Estudos de Viabilidade Celular

A determinação da viabilidade celular foi realizada através do método de exclusão, utilizando o corante azul de tripano. Este método baseia-se na entrada de azul de tripano nas células que possuem a membrana celular corrompida, o que traduz a presença de células não viáveis, corando-as de azul. A contagem das células realiza-se utilizando uma câmara de Neubauer, hemocitómetro ou câmara de contagem, representado na figura 47, e um microscópio com ampliação de 100x. A câmara de Neubauer é uma lâmina grossa de uso microscópico, com

135 formato rectangular e normalmente de vidro, com uma depressão no centro, utilizada para fazer contagem de células de uma suspensão por unidade de volume.

Figura 47. Hemocitómetro ou câmara de Neubauer.471

No centro desta lâmina existem várias linhas perpendiculares com marcações em quadrantes, de acordo com o representado na figura 48. Ao analisar, em microscópico com a objectiva de imersão, facilmente se percebe que o hemocitómetro apresenta duas câmaras divididas em 9 quadrados de 1,0 mm cada (ou seja, existem três tipos diferentes de quadrantes, que juntos formam um quadrado maior). Estes quadrantes são usados como referência para fazer as contagens e assim determinar a concentração de células viáveis presentes na amostra utilizada.

136 Após os estudos de captação, foram retiradas amostras de 20 L da suspensão celular e

colocadas num tubo eppendorf contendo 20 L de azul de tripano. De seguida, com auxílio de uma micropipeta, a suspensão foi homogeneizada e colocada no hemocitómetro para a contagem das células, processo representado no esquema da figura 49. Após colocação da suspensão no hemocitómetro, este é coberto por uma lamela, a 0,1 mm dos quadrados, perfazendo assim um volume de 0,1 mm3 _{em cada quadrado. A concentração das células por mL é, portanto, a média}

das células contadas por quadrado × 104_.

Ao microscópio, foram contadas as células presentes nos quatro quadrantes dos cantos do hemocitómetro, assinalados pela letra L na figura 48. Da contagem efectuada, resultou a quantificação das células que coraram de azul, correspondentes a células mortas e das células brilhantes, não coradas de azul, que traduzem células vivas. A percentagem de células viáveis foi determinada de acordo com a seguinte equação (eq. 3):

100 mortas células vivas células vivas células Celular e Viabilidad %    (eq. 3):

Figura 49. Esquematização dos procedimentos de determinação da viabilidade celular, pelo método de exclusão com azul de tripano.471

137

6.2

Citometria de Fluxo

A citometria de fluxo é uma técnica utilizada para a análise de múltiplos parâmetros de células individuais em populações heterogéneas. Permite contar, examinar e classificar células ou outras partículas biológicas, microscópicas, suspensas num meio. Permite, ainda, analisar simultaneamente e num curto período de tempo, múltiplas características físicas e químicas de células em suspensão através de um aparelho de detecção óptico-electrónico, cujas variadas aplicações incluem imunofenotipagem, análise de ploidia ou contagem de células. O citómetro de fluxo efectua este tipo de análise fazendo passar milhares de células por segundo através de um feixe de raios laser e captando a luz emergente de cada célula produzida à sua passagem.472 _Os

dados recolhidos são depois analisados estatisticamente pelo software do sistema de citometria, reportando características celulares como tamanho, complexidade ou fenótipo, de acordo com o esquema da figura 50.

Figura 50. Instrumentação de um citómetro de fluxo.473

Para uma recolha precisa de dados, é necessário que as partículas ou células em estudo passem através do feixe de laser, uma a uma. A maioria dos citómetros de fluxo alcança este objectivo através da injecção da amostra num fluxo corrente de solução salina. A corrente contendo a amostra é comprimida até uma dimensão próxima do diâmetro celular, mecanismo designado de focalização hidrodinâmica. À medida que a amostra passa através do laser, cada célula ou partícula, dispersa ou refracta a luz em direcção a todos os ângulos. A dispersão que

138 ocorre na linha do feixe de luz é designada de forward scatter (FSC).472 _{Vários detectores são}

apontados ao local onde o fluxo de partículas passa através do feixe de luz: um na linha do feixe de luz e vários perpendiculares a este (side scatter, SSC), além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa que passa através do feixe, dispersa a luz de uma forma distinta e os corantes químicos fluorescentes encontrados na partícula ou a ela ligados, podem ser excitados emitindo luz de menor frequência (ou maior comprimento de onda) do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos detectores e, por análise das flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente), é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula, individualmente, pela conversão de intensidade de luz em voltagem efectuada pelos detectores. A luz dispersa recebida pelos detectores é traduzida num pulso voltaico, que é proporcional à dimensão das células ou partículas analisadas. Um histograma de dados de FSC constitui uma representação gráfica unidimensional da distribuição de volumes numa população, já que a FSC se correlaciona com o volume celular. A SSC depende, por seu lado, da complexidade interna e externa da partícula (por exemplo, rugosidade da membrana). A utilização de ambos os dados fornecidos por FSC e SSC permite uma análise multiparamétrica da amostra, uma vez que origina gráficos de dispersão bidimensionais.472

No contexto deste trabalho, a citometria de fluxo foi utilizada na:

a) Avaliação da expressão membranar de proteínas transportadoras de glicose em células incubadas em high glucose;

b) Avaliação da expressão citoplasmática de proteínas transportadoras de glicose em células incubadas em high glucose;

c) Determinação da expressão membranar de proteínas transportadoras de glicose em células incubadas em low glucose;

d) Determinação da expressão citoplasmática de proteínas transportadoras de glicose em células incubadas em low glucose;

e) Determinação da expressão celular de KI-67;

f) Determinação da expressão celular de ER, PR e HER2.

Uma das formas mais comuns de estudar características celulares por citometria de fluxo envolve a utilização de moléculas fluorescentes (fluorocromos), tais como anticorpos marcados com fluoróforos. Em estudos que envolvam estas técnicas, os anticorpos marcados são adicionados à amostra, sofrendo posterior ligação a moléculas específicas presentes na superfície celular ou mesmo no interior das células. Deste modo, quando o raio laser de comprimento de

139 onda adequado atinge o fluoróforo, é emitido um sinal fluorescente, subsequentemente detectado pelo citómetro.472

Para cada uma das marcações efectuadas foram necessárias aproximadamente 106 _células.

As células foram preparadas, inicialmente com desagregação celular das placas utilizando uma solução de tripsina/EDTA a 0,25% (Gibco 25200). Posteriormente, foram colocadas num tubo de citómetro previamente marcado. Os tubos de citómetro foram centrifugados, o meio de cultura foi decantado e as células ressuspensas em 500μL de PBS. Seguidamente procedeu-se à marcação das células com o anticorpo desejado. Para todas as marcações, o número de eventos obtidos através do programa CellQuestTM_{, correspondente ao número de células, foi de 10}4_{. Para a análise}

e quantificação da informação foi utilizado um software específico que corre em computador dedicado (Paint-a-Gate 3.02, Machintosh Software).