concentração de glicose desejada.

O fornecimento de condições ambientais favoráveis, incluindo as características físico- químicas dos substratos presentes nos meios de cultura, temperatura de incubação, provisão de gases e de condições aeróbias, é fundamental para que as células expressem as suas funções especializadas e proliferem em cultura.468 _{Para tal, a propagação das culturas aderentes foi feita}

em atmosfera controlada, a 37ºC e 5% de CO2 utilizando uma incubadora HeraCell®150.

Os diferentes tipos celulares podem ser identificados por características morfológicas típicas num organismo íntegro mas, em cultura celular, essas diferenças normalmente desaparecem. Contudo, de uma maneira geral, as células fibroblásticas apresentam-se, mesmo em cultura, alongadas, fusiformes ou com prolongamentos citoplasmáticos aderidos à superfície da cultura. Normalmente apresentam-se dispostas em arranjo paralelo, porém o contacto da confluência inibe a sua expansão.469 _{Já as células epiteliais tendem a apresentar-se com um}

formato mais ou menos hexagonal e intimamente unidas.470

Todo o material de manipulação das culturas celulares foi devida e previamente esterilizado. Da mesma forma, todos os procedimentos foram efectuados nas condições de esterilização e de assépsia necessários, em câmara de fluxo laminar.

133 Figura 45. Células HCC1806 em cultura.

Figura 46. Células HCC1954 em cultura.