UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
Aureliano Claret da Cunha
ESTUDOS SOBRE CONSUMO DE GLICEROL POR LEVEDURAS PARA FINS BIOTECNOLÓGICOS
Tese de Doutorado
Ouro Preto 2019
PPGBIOTEC
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Aureliano Claret da Cunha
Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos
Coorientadoras: Dra. Fernanda Godoy Santos, Profa. PhD. Cândida Lucas Orientador: Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandão
Tese de Doutorado apresentada ao programa de pós-graduação em Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia, área de concentração Biotecnologia Industrial.
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Catalogação: www.sisbin.ufop.br
CDU: 582.282.23:663. Cunha, Aureliano Claret.
Estudos sobre consumo de glicerol por leveduras para fins biotecnológicos [manuscrito] / Aureliano Claret Cunha. - 2019.
124f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Rogelio Lopes Brandao. Coorientadora: Profª. Drª. Cândida Lucas.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de Concentração: Biotecnologia Industrial.
1. Cachaça. 2. Biodiesel. 3. Etanol. 4. Biotecnologia - Indústria. I. Brandao, Rogelio Lopes. II. Lucas, Cândida. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
IV
Aos meus pais, esposa, irmãos, minha
amada família. Vocês são minha base, meu alicerce,
meu porto seguro. Tornaram isso possível, pois me
ensinaram lições que não se aprende em nenhum
banco escolar.
V AGRADECIMENTOS
À UFOP pelo ensino público, gratuito e de qualidade.
À Universidade do Minho - Portugal, pela receptividade e apoio para realização deste trabalho.
Aos órgãos de fomento à pesquisa: CNPq, CAPES e FAPEMIG. À empresa CERLEV pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. Rogelio Brandão e Profa. PhD. Cândida Lucas pela oportunidade, confiança e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Ieso Castro, pela disponibilidade e aprendizado.
À Dra. Fernanda Godoy e Dr. Fábio Oliveira pela coorientação e ensinamentos. Ao MSc. Renato Santos pela cooperação e ensinamentos em bioinformática. A todos os professores do NUPEB pelos ensinamentos.
Ao DEALI/ENUT/UFOP pela concessão do meu afastamento para qualificação. Aos laboratórios – LBCM/NUPEB/UFOP, LIP/NUPEB/UFOP, LIMP/NUPEB/ UFOP, Biodiversidade/CBMA/UMinho, Bromatologia/ENUT/UFOP e LQTA/ICEB/UFOP por todo suporte.
VI AGRADECIMENTOS PESSOAIS
Agradeço à Deus, sempre presente nas minhas ações, meu sustento nas horas mais difíceis.
Aos meus pais João Darci e Elci por serem minha fortaleza, minha inspiração, a quem devo minha formação, ainda serei um guerreiro como vocês foram por toda a vida, amo vocês.
Aos meus irmãos Geraldo e Gisele pelo apoio constante.
A todos meus familiares, tios, primos, sobrinhos, cunhados, cada estímulo de vocês me impulsionou.
À madrinha Geralda sempre presente na minha vida em todos os momentos. À família Virakopos pelos momentos de descontração ao longo desses anos. A todos meus amigos pelo constante incentivo.
A todos os funcionários do NUPEB e do Departamento de Biologia/UMinho - Portugal, pelo bom convívio e disponibilidade: secretários, porteiros, técnicos, meninas da limpeza. A todos o meu muito obrigado.
A todos os amigos dos Laboratórios por onde passei, foram 5 anos de muita luta e aprendizado, e tudo fica mais fácil quando se tem alguém bem ao lado para trocar uma ideia e ajudar a segurar a barra nas horas difíceis: Amanda, Ana Clara, Ana Sofia, Anna Clara, Bárbara, Brunos, Débora, Diogo, Eliana, Fábio, Fernandas, Flávios, Gabriel, Giulia, Hygor, Janaína, Joana, João, Leandro, Lorena, Luiz, Marcos, Margarete, Maria Ana, Mário, Patrícia, Pierre,
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Renata, Thalita e Victor. Em especial à Zezé e Geraldinho por toda ajuda e apoio.
Por fim, mas muito importante, agradeço imensamente à minha digníssima esposa Simone, joia rara, meu amparo, meu cais. Você viveu comigo todas, TODAS, as etapas desse processo. Me deu apoio, sorriu e chorou comigo, foi de mala e cuia para além mar, sempre ao meu lado. Então, tal como eu, você também é Doutora em Biotecnologia! Parabéns! Te amo!
VIII RESUMO
Nos últimos anos o aumento do excedente de produção do glicerol bruto, um subproduto da produção do biodiesel, tem estimulado a busca por processos alternativos de aplicação do glicerol. De entre as alternativas, destacam-se os processos biotecnológicos onde o glicerol é convertido por microrganismos em um produto com maior valor agregado, de amplo uso industrial e com menor impacto ambiental. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, uma cepa capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de alta afinidade de glicerol (WaStl1p), e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram também utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol. LBCM1105 apresentou velocidades de crescimento maiores que BY4741 independente do meio (YP ou YNB) e da fonte de carbono (glicose ou glicerol). Com o objetivo de melhorar o desempenho de BY4741 em glicerol, foi tentada a sobrexpressão simultânea do transportador ativo de glicerol Stl1 e da primeira enzima da assimilação do glicerol, a glicerol quinase Gut1, com vista a aumentar o fluxo metabólico de consumo do glicerol. Adicionalmente foi também sobrexpresso o fator de transcrição/ativador Pdc2 que controla vários genes, incluindo PDC1, PDC10 e THI10, com vista a promover o desvio do fluxo glicolítico para a fermentação. Todas as construções foram confirmadas por amplificação de fragmentos alvo e sequenciamento de DNA. O desempenho final de cada mutante foi avaliado, não tendo sido obtido o efeito esperado. A taxa de crescimento foi tanto menor quanto mais modificações genéticas, sugerindo uma diminuição de fitness proporcional. Em colaboração com o Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), o genoma da LBCM1105 foi sequenciado, montado, anotado e submetido a análises filogenéticas multiloci. O genoma da W. anomalus LBCM1105 apresenta 12,78 Mb, com %CG de 34,52, cobertura de 20,5x em profundidade
IX
e 90% de extensão e completude. Comparando com leveduras conhecidas, o genoma contém todas as sequências de proteínas relacionadas ao transporte e metabolismo de glicerol. O gene WaSTL1 foi isolado por PCR e clonado no vetor (pCev-G2-Km). O mutante S. cerevisiae BY4741 stl1Δ foi transformado com a construção. A caracterização do mecanismo de transporte de glicerol confirmou (i) que WaStl1p tem uma elevada afinidade para o glicerol, Km = 0,96 ± 0,15 mM, (ii) que a cepa LBCM1105 apresenta além da afinidade uma elevada quantidade de transportador ativo, Vmax = 148,3 ± 10,16 μmol·h−1·g−1,
e (iii) que o gene expresso heterologamente em S. cerevisiae stl1Δ complementa o mutante. O caráter ativo do transporte foi confirmado pela sensibilidade ao protonionóforo carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona, tanto na LBCM1105 como na S. cerevisiae stl1Δ WaSTL1. Futuros estudos das vias metabólicas de glicerol em leveduras serão necessários para que novas estratégias de engenharia genética sejam mais eficientes.
X ABSTRACT
In recent years, the increased production of crude glycerol, a byproduct of biodiesel production, has encouraged the search for alternative glycerol application processes. Among the alternatives, we highlight the biotechnological processes using microbial cell factories to convert glycerol into high-value products with wide industrial use and low environmental impact. The objective of the present work was to characterize Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, a yeast strain capable of efficiently using glycerol as the sole carbon source, by the isolation and characterization of the high affinity glycerol transporter (WaStl1p), and its genome sequencing. Genetic engineering strategies were also used in Saccharomyces cerevisiae BY4741, in order to optimize the consumption of glycerol and obtain its conversion into ethanol. W. anomalus LBCM 1105 showed higher growth rates than S. cerevisiae BY4741 regardless of the medium (YP or YNB) and the carbon source (glucose or glycerol). In order to improve BY4741 performance in glycerol, the simultaneous overexpression of the glycerol active transporter Stl1 and of the first enzyme from glycerol catabolism Gut1, promoting the inwards flux of glycerol was performed. Additionally, the Pdc2p transcription factor/activator which controls the expression of several genes, including PDC1, PDC5 and THI10, was also tempted in order to promote the diverting of the glycolytic flux towards fermentation. The constructions were confirmed by amplification of target fragments and DNA sequencing. The final performance of each mutant was evaluated, but the expected effect was not obtained. Growth rate decreased with the number of genetic manipulations suggesting a proportionate decrease in fitness. In collaboration with the National Laboratory of Bioethanol Science and Technology (CTBE), the genome of LBCM1105 was sequenced, assembled, annotated and subjected to multi loci phylogenetic analyzes. The genome of W. anomalus LBCM1105 shows 12.78 Mb, with GC% of 34.52, 20.5x depth coverage and 90% extension and completeness. Compared with known yeasts, the genome contains all the sequences of proteins related to the transport and metabolism of glycerol. The WaSTL1 gene was isolated by PCR
XI
and cloned into the vector (pCev-G2-Km). The mutant S. cerevisiae BY4741 stl1Δ was transformed with the construction. Characterization of the glycerol transport mechanism confirmed (i) that WaStl1p has a high affinity for glycerol, Km = 0.96 ± 0.15 mM, (ii) that in addition to the high affinity the LBCM1105 strain exhibits a high amount of active transporter, Vmax = 148.3 ± 10.16 μmol h-1 g-1, and (iii) that the heterologous expression of the gene in S. cerevisiae
stl1Δ complements the mutant. The active character of the transport was confirmed by the sensitivity to the protonionophore carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, in LBCM1105 and S. cerevisiae BY4741 stl1Δ WaSTL1. Further studies of the metabolic pathways of glycerol in yeasts will be needed to make develop more efficient genetic engineering strategies.
XII SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 1 1.1 Glicerol ... 1 1.2 Wickerhamomyces anomalus ... 5 1.3 Objetivos ... 7
2 CARACTERIZAÇÃO DO METABOLISMO DE GLICEROL EM Wickerhamomyces anomalus: TRANSPORTADOR E PRODUÇÃO DE ETANOL ... 8
2.1 Artigo: “High affinity transport, cyanide-resistant respiration and ethanol production under aerobiosis underlying efficient high glycerol consumption by Wickerhamomyces anomalus” ... 9
2.2 Errata ... 25
3 SEQUENCIAMENTO DO GENOMA DA Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, ISOLADA DE DORNAS DE FERMENTANÇÃO DE CACHAÇA .. 27
4 ENGENHARIA GENÉTICA DE Saccharomyces cerevisiae PARA PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE GLICEROL ... 39
4.1 REVISÃO DA LITERATURA ... 39
4.1.1 Metabolismo e transporte de glicerol em S. cerevisiae ... 39
4.1.2 Metabolismo fermentativo ... 47
4.1.3 Estratégias de engenharia genética ... 48
4.2 OBJETIVOS ... 52
4.2.1 Geral ... 52
4.2.2 Específicos ... 52
4.3 METODOLOGIA ... 53
4.3.1 Microrganismos e condições de cultivo ... 53
XIII
4.3.3 Amplificação por PCR ... 55
4.3.4 Eletroforese em gel de agarose ... 56
4.3.5 Purificação dos produtos de PCR ... 59
4.3.6 Sequenciamento de DNA ... 59
4.3.7 Restrição enzimática ... 59
4.3.8 Reação ligação T4 DNA ligase ... 60
4.3.9 Obtenção e transformação de células competentes de Escherichia coli ... 61
4.3.10 Preparação (Minipreps) de DNA plasmidial de bactéria ... 62
4.3.11 Extração de DNA plasmidial de S. cerevisiae ... 62
4.3.12 Transformação de leveduras ... 63
4.3.13 Construção dos plasmídeos e cassetes ... 64
4.3.14 Curvas de crescimento ... 66
4.3.15 Quantificação de etanol ... 67
4.3.16 Análise estatística ... 68
4.4 RESULTADOS ... 69
4.4.1 Clonagem dos genes GUT1 e STL1 em plasmídeo centromérico 71 4.4.2 Construção do mutante com sobrexpressão de PDC2 ... 72
4.4.3 Construção do mutante com sobrexpressão de PDC2 e STL1 .... 77
4.4.4 Construção do mutante com sobrexpressão de PDC2, STL1 e GUT1 ... 80
4.4.5 Curvas de crescimento e quantificação de etanol ... 81
5 DISCUSSÃO ... 84
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 89
XIV LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Equação geral de transesterificação de triglicerídeos (Meher et al., 2006) ... 2 Figura 2 – Transporte e metabolismo de glicerol em S. cerevisiae acoplado às principais vias metabólicas. DHA – Dihidroxiacetona; DHA-P – Dihidroxiacetona fosfato; GA3P – Gliceraldeído-3 fosfato; TPP – Tiamina Pirofosfato; TCA – Ciclo do ácido cítrico. Adaptado de Tulha et al. (2012). ... 42 Figura 3 – Estratégia de engenharia genética para conversão de glicerol em etanol. Em vermelho estão apresentados os genes que serão sobrexpressos: STL1, GUT1 e PDC2, sendo o último um fator de transcrição que influencia indiretamente o fluxo de produção de etanol (Pdc1p, Pdc5p e Thi10p). O fluxo para conversão de glicerol a etanol, desde a captação de glicerol pela célula, está representado em caixas e setas verdes, onde DHA-P – Dihidroxiacetona fosfato e GA3P – Gliceraldeído-3 fosfato. Adaptado de Tulha et al. (2012). .... 51 ◄ Figura 4 – Esquema geral da estratégia de engenharia genética. Sobrexpressão do gene PDC2 pela substituição do seu promotor endógeno pelo promotor GAP: inicialmente a cassete de resistência à geneticina (KMX) foi amplificada do plasmídeo pRS42K e clonada no plasmídeo p416GAP CYC, em
seguida a cassete KMXGAP foi amplificada e utilizada para transformar BY4741
por recombinação homóloga, originando a cepa BY4741 KMXGAPPDC2.
Sobrexpressão do gene STL1 pela integração de uma segunda cópia no genoma: primeiramente o gene HIS3 foi amplificado do plasmídeo p423GAP CYC,
XV
homóloga, a cassete HIS3GAPSTL1CYC foi amplificada do plasmídeo e utilizada
para transformar BY4741 KMXGAPPDC2, obtendo a cepa BY4741
HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2. Sobrexpressão do gene GUT1 pela inserção de
uma segunda cópia em plasmídeo centromérico: o plasmídeo p416GAPGUT1CYC
foi utilizado para transformar BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2,
originando a cepa BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2 p416GAPGUT1CYC
com sobrexpressão dos genes STL1, GUT1 e PDC2, apresentando como fenótipo resistência à geneticina, His+ e Ura+... 71
Figura 5 – Construções dos plasmídeos p416GAPGUT1CYC e p416GAPSTL1CYC a
partir do plasmídeo p416GAP CYC. A construção foi realizada por reação de
ligação com T4 DNA ligase após digestão do plasmídeo p416GAP CYC com as
enzimas XhoI e EcoRI para o gene STL1 e SalI e BamHI para o gene GUT1. Figura construída utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2. ... 73
Figura 6 – Gel de confirmação da inserção dos genes GUT1 e STL1 no plasmídeo p416GAP CYC. Lad- DNA Ladder (1 kb, Bioline), p416vz- plasmídeo
p416GAP CYC vazio, p416G- plasmídeo p416GAPGUT1CYC, p416S- plasmídeo
p416GAPSTL1CYC. ... 74
Figura 7 – Representação do alinhamento do sequenciamento dos genes GUT1 (A) e STL1 (B) no plasmídeo p416GAP CYC. Setas marrom acima dos
genes representam o alinhamento das sequências obtidas pelo sequenciamento. Figura construída utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2.
... 74 Figura 8 – Construção do plasmídeo p416KMXGAP. O plasmídeo foi construído
XVI
KanMX. Do plasmídeo p416KMXGAP foi amplificada a cassete KanMXGAP com
2083 pb com região homóloga ao gene PDC2 para integração no genoma da BY4741. Figura construída utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2. ... 75
Figura 9 – Gel de confirmação da inserção do fragmento KanMXGAP em BY4741. Lad- Ladder Lambda DNA/Eco47I, C1 a C4 - PCR do DNA das colônias 1 a 4 que apresentaram crescimento em YPD geneticina. ... 76 Figura 10 – Alinhamento do sequenciamento da substituição do promotor do gene PDC2 pelo promotor GAP. Setas marrom acima dos genes representam o alinhamento das sequências obtidas pelo sequenciamento. Figura construída utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2. ... 76
Figura 11 – Construção do plasmídeo p416HIS3GAPSTL1. O plasmídeo foi
construído por recombinação homóloga pela transformação de BY4741 com a cassete casHIS3 e o plasmídeo p416GAPSTL1CYC linearizado com a enzima
SacI. Do plasmídeo p416HIS3GAPSTL1CYC foi amplificada a cassete
casHIS3GAPSTL1 com 3412 pb com região homóloga ao gene his3 para integração no genoma da BY4741 KMXGAPPDC2. Figura construída
utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2. ... 78
Figura 12 – Gel contendo amplificação do fragmento HIS3GAPSTL1. Lad-
Ladder Lambda DNA/Eco47I, C1 a C8- PCR do DNA das colônias C1 a C8 que apresentaram fenótipo Ura+. ... 79
Figura 13 – Confirmação por sequenciamento da inserção no genoma da segunda cópia de STL1 sob promotor GAP. Setas marrom acima dos genes representam o alinhamento das sequências obtidas pelo sequenciamento. Figura construída utilizando-se o software SnapGene® 2.3.2. ... 79
XVII
Figura 14 – Gel de confirmação da inserção do plasmídeo p416GAPGUT1CYC no
background BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2. Br- Branco, p416G-
plasmídeo p416GAPGUT1CYC (controle positivo), C1 e 2- PCR do DNA das
colônias de transformantes 1 e 2 com fenótipo Ura+, Lad- Ladder 1 kb (Kasvi).
... 80 Figura 15 – Curva de crescimento de BY4741 em glicose 2% p/v e glicerol 5% p/v. O crescimento foi realizado em YNB, pH 4,0, por 120 h. Resultados correspondem à média e desvio padrão de 2 ensaios independentes. ... 81 Figura 16 – Taxas de crescimento de BY4741 em glicerol 0 e 5% p/v, e mutantes/transformantes em glicerol 5% p/v. O crescimento foi realizado em YNB, pH 4,0, por 120 h. Colunas seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 0,05 de probabilidade. Os resultados correspondem a pelo menos 2 ensaios independentes. ... 82
XVIII LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Preparação das Mastermix para protocolos de clonagem e confirmação de presença dos genes de interesse (1 reação (Rx), 20 µL). ... 56 Tabela 2 – Primers para o isolamento, clonagem e sequenciamento de genes, e confirmação da inserção em plasmídeo e no genoma. Fw - foward, Rv - reverse. ... 57 Tabela 3 – Programa de PCR para amplificação de genes de interesse. ... 58 Tabela 4 – Reações de restrição enzimática, dupla e simples. ... 60
1 1 INTRODUÇÃO
1.1 Glicerol
A sociedade moderna utiliza como principal componente da sua matriz energética o petróleo, matéria-prima não renovável. Além dos combustíveis, inúmeros derivados do petróleo são utilizados diariamente, nomeadamente muitos dos produtos à base de plásticos. No entanto, o constante aumento da demanda por fontes de energia, as mudanças climáticas causadas pelo aquecimento da atmosfera e o esgotamento das reservas de petróleo de fácil extração, aliado a um desenvolvimento socioeconômico mais intenso, têm incentivado a utilização de insumos renováveis, que possam substituir, ao menos parcialmente, os combustíveis de origem fóssil como petróleo, carvão e gás natural. Uma das alternativas mais prementes de insumos renováveis são os biocombustíveis (Da Silva et al., 2009; Rico e Sauer, 2015).
Biocombustível é todo combustível oriundo de matérias-primas renováveis, sobretudo de origem vegetal. A assimilação do CO2 da atmosfera é uma etapa
do ciclo do carbono que ocorre em plantas e por outros organismos vivos que realizam a fotossíntese. O CO2 assimilado é então transformado em
carboidratos, lipídeos e outros compostos orgânicos. Desta forma, os biocombustíveis apresentam balanço de carbono favorável, pois o CO2 emitido
na queima pode ser reabsorvido pelas plantas no processo de fotossíntese. São exemplos de biocombustíveis o etanol, obtido da cana de açúcar ou milho
2
(1ª geração) ou a partir de biomassa lignocelulósica (2ª geração), e o biodiesel, obtido a partir de óleos e gorduras (Mota e Monteiro, 2013).
A Lei 11.097 de 2005 (Brasil, 2005), define biodiesel como o biocombustível derivado de biomassa renovável para uso em motores a combustão interna com ignição por compressão ou, conforme regulamento, para geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil. Devido os ésteres de ácidos graxos, conhecidos como biodiesel, apresentarem características físicas semelhantes às do óleo diesel, podem ser utilizados em motores do ciclo diesel sem que seja necessária alguma adaptação (Castro et al., 2004).
O biodiesel é produzido pela transesterificação de triglicerídeos com um monoálcool (metanol ou etanol) na presença de um catalizador (ácido ou base forte) (Meher et al., 2006) (Figura 1), sendo o glicerol um subproduto inerente da reação de transesterificação de triglicerídeos.
Figura 1 – Equação geral de transesterificação de triglicerídeos (Meher et al., 2006)
3
O glicerol (1,2,3 propanotriol) foi descoberto em 1779. É um poliálcool que está presente em diferentes espécies, incluindo protistas unicelulares e mamíferos. No entanto, é difícil encontrar o glicerol em sua forma “livre” nesses organismos, pois geralmente se encontra como um triglicerídeo combinado, por exemplo, a ácidos graxos. Grandes quantidades de glicerol podem ser encontradas em óleos ou azeites, bem como em gorduras de animais. O termo glicerina é usualmente aplicado aos compostos comerciais purificados que contém quantidades iguais ou superiores a 95% de glicerol (Arruda et al., 2007).
O cálculo estequiométrico da transesterificação de triglicerídeos mostra que se formam 10% p/p de glicerol. No entanto, tal valor é referente ao glicerol puro (Meher et al., 2006). O glicerol bruto obtido industrialmente é constituído por glicerol (35-50%), água (10-30%), metanol (20-50%), NaCl (0,5-2%), ácido graxo sódico (0,5-2%), ésteres de ácidos graxos (0,5-2%) e ácido sulfúrico (5-10%), mas sua composição pode ser influenciada pela relação álcool/óleo e pelo agente catalítico empregado na reação de transesterificação (Gao et al., 2016). Desta forma, glicerol bruto contém muitos contaminantes para uma aplicação direta pela indústria química ou farmacêutica, e o elevado custo de purificação não permite que compita com o glicerol oriundo da refinação petrolífera (Amaral et al., 2009).
A produção mundial de biodiesel cresceu 47 vezes de 2000 a 2013 (Irena, 2014) e para 2024, espera-se que a produção mundial de biodiesel alcance 38,569 bilhões de litros (Oecd/Fao, 2015). Desde que a produção de biodiesel em escala mundial foi impulsionada, o preço do glicerol bruto vem caindo seguindo uma curva exponencial desde 2002 (Yazdani e Gonzalez, 2007;
4
Pagliaro e Rossi, 2010). No Brasil, a Empresa de Pesquisa Energética projetou para o ano de 2022, um consumo de 4,174 bilhões de litros de biodiesel, valor este 47% maior que no ano de 2013 (Brasil, 2013). A expectada demanda de biodiesel foi calculada sobre a demanda final de diesel, considerando-se a obrigatoriedade prevista na Lei n° 11.097/2005 (Brasil, 2005) e na Resolução CNPE n° 6, de 16/09/2009 (Brasil, 2009), que antecipou a adição de 5% de biodiesel no óleo diesel a partir de janeiro de 2010 e o percentual de 5% foi mantido em todo o horizonte de projeção (Brasil, 2013). No entanto, a Lei nº 13.263/2016 (Brasil, 2016), já prevê uma ampliação da adição obrigatória de 5% para 8, 9 e 10% de biodiesel ao óleo diesel vendido ao consumidor final a partir de 12, 24 e 36 meses da publicação da mesma, respectivamente. A Lei também já autoriza, após a realização de ensaios em até 36 meses de sua promulgação, a adição de até 15% de biodiesel ao diesel. Com o aumento do percentual obrigatório de adição de biodiesel ao diesel, o consumo de biodiesel será ainda maior que os 4,174 bilhões de litros inicialmente projetados para o ano de 2022 pela Empresa de Pesquisa Energética.
Tendo em vista os baixos preços comerciais devido à grande produção, o glicerol tornou-se um substrato interessante para a fermentação microbiana, podendo competir com os açúcares utilizados na produção de produtos químicos ou mesmo dos biocombustíveis (Ito et al., 2005; Yazdani e Gonzalez, 2007). Glicerol bruto pode ser utilizado como fonte de carbono em diversos processos fermentativos para a produção de produtos químicos e polímeros biodegradáveis, incluindo 1,3 propanodiol, ácido succínico, 2,3 butanodiol, polihidroxialcanoato, óleos e gorduras microbianas (ou óleo celular simples, single cell oil – SCO), etanol, ácido cítrico, polióis, ácido metil succínico e
5
dihidroxiacetona (Koutinas et al., 2014). A conversão em produtos de maior valor agregado, especialmente com o uso de recursos mais baratos, como o glicerol bruto, poderia desenvolver a indústria de biocombustíveis tornando-a economicamente viável e sustentável (Yazdani e Gonzalez, 2007).
1.2 Wickerhamomyces anomalus
Nos últimos anos, distintos microrganismos estão sendo usados para converter glicerol de biodiesel em produtos de maior valor agregado: Lipomyces starkeyi (Leiva-Candia et al., 2015; Spier et al., 2015; Liu et al., 2017), Rhodosporidium toruloides (Leiva-Candia et al., 2015; Gao et al., 2016), Escherichia coli (Andreessen e Steinbuchel, 2012; Wong et al., 2014; Wu et al., 2014), Yarrowia lipolytica (Lima, 2014; Sestric et al., 2014), Klebsiella pneumoniae (Oh et al., 2011), Cryptococcus curvatus (Meesters et al., 1996; Leiva-Candia et al., 2015; Spier et al., 2015), Rhodotorula glutinis, Candida cylindracea e Lipomyces lipofer (Spier et al., 2015). Em particular S. cerevisiae foi tentativamente utilizada para melhorar crescimento em glicerol como única fonte de carbono (Ochoa-Estopier et al., 2011) ou para converter glicerol em etanol (Yu et al., 2010a; Yu et al., 2010b). No entanto a eficiência de conversão alcançada é muito baixa, o que justifica a busca por microrganismos que sejam capazes de realizar tal conversão mais eficientemente.
Durante o processo de fabricação de cachaça, que geralmente é produzida por fermentação espontânea (Da Conceicao et al., 2015), o mosto possui uma grande diversidade microrganismos (Guerra et al., 2001). Em um estudo prévio, entre 118 leveduras isoladas de mosto de cachaça (Da Conceicao et al., 2015),
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uma cepa destacou-se quanto ao consumo de glicerol puro. Wickerhamomyces anomalus LBCM1105 (anteriormente LBCM 105) foi capaz de crescer na presença de até 25% de glicerol puro.
W. anomalus, previamente designada como Pichia anomala, Hansenula anomala ou Candida pelliculosa, é tradicionalmente conhecida como uma levedura causadora de deterioração de vinhos (Niu et al., 2016; Oro et al., 2018), tendo sido isolada de habitats frequentemente associados com deterioração ou processamento de alimentos e derivados de grãos (Passoth et al., 2006). Essa levedura é capaz de crescer em fontes muito diversas de carbono e nitrogênio, em pH alto e baixo (2,0 a 12,4), temperaturas de 3 a 37 ºC, baixa atividade de água (0,92 pela adição de NaCl, 0,85 pela adição de glicerol), e em condições anaeróbicas (Fredlund et al., 2002), tendo o seu primeiro sequenciamento genômico sido completado em 2012 (Schneider et al., 2012; Riley et al., 2016). Possui distintas aplicações industriais como na produção de aromas e bioemulsionantes alimentares (Chen et al., 1998), polihidroxialcanoatos, polímeros biodegradáveis (Ojha e Das, 2018), cerveja ácida (sour beer) (Osburn et al., 2018), bebidas alcóolicas Indianas (Sha et al., 2018), vinho e cidra (Kim et al., 2018), componentes aromáticos em fermentados de uva (Bagheri et al., 2018; Aplin et al., 2019), biossurfactantes (Souza et al., 2017b; Teixeira Souza et al., 2018), licor Baijiu (Li et al., 2018; Zha et al., 2018), lipídeos (Arous et al., 2017; Souza et al., 2017a) e enzimas (Díaz-Rincón et al., 2017; Hong et al., 2017). Também tem sido utilizada como agente de biocontrole (Oro et al., 2018) e probiótico (Lara-Hidalgo e Dorantes-Alvarez, 2018; Suvarna et al., 2018; Zullo e Ciafardini, 2019). Além da habilidade de crescer utilizando o glicerol como única fonte de carbono, W.
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anomalus LBCM1105 é capaz de produzir etanol, enquanto consome glicose, sacarose ou xilose (Da Conceicao et al., 2015). W. anomalus apresenta alta tolerância a diversos fatores de estresse (alta pressão osmótica, alta concentração de sais, etanol e metais pesados), característica desejada em uma levedura para produção de etanol de segunda geração (Mukherjee et al., 2017). Essa levedura também é utilizada para produção de álcool a partir de material complexo como palha de trigo seca (Passoth et al., 2013).
1.3 Objetivos
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a levedura Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, isolada de dorna de fermentação de cachaça, capaz de utilizar eficientemente o glicerol como única fonte de carbono, através do isolamento e caracterização do transportador de glicerol de alta afinidade e do sequenciamento do seu genoma. Estratégias de engenharia genética foram paralelamente utilizadas em Saccharomyces cerevisiae BY4741, com intuito de otimizar o consumo de glicerol e obter a sua conversão em etanol.
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2 CARACTERIZAÇÃO DO METABOLISMO DE GLICEROL EM Wickerhamomyces anomalus: TRANSPORTADOR E PRODUÇÃO DE ETANOL
O potencial biotecnológico de um microrganismo é diretamente influenciado pela sua eficiência metabólica em relação a um determinado substrato (Thomik et al., 2017). Além de possuir um metabolismo rápido e fortemente regulado, o sistema de transporte desse substrato deve ser eficiente, proporcionando fluxos metabólicos não-limitantes e regulados. Desta forma, o presente trabalho objetivou caracterizar a habilidade de transporte e consumo de glicerol em W. anomalus LBCM1105. Um novo gene STL1 foi identificado, WaSTL1. Este transportador funciona como um H+/simporte de glicerol com mais de duas
vezes a afinidade do homólogo em S. cerevisiae, é reprimido pela glicose e desreprimido/induzido pela presença de glicerol em concentrações distintas das observadas em S. cerevisiae. Além disso, a produção de etanol foi observada durante o crescimento em aerobiose de W. anomalus em glicerol puro, provavelmente fornecendo uma compensação redox para a respiração resistente ao cianeto (CRR - cyanide resistant respiration). A utilização do glicerol mais eficiente parece derivar não apenas da alta afinidade do transportador WaStl1p combinado com sua maior expressão, mas também pela produção aeróbica de etanol. O presente trabalho abriu caminho para uma melhor compreensão do metabolismo de W. anomalus, bem como para a
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possibilidade de otimizar seu crescimento em resíduos de glicerol para aplicação industrial. O trabalho desenvolvido está apresentado a seguir no artigo “High affinity transport, cyanide-resistant respiration and ethanol production under aerobiosis underlying efficient high glycerol consumption by Wickerhamomyces anomalus“ (Cunha et al., 2019).
2.1 Artigo: “High affinity transport, cyanide-resistant respiration and ethanol production under aerobiosis underlying efficient high glycerol consumption by Wickerhamomyces anomalus”
25 2.2 Errata
Correction to High affinity transport, cyanide-resistant respiration and ethanol production under aerobiosis underlying efficient high glycerol consumption by Wickerhamomyces anomalus
Aureliano Claret da Cunha1, Lorena Soares Gomes1, Fernanda Godoy-Santos1,
Fábio Faria-Oliveira1, Janaína Aparecida Teixeira1, Geraldo Magela Santos
Sampaio1, Maria José Magalhães Trópia1, Ieso Miranda Castro1, Cândida
Lucas2, Rogelio Lopes Brandão1#
1Laboratório de Biologia Celular e Molecular, NUPEB, Universidade Federal de
Ouro Preto, MG, Brasil; 2Instituto de Ciência e Inovação em
Bio-Sustentabilidade (IB-S)/ Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA), Universidade do Minho, Portugal.
# Corresponding author
LBCM/NUPEB, Universidade Federal de Ouro Preto, Campus do Morro do Cruzeiro - 35.400-000, Ouro Preto, MG, Brasil. Email: rlbrand@nupeb.ufop.br, Phone: +55 31 3559 1723.
Correction to:
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology https://doi.org/10.1007/s10295-018-02119-5
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The original version of this article contained two mistakes.
1. The equation of conversion of glycerol to ethanol mentioned in the first section of the Results and Discussion, should read as follows:
C3H8O3 + 1/2O2 → C2H5OH + CO2 + H2O,
2. In Figure 2B, the legends mentioning Ethanol Production, Biomass produced (dry weight) and Glycerol Consumed should be interchanged. A correct version of the figure follows:
Fig. 2 Growth of W. anomalus LBCM1105 and S. cerevisiae BY4741 on glycerol. a Batch cultures with an air/liquid ratio of 5:1 and different concentrations of glycerol (% w/v) were used to estimate the specific growth rate during the log phase. Controls in 2% glucose are also presented. Cells were grown in YNB (light-gray bars) or YP (dark-gray bars). The results represent the average and standard deviation of at least two independent assays. Different letters represent a statistically significant difference with p < 0.05 (Tukey’s test). BY4741 was not able to grow in 10% glycerol. b W. anomalus LBCM1105 biomass and ethanol production and glycerol consumption after 72 h of culture in YP with 3% glycerol (light-gray bars) or YP with 5% glycerol (darkgray bars). The results represent the average and standard deviation of at least two independent assays. There was no statistical difference between the results obtained in each medium
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3 SEQUENCIAMENTO DO GENOMA DA Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, ISOLADA DE DORNAS DE FERMENTANÇÃO DE CACHAÇA
W. anomalus LBCM1105, reconhecida pela sua habilidade de consumir glicerol, foi sequenciada. Tamanho, cobertura e estatísticas do genoma foram determinados. A espécie foi confirmada por análise filogenética multiloci. Proteínas idênticas a S. cerevisiae, putativamente responsáveis pelo metabolismo de glicerol foram localizadas no genoma da LBCM1105. Todo o trabalho desenvolvido está apresentado no artigo: “Draft genome sequence of Wickerhamomyces anomalus LBCM1105, isolated from cachaça fermentation”, submetido para a Revista Genetics and Molecular Biology, apresentado a seguir.
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4 ENGENHARIA GENÉTICA DE Saccharomyces cerevisiae PARA PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE GLICEROL
4.1 REVISÃO DA LITERATURA
4.1.1 Metabolismo e transporte de glicerol em S. cerevisiae
Microrganismos, tais como leveduras, bactérias e algas, são elementos fundamentais de numerosos processos industriais, que vão desde a produção de bebidas e alimentos fermentados tradicionais até proteínas recombinantes e outras moléculas de alto valor agregado (Steensels et al., 2014). Muitos desses processos industriais utilizam leveduras da espécie S. cerevisiae. Esta levedura é utilizada tradicionalmente na indústria alimentícia para a produção de bebidas alcoólicas, tais como cerveja, vinho e saquê, bem como na fermentação de massas para a panificação. Além disso, essa levedura é utilizada tanto na indústria do bioetanol como também na produção de diversos compostos heterólogos, tais como a insulina humana, vacinas de hepatite, entre outros (Hou et al., 2012).
Com aumento da oferta de glicerol proveniente de biodiesel, e consequente redução no custo desse substrato, estudos estão sendo conduzidos em S. cerevisiae com o intuito de aumentar seu catabolismo de glicerol (Klein et al., 2016a; Klein et al., 2016b; Swinnen et al., 2016; Ho et al., 2017), ou convertê-lo em produto de maior valor agregado, como 1,2-propanodiol (Islam et al., 2017),
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xilitol (Kogje e Ghosalkar, 2017) e etanol (Yu et al., 2010a). O sucesso de processos biotecnológicos baseados no consumo de glicerol proveniente do biodiesel depende da disponibilidade de microrganismos que sejam fáceis de manipular industrialmente, e que sejam GRAS (Generally Regarded as Safe), não constituindo um perigo para o manipulador ou para a saúde pública em geral. O microrganismo será ideal se for também de fácil manipulação genética (Yazdani e Gonzalez, 2007). S. cerevisiae, além de ser um microrganismo de ampla aplicabilidade na biotecnologia industrial devido à sua robustez em processo (Swinnen et al., 2013), é uma espécie relativamente fácil de manipular geneticamente. Estas características aliadas ao fato de esta levedura estar amplamente licenciada em todo o mundo para os mais variados processos industriais, fazem de S. cerevisiae a priori uma candidata incontornável para qualquer processo biotecnológico. As vantagens de usar S. cerevisiae são sempre ponderadas em confronto com a aplicabilidade de um microrganismo selvagem, cujo licenciamento pode não ser sequer possível, dependendo das leis de cada país. Desta forma se justifica a exploração do potencial de S. cerevisiae para o consumo de glicerol e a sua conversão em produtos de alto valor agregado acima mencionados.
A via do glicerol é importante para o equilíbrio redox da célula e síntese de lipídios (Figura 2), sendo o principal soluto compatível em leveduras, e o único que S. cerevisiae produz (Nevoigt e Stahl, 1997). O seu acúmulo é assim crucial para a sobrevivência em altas concentrações de açúcar e de sal (Hohmann, 2009). Além disso, a acumulação de glicerol é também necessária para a célula sobreviver a temperaturas altas (37 ºC) (Siderius et al., 2000), em anaerobiose e estresse oxidativo (Pahlman et al., 2001b). A síntese de glicerol
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em leveduras inicia pela redução da dihidroxiacetona-fosfato (DHA-P) a glicerol-3-fosfato (G3P) que é catalisada por uma de duas desidrogenases citosólicas dependente de NADH, glicerol-3-fosfato desidrogenases, codificadas pelos isogenes GPD1 e GPD2. Em seguida o G3P é desfosforilado por uma de duas isoenzimas glicerol-3-fosfatase, codificadas pelos isogenes GPP1 e GPP2 (Nevoigt e Stahl, 1997) (Figura 2). A principal função biológica da Gpd2p é o balanceamento redox da célula, enquanto Gpd1p atua na resposta ao estresse osmótico. Estudo com mutantes gpd1∆ e gpd2∆ revelaram que existe diferença marcante sobre como as proteínas Gpd1p e Gpd2p são capazes de se complementar. Gpd2p pode ser complementada por Gpd1p, ao passo que Gpd2p é menos eficiente em complementar o papel de Gpd1p. (Hubmann et al., 2011). Já as isoformas Gpp1p e Gpp2p são capazes de se complementar entre si. GPP1 e GPP2 são induzidos em condições de estresse hiperosmótico, sendo esta indução dependente da via de sinalização HOG (high osmolarity glycerol) (Pahlman et al., 2001a).
A conversão de DHA-P a glicerol-3-fosfato (G3P) reoxida o NADH, renovando o pool de NAD+ e dessa forma promovendo o equilíbrio redox celular (Tamás e
Hohmann, 2003). Culturas fermentativas de S. cerevisiae produzem glicerol para reoxidar o excesso de NADH gerado durante a biossíntese de aminoácidos e ácidos orgânicos, uma vez que a atividade mitocondrial é limitada pela disponibilidade de oxigênio e a produção de etanol é um processo redox neutro (Van Dijken e Scheffers, 1986; Rigoulet et al., 2004). Desta forma, a produção de glicerol é favorecida, o que o torna o maior subproduto no processo de produção de etanol. Consistentemente, um mutante sem a
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expressão da enzima glicerol-3P desidrogenase (gpd1∆gpd2∆), não é capaz de crescer em condições anaeróbias (Ansell et al., 1997; Pahlman et al., 2001b).
Figura 2 – Transporte e metabolismo de glicerol em S. cerevisiae acoplado às principais vias metabólicas. DHA – Dihidroxiacetona; DHA-P – Dihidroxiacetona fosfato; GA3P – Gliceraldeído-3 fosfato; TPP – Tiamina Pirofosfato; TCA – Ciclo do ácido cítrico. Adaptado de Tulha et al. (2012).
Em condições de estresse osmótico, a produção de glicerol é estimulada tanto por regulação metabólica quanto pela expressão gênica dependente da via de sinalização HOG (Bouwman et al., 2011). Além disso, a retenção de glicerol no citoplasma é obtida mediante o fechamento do canal de glicerol Fps1p (Luyten et al., 1995; Tamás et al., 1999). Este canal é uma aquagliceroporina da família
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MIP que, ao contrário das outras proteínas da mesma família, não permeia água, mas permeia glicerol e vários outros compostos, como xilitol, ácido acético, arsenito e antimonito (Tamás et al., 1999; Wysocki et al., 2001; Mollapour e Piper, 2007; Wei et al., 2013). Fps1p funciona como um homotetrâmero e o controle de sua atividade envolve um par de reguladores específicos, Rgc1p e Rgc2p (reguladores do canal de glicerol), e a MAPK (mitogen-activatd protein kinase) Hog1p. Na ausência de estresse, Rgc1p e Rgc2p mantêm o canal Fps1p aberto ligando-se ao seu domínio citoplasmático C-terminal (Lee et al., 2013). Em resposta ao choque hiperosmótico, Rgc1p e Rgc2p são fosforilados em múltiplos locais pela MAPK Hog1p. Essas fosforilações causam o desligamento de Rgc1p e Rgc2p de Fps1p, permitindo assim o fechamento do canal (Lee e Levin, 2015). Em condições de estresse hiposmótico Fps1p é fosforilado pela proteína Ypk1p dependente de TORC2 (target of rapamycin complex 2), o que faz com que o canal fique aberto, permitindo a liberação de glicerol (Muir et al., 2015). Apesar de todas esta regulação, o principal papel fisiológico associado ao canal Fps1 parece ser o de promover a rápida saída de glicerol perante um choque hipo-osmótico (Tamás et al., 1999).
O transporte de glicerol exógeno é a primeira etapa para o seu consumo pela célula. S. cerevisiae capta glicerol, através do canal Fps1p como foi referido acima, mas também através do sistema de transporte ativo Stl1p(Ferreira et al., 2005). Stl1p é um H+/glicerol simporte, específico para glicerol, de elevada
afinidade e membro da família de transportadores de açúcares (Rep et al., 2000; Ferreira et al., 2005). Ao contrário do FPS1 que é supostamente expresso constitutivamente, embora estudo tenha previsto a intervenção de
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regulador transcricional (Mig1p) (Aburatani, 2011), o STL1 é regulado de forma muito complexa. A expressão do gene STL1 é reprimida em nível transcricional pela glicose (Ferreira et al., 2005; Kayingo et al., 2009), e desreprimida pelo crescimento em substratos respiráveis e durante a transição do metabolismo fermentativo para respiratório, como acontece durante a mudança diaúxica no final do crescimento exponencial em fontes ricas de carbono. Sob estresse hiperosmótico o STL1 é também o gene mais expresso (Rep et al., 2000). A temperaturas supra-ótimas, como por exemplo a 37 ºC, o STL1 é expresso mesmo na presença de glicose (Ferreira e Lucas, 2007).
Ao contrário da produção de glicerol, o seu consumo como a única fonte de carbono é possível por muitas leveduras (Swinnen et al., 2013) mas não por S. cerevisiae, que consome glicerol com baixa eficiência. Tentativas de melhorar o crescimento de S. cerevisiae em glicerol incluem a utilização de suplementos como por exemplo peptona (0,05 %) (Ronnow e Kielland-Brandt, 1993; Ferreira et al., 2005), extrato de levedura (0,1 %) e bacto peptona (0,075 %) (Juszczyk e Rymowicz, 2009), extrato de levedura (1%) e peptona (2%) (Taccari et al., 2012), ou 0,2 % de glicose (Lages e Lucas, 1997; Sutherland et al., 1997). Estes suplementos são facilmente utilizáveis em laboratório, mas do ponto de vista biotecnológico tornar-se-iam impraticáveis ou onerosos. Além disso, a eficiência da utilização do glicerol mesmo nessas condições é genericamente muito baixa. Assim, qualquer processo que permita um aumento substancial desta eficiência é à partida de grande interesse comercial.
O glicerol pode ser catabolizado por duas vias metabólicas diferentes – a via do glicerol-3-fosfato (denominada neste trabalho como Via G3P) e a via da
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dihidroxiacetona (denominada como Via DHA). As equações globais das sequências metabólicas das duas vias são similares (Klein et al., 2017):
Via G3P: Glicerol + ATP + FAD + 2H++ 2e- GA3P + FADH2 + ADP + Pi
Via DHA: Glicerol + ATP + NAD(P)++ H+ + 2e- GA3P + NAD(P)H + ADP + Pi
A via G3P é principal via do catabolismo de glicerol em S. cerevisiae (Pavlik et al., 1993; Swinnen et al., 2013). Nesta via, o glicerol é fosforilado a glicerol‐3‐ fosfato (G3P), pela enzima glicerol quinase (Gut1p), que por sua vez é convertido a dihidroxiacetona‐fosfato (DHAP), um metabólito da via glicolítica, pela enzima FAD+ dependente, G3P desidrogenase (Gut2p), presente na
membrana mitocondrial (Figura 2). O G3P é em parte canalizado para a síntese de lipídeos (Matsuzawa et al., 2010). Na presença de glicose, os genes GUT1 e GUT2 estão sob repressão catabólica (Pavlik et al., 1993; Ronnow e Kielland-Brandt, 1993). Embora ocorra síntese de glicerol durante o consumo de glicose, como mencionado acima, o seu consumo é reprimido, e só ocorre em células desreprimidas pelo consumo de fontes de carbono respiráveis como etanol, lactato, acetato, ácido oleico ou o próprio glicerol (Grauslund et al., 1999). A repressão da síntese de Gut1p depende dos fatores de transcrição ADR1 (Pavlik et al., 1993), Ino2p e Ino4p, enquanto a sua desrepressão é dependente de Opi1p (Grauslund et al., 1999). Ainda, mediador da repressão por glicose Mig1p exerce efeito na repressão de GUT1, embora menor (Jin et al., 2007). Análise transcricional de GUT2 confirmou a repressão do gene por glicose e desrepressão do gene por fontes de carbono não fermentescíveis
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como glicerol, lactato e etanol. Desrepressão de GUT2 requer a proteína quinase Snf1p, assim como o complexo proteico Hap2/3/4/5, regulador de largo espectro da expressão ligada ao metabolismo respiratório (Grauslund e Ronnow, 2000). Além disso, a repressão por glicose requer o regulador negativo Opi1p (Grauslund e Ronnow, 2000). A Gut2p catalisa a reação contrária à da Gpd1p, estando a primeira localizada na membrana interna da mitocôndria e a segunda no citoplasma. As duas perfazem um shuttle de G3P que permite a transferência de redutores equivalentes do citoplasma para a mitocôndria durante o metabolismo aeróbico (Ronnow e Kielland-Brandt, 1993; Grauslund e Ronnow, 2000).
A outra via de catabolismo do glicerol é a via DHA, onde o glicerol é convertido a dihidroxiacetona (DHA), pela enzima glicerol desidrogenase (Gcy1p), e em seguida fosforilada a DHA-P, por uma das isoenzimas di‐hidroxiacetona quinase Dak1p ou Dak2p (Figura 2). A DHA-P é então convertida a gliceraldeído-3-fosfato (GA3P), por ação da enzima triose-fosfato isomerase (Tpi1p), que entra na via glicolítica (Figura 2) (Tamás e Hohmann, 2003; Vilaprinyo et al., 2006). Somente poucas espécies de leveduras possuem a Via DHA do catabolismo de glicerol. Em S. cerevisiae esta via parece ser de menor importância, pelo menos em relação ao consumo de glicerol, uma vez que a remoção de qualquer um dos genes GUT1 ou GUT2, por mutação ou deleção em cepas laboratoriais, resultou na supressão quase completa do crescimento em glicerol (Nevoigt e Stahl, 1997; Swinnen et al., 2013). Por outro lado, a Via DHA parece ser induzida durante estresse osmótico em S. cerevisiae sugerindo que glicerol é metabolizado por esta via nessa condição, e que esta
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via está sob fina regulação dependente do conteúdo intracelular de glicerol (Nevoigt e Stahl, 1997).
4.1.2 Metabolismo fermentativo
Em S. cerevisiae, a glicose é uma fonte de carbono fermentescível para S. cerevisiae, isto é, na presença deste açúcar, o metabolismo da levedura é principalmente (mas não exclusivamente) fermentativo, e o produto do processo fermentativo é o etanol. Além disso, a glicose é a fonte de carbono preferida para S. cerevisiae. Células crescendo em meio contendo apenas este açúcar reprimem a expressão de genes que codificam produtos necessários para o metabolismo de outras fontes de carbono, o que é denominado de repressão por glicose ou repressão catabólica (Gancedo, 1998; Jin et al., 2007).
Em leveduras, o piruvato constitui um entroncamento de reações catabólicas e anabólicas, bem como de ramificação entre a dissimilação respiratória de açúcares e a fermentação alcoólica. Sob repressão catabólica a enzima piruvato descarboxilase está up-regulated, enquanto a piruvato desidrogenase está down-regulated, sendo o contrário observado na presença de substratos não fermentescíveis como etanol, glicerol e acetato (Pronk et al., 1996).
Fermentação de glicerol a etanol em anaerobiose foi descrita na bactéria Escherichia coli (Dharmadi et al., 2006; Gonzalez et al., 2008), que também foi modificada geneticamente para produzir metabólitos de alto valor agregado, como 1,3-propanodiol ou ácido succínico, e combustíveis, como o etanol e H2
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manipulação do metabolismo do glicerol objetivaram a redução da sua produção como um subproduto da fermentação de açúcar (Nissen et al., 2000; Hou e Vemuri, 2010; Ochoa-Estopier et al., 2011), enquanto que as estratégias para aumentar o consumo de glicerol têm focado no aumento da respiração (Raab et al., 2011) e na produção de biomassa (Merico et al., 2011; Tulha et al., 2012). A utilização da levedura para fermentar glicerol em etanol já foi tentada (Yu et al., 2010a; Yu et al., 2010b), tendo sido obtido 0,56% v/v de concentração final de etanol no meio fermentado. Embora o conceito de que a produção de etanol a partir de glicerol por S. cerevisiae tenha sido demonstrado, a produção associada é demasiado baixa para despertar qualquer interesse de aplicação prática. Cepas utilizadas industrialmente na fermentação e sacarose de cana de açúcar atingem valores acima de 19% v/v, como é o caso da cepa de S. cerevisiae PE-2 (Pereira et al., 2011). Desta forma, o desenvolvimento eficaz da fermentação de glicerol a etanol ainda não foi alcançado.
4.1.3 Estratégias de engenharia genética
A engenharia genética está relacionada à manipulação artificial, modificação, e recombinação de DNA ou outro ácido nucléico em ordem de modificar um organismo, ou seja, a manipulação direcionada da informação genética de uma célula. Funções enzimáticas, de transporte e reguladoras são o alvo de modificações genéticas dirigidas para se atingir o melhoramento de atividades específicas das células (Nevoigt, 2008). Entre as ferramentas de biologia molecular que podem ser utilizadas em engenharia genética estão a utilização
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de cepas e vetores que permitem rápida transformação com eficiência razoável, acesso a promotores que apresentam forças diferentes, fortes ou fracos, deleção ou silenciamento de genes, entre outras (Nielsen, 2001).
Quando o objetivo é aumentar a expressão de determinados genes, a disponibilidade de promotores fortes é desejada (Nielsen, 2001). Um promotor forte é aquele que promove a produção de grande quantidade mRNA do gene que controla e consequentemente da respectiva proteína, independentemente de ser ou não regulado, pela fonte de carbono, de nitrogênio, por condições de estresse, etc. (Waterham et al., 1997). Promotores glicolíticos são geralmente uma boa escolha como promotores fortes, que é o caso do promotor do gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TDH3), promotor GAP, também denominado promotor GPD, que já foi clonado em muitos microrganismos diferentes (Nielsen, 2001). Este promotor, além de forte é desregulado, assegurando assim expressão génica em qualquer condição e crescimento.
Em S. cerevisiae, o glicerol seria naturalmente respirado. Com o intuito de aproveitar glicerol, como matéria prima para produção de bioetanol, é necessário que se altere o metabolismo da levedura para que glicerol seja fermentado, o que pode ser atingido com a engenharia genética. Sendo assim, no presente trabalho adotou-se como estratégia reunir na mesma cepa: (i) a sobrexpressão de Pdc2p pela substituição de seu promotor endógeno pelo promotor GAP, (ii) a sobrexpressão do transportador de glicerol Stl1p através da inserção de uma segunda cópia integrada ao genoma e (iii) a sobrexpressão de Gut1p pela inserção de uma segunda cópia em plasmídeo centromérico, ambas também sob o controle do promotor GAP.
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PDC2 é um gene que codifica o fator de transcrição Pdc2p (925 aminoácidos), necessário para a expressão de duas isoformas da piruvato descarboxilase, PDC1 e PDC5 (Figura 3). A expressão do principal gene estrutural para a piruvato-descarboxilase, PDC1, é fortemente reduzida em mutantes pdc2 enquanto a transcrição do gene PDC5, geralmente expresso de forma mais fraca, parece ser totalmente abolida. No entanto, a indução por glicose na atividade da piruvato descarboxilase não é afetada. Assim, PDC2 é importante tanto para um elevado nível de expressão basal da piruvato descarboxilase, quanto desempenha um papel positivo na auto regulação que controla a expressão de PDC1 e PDC5 (Hohmann, 1993). Pdc2p é também um regulador de genes que codificam enzimas do metabolismo de tiaminapirofosfato (TPP), importante cofator da piruvato descarboxilase. Pdc2p é um regulador chave do THI regulon necessário para a regulação positiva de genes sob controle da disponibilidade de tiamina (Mojzita e Hohmann, 2006). Com a sobrexpressão da Pdc2p espera-se então aumento da concentração e atividade da piruvato descarboxilase e consequentemente um favorecimento da conversão de glicerol em etanol.
O objetivo da sobrexpressão de STL1 e GUT1 é proporcionar o aumento dos níveis intracelulares de GA3P (Figura 3). Desta forma a acumulação de G3P poderá levar ao seu consumo no sentido de repor o equilíbrio na célula, prevendo‐se a sua conversão em DHA-P e consequente entrada na via glicolítica (Figura 3). Espera‐se que isto favoreça a glicólise e leve a um aumento dos níveis de piruvato, fundamental na produção do bioetanol. Com a sobrexpressão da Pdc2p o piruvato pode ter então seu fluxo metabólico direcionado no sentido da produção de etanol (Figura 3).
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Figura 3 – Estratégia de engenharia genética para conversão de glicerol em etanol. Em vermelho estão apresentados os genes que serão sobrexpressos: STL1, GUT1 e PDC2, sendo o último um fator de transcrição que influencia indiretamente o fluxo de produção de etanol (Pdc1p, Pdc5p e Thi10p). O fluxo para conversão de glicerol a etanol, desde a captação de glicerol pela célula, está representado em caixas e setas verdes, onde DHA-P – Dihidroxiacetona fosfato e GA3P – Gliceraldeído-3 fosfato. Adaptado de Tulha et al. (2012).
52 4.2 OBJETIVOS
4.2.1 Geral
Otimizar o consumo e a conversão de glicerol em Saccharomyces cerevisiae através do uso de estratégias de engenharia genética.
4.2.2 Específicos
- Isolar os genes GUT1 e STL1 de S. cerevisiae BY4741 e cloná-los em vetor p416GAP CYC, sob a regulação de um promotor constitutivo forte, obtendo as
construções p416GAPSTL1CYC e p416GAPGUT1CYC.
- Avaliar o resultado da substituição do promotor endógeno do gene PDC2 pelo promotor GAP em BY4741, utilizando como marcador de resistência à geneticina (BY4741 KMXGAPPDC2).
- Caracterizar a sobrexpressão do gene STL1 pela inserção de uma segunda cópia no genoma da BY4741 KMXGAPPDC2 no locus do gene HIS3, silenciado
na cepa original, conferindo ao mutante fenótipo his+, BY4741
HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2
- Avaliar a sobrexpressão do gene GUT1 pela inserção de uma segunda cópia em plasmídeo centromérico sob regulação do promotor constitutivo forte GAP na cepa BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2, para obtenção da cepa com
sobrexpressão dos três genes alvos, STL1, GUT1 e PDC2, BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2 p416GAPGUT1CYC.
- Determinar a taxa de crescimento em meio líquido a partir de glicerol puro das cepas BY4741 e recombinantes.
53 4.3 METODOLOGIA
4.3.1 Microrganismos e condições de cultivo
As leveduras BY4741 (Euroscarf - MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0) e BY4741 stl1∆ (Euroscarf - MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0; YDR536w::kanMX), foram usadas nos procedimentos de clonagem dos genes de interesse, bem como nos procedimentos de sobrexpressão. As leveduras foram cultivadas a 30 °C em YP (1% p/v de extrato de levedura, 2% p/v peptona) ou no meio mínimo SD (0,67% p/v de Yeast Nitrogen Base without aminoacids), suplementado com aminoácidos e bases nitrogenadas segundo descrito previamente (Sherman, 2002), exceto uracila. Como fonte de carbono foram utilizados glicose (0,3 ou 2% p/v) ou glicerol (5% p/v). Meio líquido foi preparado em tampão citrato/fosfato com pH 4,0 (para 100 mL de tampão, foram homogeneizados 61,45 mL de ácido cítrico 0,1 mol/L com 38,55 mL de Na2HPO4 0,2 mol/L, tendo o sido o pH aferido e corrigido para 4,0, quando
necessário). Para meios sólidos, 2% p/v de ágar foram adicionados aos meios de cultura. Os mutantes BY4741 HIS3GAPSTL1CYCKMXGAPPDC2 foram
selecionados e mantidos em meio mínimo SD – His. A seleção e crescimento das estirpes transformadas com a cassete KanMX foi realizada em meio YPD suplementado com 200 µg/mL de geneticina. Transformantes selecionados foram estocados a -80 ºC em glicerol 40% p/v.
A estirpe Escherichia coli TOP10 (F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-) foi usada em procedimentos de biologia molecular. Células competentes de E. coli e as transformantes foram crescidas em meio
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Luria-Bertani (1% NaCl (p/v); 1% triptona (p/v); 0.5% extrato de levedura (p/v)), a 37 °C, com agitação, 200 rpm. Os transformantes foram crescidos em meio LB suplementado com ampicilina (100 µg/mL) para os protocolos de extração de DNA plasmidial. A seleção dos transformantes foi realizada em meio LB sólido (ágar 2% p/v) suplementado com ampicilina (100 µg/mL).
4.3.2 Extração de DNA total de S. cerevisiae
Colônias de S. cerevisiae foram inoculadas em 5 mL de meio seletivo e incubadas overnight sob agitação, 200 rpm, a 30 °C. No dia seguinte, as células foram recolhidas por centrifugação, 2 min a 9.000 rpm.
Após o descarte do sobrenadante, as células foram ressuspendidas em 200 µL do tampão I (1 M sorbitol; 100 mM EDTA‐Na2; pH 7,5) suplementado com 2,6 U
de liticase, e incubadas a 37 ºC durante 1 h. Seguiu‐se com a adição de 200 µL do tampão II (50 mM Tris‐HCl; 20 mM EDTA‐Na2; pH 7,4) e de 10 µL de SDS
(10% p/v). Após homogeneização, a suspensão foi incubada a 65 °C durante 5 min. Finalmente, foram adicionados 160 µL de tampão III (5 M acetato de potássio) e a suspensão foi incubada em banho de gelo por 30 min. Ao final, a suspensão foi centrifugada por 20 min, 12.000 rpm, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo onde foi adicionado igual volume de isopropanol. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente, procedeu‐se então à centrifugação a 12.000 rpm, 10 min, e ao final o sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com 30 µL de etanol (70% v/v), e repetiu‐se a centrifugação nas condições anteriores, sendo o sobrenadante descartado ao final. O etanol
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residual foi evaporado em estufa a 37 ºC e o pellet seco foi hidratado em 30 µL de água deionizada.
As amostras de DNA foram mantidas a -20 °C e utilizadas em ensaios de PCR para detecção da inserção das cassetes no genoma.
4.3.3 Amplificação por PCR
A clonagem e confirmação da presença dos genes de interesse foram realizadas por PCR utilizando um termociclador BioRad T100 Thermal Cycler, seguindo as condições padrões descritas pelos fornecedores. A Taq DNA polimerase foi utilizada para as reações de PCR utilizando as Mastermix preparadas segundo a Tabela 1. Nos ensaios de clonagem, 19,9 µL de Mastermix foram homogeneizados com 0,1 µL de DNA molde (< 1.000 ng), enquanto que nos ensaios de confirmação da presença dos genes de interesse, 19 µL de Mastermix foram homogeneizados com 1,0 µL de DNA total de levedura (< 1.000 ng) ou 1 µL de água e uma pequena quantidade de células transformadas de E. coli ou leveduras (Colony PCR), sendo as células aquecidas em micro-ondas, na potência máxima, por 2 min.
As amplificações das cassetes e genes de interesse foram realizadas com os primers apresentados na Tabela 2. O ciclo geral para reação de PCR para os diferentes genes/cassetes está descrito na Tabela 3, a temperatura de anelamento (30 s para primers curtos e 45 s para primers longos) e o tempo de extensão (1 min/1 kb) variaram para cada gene/cassete, sendo o programa alterado para cada situação. Utilizou-se água ultra pura como controle negativo e DNA purificado (1 µL) como controle positivo. A confirmação da inserção de
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genes em plasmídeo ou integração de cassetes no genoma da BY4741 foi realizada por amplificação com primers específicos (Tabela 2). Os produtos de PCR foram revelados em gel de agarose para confirmação da amplificação e purificados, quando necessário, para a clonagem ou sequenciamento.
Tabela 1 – Preparação das Mastermix para protocolos de clonagem e confirmação de presença dos genes de interesse (1 reação (Rx), 20 µL).
Componentes Concentração Final Clonagem (1 Rx) Confirmação da presença (1 Rx)
MgCl2 (50 mM) 2 mM 0,8 µL 0,8 µL
Tampão Taq (10x) 1x 2,0 µL 2,0 µL
Taq DNA polimerase 1,0 U/20 µL 0,1 µL 0,1 µL
dNTP mix (10 mM) 200 µM 0,4 µL 0,4 µL Primer Fw (10 µM) 0,2 µM 0,4 µL 0,4 µL Primer Rv (10 µM) 0,2 µM 0,4 µL 0,4 µL DNA molde (< 1.000 ng) < 50 ng/µL 0,1 µL 1,0 µL H2O Ultra pura - 15,8 µL 14,9 µL
4.3.4 Eletroforese em gel de agarose
As amostras de DNA e os produtos de PCR foram separados em gel de agarose (1,0% (p/v)), preparado em tampão TAE (40 mM Tris‐HCl; 20 mM ácido acético; 1 mM EDTA; pH 8,0) e corados com GelRed™. As amostras, assim como o marcador de pesos moleculares, foram pré‐misturadas com tampão de corrida 6x (0,25% azul de bromofenol (p/v); 30% glicerol (v/v)). A eletroforese foi realizada a 100‐120 V, usando um sistema de eletroforese, com tampão TAE. Os fragmentos foram visualizados no transiluminador (UV, 302 nm), sendo os géis revelados no sistema AlphaImage Mini (Alpha Innotech).
