Dados obtidos por eletroforese

O proteinograma modelo deste estudo identifica assim 5 frações proteicas: albumina, α1-globulinas, α2-globulinas, β-globulinas e γ-globulinas. É possível, no entanto, identificar claramente o pico correspondente à prealbumina (Figura 8).

CAPÍTULO IV – RESULTADOS

40 Figura 8 Proteinograma padrão obtido por eletroforese capilar de zona da Coruja-do-mato (Strix aluco) com o número V086/16. As diferentes frações foram identificadas como: Alb-albumina, α1-α1-globulinas, α2-α2- globulinas, β -β-globulinas e γ -γ-globulinas. É também visível o pico correspondente à prealbumina (círculo vermelho).

Em alguns dos proteinogramas obtidos foi possível identificar 2 picos nas frações das β-globulinas e das γ-globulinas (Figura 9).

Figura 9 Proteinograma padrão obtido por eletroforese capilar de zona da Coruja-do-mato (Strix aluco) com o número 2835/N550. As diferentes frações foram identificadas como: Pre-prealbumina, Alb-albumina, α1-α1- globulinas, α2-α2-globulinas, β1 e β2 - β-globulinas e γ1 e γ2 – γ-globulinas.

Os dados obtidos foram analisados estatisticamente sendo descritos quanto à média, mediana, máximo, mínimo e intervalo de referência para um intervalo de confiança de 90% (Tabela 5). Como o número de amostras se situa entre 40 e 120, os resultados apresentados para o intervalo de referência, foram calculados por via de estatística robusta, que por convenção deve utilizar métodos Bootstrap para o cálculo. Nas frações em cujo intervalo de referência encontrado pelos métodos standard e robustos foi amplo, o intervalo de referência foi calculado por métodos não-paramétricos.

γ α1 β Alb α2 γ1 β1 α2 α1 Alb γ2 Pre

41 Tabela 5 Valores de referência obtidos por eletroforese das proteínas plasmáticas da Coruja-do-mato (Strix aluco).* - Intervalo de referência calculado por métodos não paramétricos.

Parâmetro Unidade n Média Mediana Mínimo Máximo

Intervalo de referência (CI=90%) Proteínas totais (Biureto) g/dL 46 3,4 3,4 2,7 4,4 2,8-4,3 Pre +Albumina g/dL 46 1,8 1,8 1,27 2,44 1,2-2,4 α1-globulinas g/dL 46 0,2 0,2 0,08 0,49 0,0-0,5 α2-globulinas g/dL 46 0,5 0,3 0,13 1,2 0,1-1,2* β-globulinas g/dL 46 0,7 0,7 0,05 1,39 0,1-1,4 γ-globulinas g/dL 46 0,2 0,2 0,02 0,71 0,0-0,6 Rácio A/G - 46 1,1 1,1 0,57 1,97 0,6-1,9

A influência do género sobre os diferentes parâmetros foi testada com recurso ao teste t de Student e mostrou ser estatisticamente significativa (p=0,0437) apenas na fração das α1- globulinas (Tabela 6). A análise dos dados demonstra que em média, os machos neste estudo, apresentam valores mais elevados desta fração (Gráfico 3).

Tabela 6 Valor de p obtido pelo teste t de Student para as médias dos diferentes parâmetros segundo o género da Coruja-do-mato (Strix aluco).

Parâmetro Média Machos

(n=7)

Média Fêmeas (n=15)

Valor de p

Proteínas totais (Biureto) g/dL 3,6 3,4 0,27 Prealbumina+Albumina g/dL 1,9 1,9 0,53 α1-globulinas g/dL 0,3 0,2 0,04 α2-globulinas g/dL 0,5 0,3 0,13 β-globulinas g/dL 0,7 0,8 0,40 γ-globulinas g/dL 0,1 0,20 0,20 Rácio A/G g/dL 1,3 1,3 0,95

CAPÍTULO IV – RESULTADOS

42 Gráfico 3 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração das alfa 1-globulinas, segundo o género da Coruja-do-mato (Strix aluco).

Foi realizado um estudo para avaliação da existência de uma relação estatisticamente significativa entre a idade e os parâmetros mensurados. Deste modo os animais admitidos ao estudo foram alocados a três faixas etárias diferentes que correspondem a diferentes fases do desenvolvimento. Recorrendo ao teste de Tukey-Kramer HSD, demonstrou-se existir uma diferença significativa entre os valores médios de gamaglobulinas registados nas três classes etárias, sendo que a média dos valores registados na faixa etária dos 22 aos 45 dias apresenta uma diferença estatística altamente significativa em relação à média registada em adultos (p<0,0022), e significativa em relação à média dos valores registados na faixa etária dos 45 a 90 dias (p<0,0353). Não foi encontrada nenhuma diferença significativa entre os animais adultos e os juvenis permanentemente no exterior (p<0,749) (Gráfico 4).

43 Gráfico 4 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração das gama-globulinas, segundo a idade da Coruja-do-mato (Strix aluco).

A influência da idade nos parâmetros dentro de um determinado género, foi analisada com recurso ao teste t de Student, concluiu-se que existe uma diferença estatística altamente significativa em relação aos valores das gamaglobulinas registados em fêmeas entre os 22 e os 45 dias e os registados em fêmeas adultas (p<0,0001) (Gráfico 5). Nos machos, não foi encontrada qualquer correlação.

Gráfico 5 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração gamaglobulinas, entre crias e adultos fêmeas de Coruja-do-mato (Strix aluco).

CAPÍTULO IV – RESULTADOS

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Os valores obtidos para a média, mínimos e máximos foram comparados com os valores publicados por outros autores (Tabela 7).

Tabela 7 Comparação entre o presente estudo e outros estudos publicados para os valores da média, mínimo e máximo obtidos para cada parâmetro em proteinogramas de Coruja-do-mato (Strix aluco).

Estudo presente Spagnolo et a (2008)l Valente et al (2015)

Parâmetro Média Mínimo Máximo Média Mínimo Máximo Média Mínimo Máximo

Proteínas totais (Biureto) g/dL 3,4 2,7 4,4 3,9 3,3 5,4 3,3 2,6 4,5 Albumina g/dL 1,8 1,27 2,44 1,4 1,09 1,67 1,5 1.01 2,03 α1-globulinas g/dL 0,2 0,08 0,49 0,2 0,12 0,3 0,2 0.07 0,38 α2-globulinas g/dL 0,5 0,13 1,2 0,2 0,13 0,31 0,2 0,11 0,55 β-globulinas g/dL 0,7 0,05 1,39 1,1 0,64 2,06 1,04 0.7 1,55 γ-globulinas g/dL 0,2 0,02 0,71 0,5 0,19 0,72 0,4 0,02 0,98 Rácio A/G 1,1 0,57 1,97 0,7 0,5 1,2 1,1 0,6 1,12

45 5. CAPÍTULO V – DISCUSSÃO

A Coruja-do-mato (Strix aluco) é uma das aves de rapina noturnas mais comuns na Europa e em Portugal. Apesar desta espécie parecer bem adaptada às alterações antropogénicas dos ecossistemas, a sua taxa de sobrevivência é influenciada diretamente pela atividade humana. Desde a criação dos centros de recuperação de fauna selvagem que indivíduos desta e doutras espécies têm sido recolhidos, tratados e sempre que possível devolvidos à natureza. A falta de informação referente à biologia, fisiologia e patologias destes animais dificulta este trabalho de conservação, sendo essencial a recolha e publicação de valores de referência hematológicos e bioquímicos, de modo a permitir um maior nível de conhecimento aos clínicos envolvidos neste ramo da Medicina Veterinária.

A eletroforese das proteínas plasmáticas é um meio complementar de diagnóstico que pode ser muito útil na diferenciação dos estados inflamatórios agudos e crónicos e contribuir, a par da utilização de outros meios, para o estabelecimento de um diagnóstico e para o acompanhamento da evolução de uma determinada doença (Eckersall, 2008). O seu potencial para a deteção de alterações inflamatórias subclínicas torna-a uma ferramenta extremamente útil na avaliação clínica de animais selvagens, nos quais a expressão natural dos processos nosológicos é muitas vezes desconhecida (Cray & Tatum, 1998; Tatum, et al., 2000).

Na bibliografia, tanto quanto é conhecimento do autor, existem apenas dois trabalhos publicados referentes à eletroforese das proteínas plasmáticas em Corujas-do-mato. Em 2008 Spagnolo e colaboradores publicaram os valores obtidos por eletroforese em acetato de celulose, de 8 Corujas-do-mato saudáveis, adultas e de género indeterminado, pré devolução à natureza. Mais recentemente o autor apresentou os dados obtidos por eletroforese capilar em 38 amostras de plasma de Corujas-do-mato saudáveis com idades compreendidas entre os 20 e os 90 dias (Valente, et al., 2015).

No presente trabalho as amostras de sangue foram colhidas no dia ou dias seguintes da admissão dos animais. O objetivo desta colheita numa fase precoce do cativeiro prende-se com o facto de o conjunto de amostras destes animais refletir com mais exatidão a população selvagem. Apesar da admissão de animais selvagens nos Centros de Recuperação ser resultante de episódios stressantes para os animais, o que pode possivelmente influenciar a concentração das proteínas plasmáticas, este é um fator comum a todos os animais selvagens admitidos. A permanência em cativeiro pode conduzir à alteração das frações proteicas devido à influência

CAPÍTULO V – DISCUSSÃO

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de diversos fatores. Entre estes, a alteração da dieta (quer em qualidade, quer em quantidade), o aglomerado de animais e a exposição a agentes patogénicos, são deveras os mais importantes. Vários estudos demonstram que a qualidade e a quantidade do alimento influenciam diretamente o perfil proteico plasmático (Polat, et al., 2000; Leveille & Sauberlich, 1961; Wang, et al., 2017). Um estudo realizado com várias aves de rapina admitidas num centro de recuperação demonstrou um aumento efetivo das proteínas totais, ao longo do tempo, em todos os animais durante o período de cativeiro. No entanto, não foi realizada a eletroforese das proteínas plasmáticas de modo a inferir a influência de uma dieta de coelho e frango sobre as diferentes frações proteicas (Ferrer, et al., 1987). O efeito do stresse contínuo sobre as proteínas totais plasmáticas foi estudado em aves de produção, concluindo-se que a densidade de animais e o espaço físico vital são fatores a ter em conta no bem-estar de cada animal, sendo que as condições ideais variam consoante a espécie (Gomes, et al., 2014).

A determinação da concentração das proteínas plasmáticas totais é essencial para a aferição das concentrações de cada fração a partir do perfil eletroforético. O método do biureto deve ser o eleito para esta determinação. No presente trabalho os valores médios registados para a concentração das proteínas totais encontram-se dentro do intervalo descrito por Spagnolo e colaboradores (2008) e Valente e colaboradores (2015), para a mesma espécie, e também dentro do intervalo de referência publicado para várias espécies de Strigiformes (Ammersbach, et al., 2015). No entanto, o Intervalo de referência difere dos limites máximos e mínimos apresentados por Spagnolo e colaboradores (2008). O número reduzido de animais utilizados nesse estudo, bem como o facto de as amostras terem sido colhidas após meses de cativeiro podem estar na origem desta discrepância entre intervalos.

A albumina é a proteína em maior concentração no plasma da maioria dos vertebrados estudados. Os valores médios de albumina obtidos neste estudo, bem como os do intervalo de referência são superiores aos apresentados por Spagnolo e colaboradores (2008). A explicação para esta diferença pode residir na inclusão da fração referente à prealbumina na fração da albumina. Comparando a soma dos valores médios de ambas as frações com o valor da albumina obtido no presente estudo, verificamos que se assemelham. Outro fator que pode influenciar o resultado é o facto de terem sido utilizadas técnicas eletroforéticas diferentes o que pode dar origem a perfis eletroforéticos diferentes. Relativamente aos valores publicados por Valente e colaboradores (2015), os valores do presente estudo são ligeiramente mais elevados. A ausência de animais adultos poderia justificar os valores mais baixos de albumina

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registados por Valente e colaboradores (2015) uma vez que a bibliografia consultada descreve um aumento gradual da concentração de albumina até à idade adulta, altura a partir do qual se mantém estável até à idade geriátrica (Eckersall, 2008). No entanto, no presente estudo não foram encontradas diferenças significativas entre as diferentes faixas etárias em relação à concentração de albumina. Apesar de ambos estudos terem sido realizados no mesmo modelo de eletroforese capilar, a análise foi efetuada em laboratórios diferentes, podendo residir na metodologia de processamento a diferença encontrada para as médias.

As alfa1-globulinas apresentam um perfil diferente em várias espécies. Em aves de rapina diurnas estão descritas como uma fração cujo o pico ombreia com a albumina, já no Papagaio-cinzento-africano, a sua expressão é diminuta (Cray, et al., 2007). Esta fração também parece suscetível a alterações do perfil quando a eletroforese é processada por métodos diferentes (Roman, et al. 2013). Os dados obtidos neste trabalho, revelam uma fração com concentrações baixas de proteínas. A média é idêntica à descrita nos estudos consultados, o intervalo de referência calculado está muito próximo também dos valores mínimos e máximos obtidos nesses estudos. Uma diferença estatisticamente significativa foi encontrada entre machos e fêmeas neste estudo, para esta fração. O mesmo tipo de diferença estatística foi descrito em Abutre-preto (Almeida, 2012). Esta diferença pode ser resultante do facto do grupo dos machos ser reduzido, pelo que serão necessários mais estudos com um número mais elevado de animais, bem como com um número mais similar de machos e de fêmeas, de modo a discernir se esta diferença é real ou não.

A fração das alfa 2-globulinas nas aves é diretamente influenciada pela concentração de α2-macroglobulina (Cray & Tatum, 1998). O aumento da concentração desta macroglobulina é muitas vezes associada a doença renal, o seu grande tamanho torna-a menos predisposta a ser perdida por alterações da permeabilidade renal, ao contrário de outras globulinas (Cray & Tatum, 1998). A sua concentração em aves de rapina saudáveis parece ser mais elevada do que em outros grupos de aves estudados, podendo atingir concentrações a rondar os 0,9g/dL. Neste trabalho a média da concentração das alfa2-globulinas e o intervalo de referência calculado são mais elevados do que nos outros estudos consultados. Apesar de existirem várias mensurações acima dos limites máximos encontrados em outros estudos, os vários testes estatísticos realizados não os identificaram como sendo resultados aberrantes, sendo que as indicações da International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) e Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), referem a manutenção dos valores extremos não

CAPÍTULO V – DISCUSSÃO

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aberrantes, quando os indivíduos são considerados saudáveis (Friedrichs, et al., 2012), estes foram considerados para a elaboração dos intervalos de referência. A análise estatística efetuada demonstrou não existir qualquer diferença estatisticamente significativa entre os subgrupos relacionados com a idade ou com o género para este parâmetro.

A fração das beta-globulinas inclui proteínas como a ovotransferrina, as β- lipoproteínas, as proteínas do complemento e as imunoglobulinas IgA e IgM (Cray & Tatum, 1998; Cray, et al., 2007; Mellilo, 2013). Estudos realizados em aves de rapina demonstraram que esta fração apresenta normalmente valores mais elevados para estas espécies do que em outros grupos de aves, podendo atingir os 1,9 g/dL (Cray & Tatum, 1998). Os valores obtidos neste estudo para esta fração contrariam esta afirmação sendo também inferiores, quer em relação à média, quer em relação aos intervalos de referência, aos valores publicados em outros estudos realizados na espécie alvo. Não foi identificada qualquer influência do género nas concentrações proteicas desta fração, no entanto, não foram incluídas neste estudo animais com sinais evidentes de se encontrarem em atividade reprodutiva. Estudos em psitacídeos identificaram picos na fração das β-globulinas em fêmeas, durante a época reprodutiva, ligados ao aumento das concentrações de ovotransferrina e de percursores das proteínas da gema (Cray, 1997). Seria necessário efetuar estudos incluindo fêmeas e machos durante a época reprodutiva de modo a compreender se o mesmo efeito é comum à Coruja-do-mato. A idade parece também não influenciar estatisticamente a concentração de β-globulinas.

A fração das γ-globulinas é referida usualmente nas aves como uma fração com baixas concentrações proteicas em animais saudáveis (Mellilo, 2013). O presente estudo vai de encontro a este pressuposto. Os valores médios registados são mais baixos dos que foram registados quer por Spagnolo e colaboradores (2008), quer por Valente e colaboradores (2015). Estatisticamente foram encontradas diferenças significativas em relação à concentração das γ- globulinas entre as faixas etárias estudadas. As concentrações de γ-globulinas apresentam uma diferença estatisticamente significativa entre os escalões etários 22 a 45 dias e 45 a 90 dias, sendo que os valores médios neste último são mais elevados. Na comparação de médias entre o primeiro escalão e o último, o grupo dos animais adultos, regista uma diferença muito significativa para a média dos dois subgrupos, sendo a média destes últimos significativamente mais alta. Não foi encontrada diferença entre os animais entre os 45 a 90 dias e os animais adultos. Estas diferenças estatísticas são explicadas com a maturação do sistema imunitário e o aumento de estímulos imunitários que os animais recebem quando se encontram no exterior dos

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ninhos (Härtle, et al. 2014). Tendo em conta apenas o subgrupo das fêmeas, no presente estudo, esta diferença torna-se estatisticamente altamente significativa. O mesmo não foi verificado no subgrupo dos machos, muito provavelmente pelo reduzido número de machos adultos incluídos no estudo. Não foi encontrada qualquer diferença estatisticamente significativa em relação ao efeito do género sobre este parâmetro.

O rácio albumina/globulinas é utilizado em Medicina Veterinária como uma forma rápida de identificação e classificação de disproteinemias. Nas aves em que os proteinogramas apresentam a fração da prealbumina, esta deve ser incluída no numerador (Werner, 1999; Mellilo, 2013). Este procedimento só é possível se o valor da prealbumina for obtido através de eletroforese, o que permite também obter valores corretos para albumina, uma vez que os valores obtidos pelos analisadores de química líquida não são fiáveis no cálculo deste parâmetro em aves (Lumeij 2008, Cray, Wack e Arheart 2011). A média deste parâmetro é muito variável consoante a espécie e está diretamente dependente da inclusão ou não da prealbumina. No presente trabalho a média calculada difere claramente da média publicada por Spagnolo e colaboradores (2008), sendo idêntica à média encontrada em crias de Coruja-do-mato por Valente e colaboradores (2015). Já o intervalo de referência apresenta uma maior diferença para ambos os estudos, sendo consideravelmente maior. Este tipo de amplitude de intervalo coincide com os intervalos publicados para este mesmo parâmetro em outras espécies de aves de rapina noturnas (Ammersbach, et al., 2015), ou como é descrito por Cray, Rodriguez e Zaias (2007) em psitacideos. Não foram encontradas diferenças significativas entre subgrupos ligados ao género, nem entre os subgrupos ligados à faixa etária.

51 6. CAPÍTULO VI –LIMITAÇÕES DO TRABALHO

Durante a execução deste trabalho foram registadas várias limitações ao mesmo: • Apesar do estudo ter como objeto uma espécie selvagem, o número de animais

admitidos para o estudo é insuficiente para se poder afirmar que o intervalo de referência calculado pode ser utilizado sem reservas na prática clínica.

• O número de animais admitidos em que se identificou o género é relativamente pequeno em relação à população inicial do estudo.

• Após a análise dos dados, verificou-se que o número de animais nos subgrupos etários é marcadamente desigual pelo que seria necessário um maior número de amostras dos subgrupos sub-representados.

• A execução do procedimento de eletroforese capilar realizada num laboratório externo não permitiu a separação da fração da prealbumina.

53 7. CAPÍTULO VII –CONCLUSÃO

No início do planeamento deste trabalho foram selecionados vários objetivos que seriam o pressuposto para a realização do mesmo. O objetivo principal foi definido como: efetuar a avaliação do perfil proteico da Coruja-do-mato (Strix aluco) e consequente obtenção de valores de referência. A aplicação da metodologia descrita, permite concluir que:

Foram estimados e apresentados valores que podem ser utilizados como intervalo de referência para as diferentes frações proteicas do plasma sanguíneo, da referida espécie em Portugal.

Os intervalos de referência calculados podem ser utilizados na avaliação do estado de higidez de animais da mesma espécie, desde que se aplique a mesma metodologia.

A análise comparativa dos dados revelou apenas uma diferença significativa entre os géneros, referente à fração das α1-globulinas. O significado desta alteração fica por definir, carecendo de mais estudos para clarificar esta situação.

A avaliação da influência da idade na concentração das proteínas plasmáticas revelou que as Corujas-do-mato com menos de 45 dias apresentam níveis plasmáticos de γ-globulinas inferiores aos registados em idades mais avançadas. Esta diferença tem de ser tida em conta aquando da avaliação do perfil eletroforético das crias desta espécie.

A clínica de animais selvagens requer um continuo esforço para a aquisição de conhecimentos, que permitam oferecer a estes animais as mesmas condições de diagnóstico e tratamento que encontramos nos seus parentes em cativeiro. Este trabalho acrescenta um pouco mais de conhecimento sobre parâmetros fisiológicos de uma espécie, que embora não se encontre em risco de extinção, é extremamente afetada pelas atividades humanas e pela modificação antropogénica do seu habitat. Os intervalos de referência aqui descritos poderão ser utilizados no apoio à conservação desta espécie.