Curvas de crescimento e quantificação de etanol

Curvas de crescimento da cepa referência (BY4741) e dos transformantes/mutantes foram realizadas em YNB (suplementado segundo necessidades auxotróficas das cepas), pH 4,0, com 5% p/v de glicerol puro. As cepas foram inoculadas em 50 mL de meio, D.O.600nm inicial ~ 0,1, em

Erlenmeyers de 250 mL, a 30 ºC, 200 rpm, por 120 h. Leitura de D.O. foi realizada ao longo do tempo. Na Figura 15 está representada a curva de crescimento para BY4741, onde se pode ver que o crescimento total em glicerol (5% p/v) só é alcançado ao fim de aproximadamente 50 – 60 h, e que a taxa de crescimento e a biomassa produzida são muito inferiores às que se observam com a mesma cepa em glucose (2% p/v). Para cada cepa foi calculada a taxa de crescimento na fase logarítmica.

Figura 15 – Curva de crescimento de BY4741 em glicose 2% p/v e glicerol 5% p/v. O crescimento foi realizado em YNB, pH 4,0, por 120 h. Resultados correspondem à média e desvio padrão de 2 ensaios independentes.

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A comparação das taxas de crescimento para cada cepa está apresentada na Figura 16. As condições de crescimento foram como descritas anteriormente, exceto para um controle extra com a cepa BY4741 ao qual não foi adicionado glicerol ou qualquer outra fonte de carbono. A maior taxa de crescimento observada foi para BY4741 em 5% de glicerol.

GAP CYC GAP CYC GAP GAP GAP CYC GAP GAP CYC GAP GAP CYC

Figura 16 – Taxas de crescimento de BY4741 em glicerol 0 e 5% p/v, e mutantes/transformantes em glicerol 5% p/v. O crescimento foi realizado em YNB, pH 4,0, por 120 h. Colunas seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 0,05 de probabilidade. Os resultados correspondem a pelo menos 2 ensaios independentes.

83

O aumento do número de mutações provocou uma crescente diminuição do desempenho em glicerol. A taxa de crescimento do mutante duplo (BY4741 HIS3GAP_STL1CYC_KMXGAP_{PDC2), e do mutante triplo (BY4741}

HIS3GAP_STL1CYC_KMXGAP_{PDC2 p416}GAP_GUT1CYC_{), não foi estatisticamente}

diferente do controle sem fonte de carbono. Também não foi observada diferença no crescimento das cepas com plasmídeo vazio ou contendo a sobrexpressão dos genes STL1 ou GUT1, sendo as taxas estatisticamente iguais à da cepa BY4741 5% glicerol. Etanol não foi detectado em crescimentos em YNB 5% de glicerol, tanto para a cepa WT quanto para os mutantes/transformantes.

84 5 DISCUSSÃO

As estratégias de engenharia genética focam frequentemente na alteração de fluxos das vias metabólicas primárias, como a glicólise, a via das pentoses, o ciclo do ácido cítrico, as vias de síntese de aminoácidos (Kern et al., 2007) através da alteração da expressão dos genes que codificam enzimas-chave dessas vias. A sobrexpressão de genes pode promover o redirecionamento de fluxos metabólicos, permitindo a produção de maior quantidade de um dado composto. Este tipo de estratégia é amplamente utilizada em biotecnologia no intuito de aumentar o rendimento e a produtividade de compostos desejados, assim como para aumentar tolerância a fatores de estresse tipicamente industriais (Kern et al., 2007; Yu et al., 2012; Steensels et al., 2014; Yovkova et al., 2014; Gorgens et al., 2015; Jin e Cate, 2017; Nasution et al., 2017; Oh et al., 2019; Sasaki et al., 2019).

As vias de assimilação e consumo do glicerol estão diretamente relacionadas com a glicólise e gliconeogênese, constituindo um desvio do fluxo metabólico ao nível da dihidroxiacetona fosfato. S. cerevisiae é uma levedura respiro- fermentativa, deste modo, a glicose e outros açúcares são simultaneamente respirados e fermentados. Ao contrário, o glicerol é exclusivamente respirado devido à necessidade de manutenção do equilíbrio redox alterado pelo funcionamento da glicerol desidrogenase mitocondrial FAD+_-dependente

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citossólica NADH-dependente (Gpd1), permite o restauro do nível de equivalentes oxidados durante a fermentação. Estas duas reações opostas e compartimentalizadas acoplam o potencial redox citoplásmico ao mitocondrial, formado o que se designa glicerol shuttle, que tem sido até hoje o maior obstáculo à eficiente manipulação genética do metabolismo do glicerol. Apesar disso, anteriormente ((Yu et al., 2010a) trabalharam com a sobrexpressão dos genes da via alternativa de consumo do glicerol (GCY e DAK), bem como o gene GUP1 que codifica uma O-acil transferase que interfere indiretamente na regulação do transportador Stl1 (Ferreira et al., 2005), com o objetivo de desviar o fluxo glicolítico proveniente do consumo do glicerol para a fermentação. O presente trabalho teve o mesmo objetivo, i.e., obter a produção de etanol a partir de glicerol em S. cerevisiae. Para isso, a estratégia adotada baseou-se em obter a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1, da primeira enzima do catabolismo do glicerol, a Gut1, com isso promovendo uma entrada abundante de substrato e forçando o metabolismo na direção da síntese de lipídeos (via o aumento da produção de glicerol 3P) e da glicólise (via o esperado aumento da formação de dihidroxiacetona), sem modificar as enzimas do shuttle, o que teoricamente deveria permitir a manutenção do equilíbrio redox geral da célula. Além desta estratégia, pretendeu-se obter também a sobrexpressão de outro gene, codificador do fator de transcrição, o Pdc2. Este fator atua como ativador da expressão dos genes que são regulados pela tiamina, incluindo a principal isoforma da piruvato descarboxilase responsável pela fermentação, a Pdc1. Teoricamente, maior quantidade de Pdc2 deveria ter como consequência maior quantidade de Pdc1, o que deveria permitir o desvio do fluxo metabólico a nível do piruvato no

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sentido da fermentação. Desta forma, a sobrexpressão do gene STL1 e do GUT1 foi realizada numa cepa já modificada para a sobrexpressão do PDC2 (Figura 4). Os procedimentos sequencialmente foram: (i) substituir o promotor da PDC2 por um promotor constitutivo forte e desregulado, (ii) fazer a inserção cromossómica de uma segunda cópia do STL1 sob a regulação do mesmo promotor, e (iii) clonar e sobrexpressar em plasmídeo a GUT1 sob o mesmo promotor (Figura 4).

O promotor escolhido (GAP) foi o da gliceraldeído-3P desidrogenase (Tdh3), um promotor constitutivo forte da via glicolítica largamente usado em estratégias de engenharia genética (Doring et al., 1998; Yang et al., 2016; Ata et al., 2017; Yang et al., 2018). Em estudo recente (Ho et al., 2018), a análise de transcriptoma de S. cerevisiae cultivada em meio sintético com 6% de glicerol a pH 4,0, mostrou que genes apresentavam maior nível de expressão, tendo sido os seus promotores avaliados pela expressão de uma proteína repórter fluorescente. Dos 25 promotores avaliados, o promotor GAP apresentou a quinta melhor atividade, tendo sido igual à do promotor TEF1, confirmando assim a forte atividade do promotor.

Após confirmação das construções por amplificação e sequenciamento de fragmentos alvo (Figuras 6, 7, 9, 10, 12 e 13), foram realizadas curvas de crescimento em glicerol 5%, pH 4,0, em aerobiose onde não foi observado melhora do desempenho das cepas mutantes/transformantes. As taxas de crescimento não apresentaram diferenças sensíveis em relação à cepa-mãe das construções, a S. cerevisiae BY4741 (Figura 16). Muito pelo contrário, as diferenças observadas mostram uma diminuição progressiva da µg com o

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sobrexpressão simultânea para os genes PDC2-STL1 e PDC2-STL1-GUT1. Diante desses resultados e postulando que todos os genes estivessem sendo corretamente expressos (o que terá de ser verificado em trabalho futuro), a sobrexpressão simultânea de várias enzimas usando apenas promotores fortes pode não melhorar o desempenho da levedura devido ao estresse causado ao organismo pelo aumento da carga metabólica (Mattanovich et al., 2004), pela sobrecarga na mobilização dos recursos celulares para a síntese proteica, pelo desequilíbrio estequiométrico, pela realização de interações inespecíficas, ou por falha na regulação de vias metabólicas associada ao grau de sobrexpressão (Moriya, 2015). O fraco consumo de glicerol observado nestas cepas pode advir de qualquer ou várias destas possibilidades. Além disso, há que ter em consideração que um aumento da produção de mRNA não significa que as correspondentes proteínas tenham de fato sido produzidas em maior quantidade e estejam funcionais, ou seja, corretamente enoveladas, localizadas e orientadas.

A avaliação da sobrexpressão dos genes alvo pode ser feita por reação em cadeia da polimerase em tempo real acoplada à transcrição reversa (RT-qPCR) que quantifica os níveis de mRNA (Nasution et al., 2017; Sasaki et al., 2019), permitindo assim um valor indicativo dos níveis de proteína na célula (Gygi et al., 1999). A efetiva presença de maiores níveis de proteínas pode ser avaliada pela atividade da proteína sobrexpressa, por ensaios de recuperação de fenótipo (Ferreira et al., 2005; Cunha et al., 2019), por ensaios de atividade enzimática (Yu et al., 2010a; Tomaszewska et al., 2014; Díaz-Rincón et al., 2017). No caso particular do Stl1 e da Gut1, a atividade proteica poderá ser medida, a do Stl1 pela mesma metodologia usada no presente trabalho, e no

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caso da Gut1 por ensaio enzimático (Gomes et al., 2005). Caso haja maior quantidade de proteína a Vmax deveria ser mais elevada.

Contudo, tais avaliações ainda não foram realizadas e desta forma não é possível afirmar que as construções de fato promoveram um efetivo aumento da quantidade de proteína. Deste modo, para que seja possível aumentar o consumo de glicerol por BY4741, e para que este possa ser convertido em etanol, novos estudos com as construções apresentadas no presente trabalho deverão ser realizados, de forma que seja possível avaliação da validade da estratégia de clonagem, da escolha do plasmídeo e do promotor utilizado.

89 6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Na presente tese de Doutorado, estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos, foram realizados. Foi caracterizado o transportador de glicerol de Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, cepa isolada de dornas de fermentação de cachaça, tendo seu genoma sido sequenciado. Estratégias de engenharia genética foram utilizadas para aumentar consumo de glicerol por Saccharomyces cerevisiae tendo em vista sua possível conversão em etanol.

W. anomalus LBCM1105 é capaz de crescer excepcionalmente bem em glicerol. Concomitantemente, o presente trabalho mostrou que W. anomalus LBCM1105 possui um transportador ativo de glicerol de alta afinidade, expresso em condições de repressão/indução sob um promotor regulado, mas forte:

- O H+_{/glicerol simporte de W. anomalus (WaStl1p) tem (i) 562 aminoácidos;}

(ii) 72% de identidade com o transportador de S. cerevisiae; (iii) cerca de 10 domínios transmembranares; (iv) elevada afinidade para o glicerol; e (v) é inativado na presença de prótonionóforo;

- O gene WaSTL1 é (i) expresso em elevada quantidade, (ii) reprimido na presença de glicose, (iii) desreprimido na presença de glicerol; e (iv) quando

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expresso heterologamente é capaz de recuperar o fenótipo de crescimento em glicerol de S. cerevisiae stl1∆.

O presente trabalho mostrou ainda, pela primeira vez, que ao contrário de S. cerevisiae, W. anomalus ao consumir glicerol como fonte única de carbono e energia produz etanol. Pensa-se que subjacente a este aspecto pouco usual em leveduras, esteja a capacidade de não permitir a desregulação do balanço redox a nível da redox shuttle gerada pela inexistência de citocromo C e existência, em vez, da oxidase alternativa da respiração resistente a cianeto (Veiga et al., 2003).

O sequenciamento de W. anomalus LBCM1105 apresentou genoma com 12,78 Mb, %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade e 90% de extensão e completude, tendo sido a cepa agrupada com W. anomalus. O genoma contém todas as 12 proteínas relacionada ao metabolismo de glicerol quando comparado com o de S. cerevisiae, em um total de 6.024 genes codificadores de proteínas preditos. Além disso, o genoma apresenta também uma sequência gênica putativa codificando a oxidase alternativa da respiração resistente a cianeto.

As estratégias de engenharia genética em S. cerevisiae visaram aumentar a entrada do glicerol e a sua conversão em glicerol 3P, i.e., o aumento do fluxo de consumo de glicerol, em um background em que se promovia indiretamente o desvio do fluxo metabólico no sentido da fermentação com a sobre expressão de um fator de transcrição capaz de promover o aumento da expressão da piruvato descarboxilase. Esta estratégia foi totalmente realizada e as construções verificadas, não tendo, no entanto, sido verificada o aumento correspondente de produção de proteína. Fenotipicamente, os

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transformantes/mutantes apresentaram redução da taxa de crescimento em glicerol, intensificada proporcionalmente ao número de eventos de manipulações genéticas em que a cepa foi submetida, sugerindo assim, uma sobrecarga metabólica.

Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, seguem as sugestões para continuidade dos estudos:

a- Determinação da expressão dos genes e atividade de proteínas alvos das estratégias de engenharia genéticas nos mutantes/recombinantes de BY4741;

b- Desenvolvimento de estratégia de engenharia genética mais eficiente com o objeto de aumentar o consumo de glicerol por leveduras;

c- Estudo das proteínas relacionadas ao metabolismo de glicerol de LBCM1105 com vistas à aplicação em cepas industriais.

A bioprospecção de leveduras em ambientes ainda pouco explorados como as dornas de fermentação de cachaça representam importantes fontes de microrganismos com potencial biotecnológico. Espera-se que o presente trabalho possa fornecer aos leitores ferramenta para uma maior compreensão acerca do consumo de glicerol por leveduras.

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