Degradação de corantes e efluentes têxteis por fungos

Nos últimos anos, os estudos de degradação de xenobióticos por fungos basidomicetos, têm-se intensificado e diferentes taxas de degradação têm sido demonstradas, considerando as diferenças entre as espécies e as condições de crescimento utilizadas para tanto. Considerando-se a enorme diversidade dos fungos basidiomicetos é necessário, inicialmente, selecionar as espécies que apresentem maior potencialidade de degradação de xenobióticos e que consigam se desenvolver nas condições de meio ou materiais a serem biorremediados (BARR & AUST, 1994).

A capacidade dos basidiomicetos em degradar compostos xenobióticos deve-se à semelhança entre as estruturas da molécula de lignina e as moléculas de alguns compostos sintéticos, principalmente compostos aromáticos.

Segundo BONONI (1999), a natureza inespecífica deste mecanismo de degradação permite que até mesmo misturas complexas de poluentes sejam degradadas. Esta capacidade de mineralizar uma grande variedade de compostos químicos estruturalmente diferentes pode ter muitas vantagens na biodegradação de poluentes ambientais. AUST

(1990) resumiu algumas das vantagens de se utilizar os fungos lignocelulósicos em processos de biorremediação e tratamento de resíduos, quais sejam:

1. o sistema enzimático, sendo extracelular, pode atuar em substratos insolúveis ou complexados aos solos, e, portanto pouco acessíveis à ação bacteriana;

2. o sistema, sendo inespecífico, pode ser usado para uma ampla variedade de poluentes orgânicos ou mesmo de misturas deles;

3. o sistema, sendo produzido em resposta às condições de limitação de nutrientes, não necessita ser induzido pela exposição prévia ou pela presença de lignina ou do composto poluente;

4. este grupo de fungos possui vantagens competitivas, com relação aos outros microrganismos, quando materiais lignocelulósicos são utilizados como fontes de carbono; 5. a degradação da lignina ocorre até que sua concentração seja reduzida a níveis não detectáveis e os produtos finais são CO2 e água. Este é o tipo de processo desejável na degradação de xenobióticos.

Como os fungos da podridão branca não requerem precondicionamento para poluentes em particular, porque a secreção da enzima depende mais da limitação de nutriente, tanto nitrogênio como carbono, do que da presença de poluentes, o sistema de enzimas extracelulares possibilita a estes fungos tolerarem altas concentrações de poluentes (KAPDAN et al., 2000).

Os primeiros estudos relatando a descoloração de corantes por fungos ligninolíticos foram publicados no início da década de 80 quando GLENN & GOLD (1983) utilizaram corantes poliméricos em seus ensaios, buscando compostos mais simples, baratos e disponíveis comercialmente com alto grau de pureza em substituição as ligninas radiomarcadas utilizadas como substratos nos ensaios de biodegradação de lignina. Os ensaios revelaram que a descoloração era conseqüência do metabolismo secundário do

Phanerochaete chrysosporium, ocorrendo paralelamente à degradação da lignina, sendo também reprimida por altos níveis de nitrogênio, fortemente dependente da concentração de oxigênio e inibida por inibidores conhecidos da degradação da lignina.

Os estudos prévios, em sua maioria, enfocam as enzimas degradadoras de lignina de Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor. Recentemente, no entanto, tem-se verificado aumento no interesse em estudar as enzimas modificadoras de lignina de grande número de fungos da podridão branca, não apenas do ponto de vista da biologia comparativa, mas também com a expectativa de encontrar melhores sistemas degradadores de lignina para o uso em várias aplicações biotecnológicas (LEVIN et al., 2004).

Com o intuito de testar a atividade ligninolítica e celulósica de microrganismos, o complexo celulose-RBBR (“remazol brilhante blue R”) foi empregado por VYAS & MOLITORIS (1995) para detectar a quebra e a descoloração do corante. A remoção do corante por Phanerochaete chrysosporium foi devida à ação da enzima lignina peroxidase (LiP), por ele produzida. No entanto, a descoloração por Pleurotus ostreatus ocorreu mesmo sem a presença de LiP.

BANAT et al. (1996) testaram a degradação de dezoito azo-corantes em várias

concentrações, sendo que o fungo P. chrysosporium mostrou-se capaz de descolorir os

corantes, particularmente quando o álcool veratrílico estava presente no meio. Acredita-se que o álcool veratrílico estimula a atividade das ligninases, aparentemente ligadas à descoloração. Entre os dezoito azo-corantes testados, somente oito foram degradados com 40-70% de remoção de cor, sendo essa degradação devida ao sistema enzimático degradador de lignina ou por adsorção desses à massa miscelial.

YOUNG & YU (1997) compararam a capacidade de degradabilidade de oito corantes (incluindo índigo, complexos metálicos, antraquinona e azo) por Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor. De acordo com os autores, P. chrysosporium é um degradador versátil de corantes sintéticos de várias estruturas químicas, sendo as reações catalisadas por ligninases e não peroxidades dependentes de manganês. Os corantes com diferentes estruturas foram descoloridos em taxas diferentes e geralmente altas concentrações do corante resultaram em menores taxas de descoloração.

Tem-se demonstrado que culturas vários fungos ligninolíticos da podridão branca degradam e descolorem vários tipos de corantes e, que outras enzimas, tais como manganês peroxidase, lacase e aril álcool peroxidase, além da lignina peroxidase, estão

envolvidas nestes processos (VYAS & MOLITORIS, 1995; RODRIGUEZ et al., 1999).

Além disso, os estudos demonstraram que entre os fungos capazes de descolorir e degradar corantes, utilizando suas enzimas ligninolíticas, estão as espécies pertencentes aos gêneros

Pleurotus, Coriolus, Lentinus, Trametes, Bjerkandera, entre outros. CHAGAS & DURRANT (2001) avaliando a descoloração de azocorantes afirmam que as enzimas Mn-peroxidase e ?-glucosidase podem estar envolvidas na descoloração dos corantes por P. chrysosporium e, que para Pleurotus sajorcaju, além da lacase, a enzima glucose-1-oxidase pode participar do processo.

Dezesseis linhagens de fungos, conhecidas por sua habilidade em degradar materiais ligninocelulósicos ou derivados de lignina, foram testadas por HEINFING et al.

Primeiramente, os autores testaram a descoloração de três azo corantes, laranja reativo 96, violeta reativo 5 e Preto reativo 5, e dois corantes phthalocyanine, azul reativo 15 e azul reativo 38, em placas de meio sólido de glicose, contendo os corantes na concentração de 200 mg/L e 15 g/L de ágar, utilizando dezesseis espécies de fungos da podridão branca.

Dos dezesseis fungos testados apenas Bjerkandera adusta, Trametes versicolor e

Phanerochaete chrysosporium foram capazes de descolorir todos os corantes testados. Em seguida, B. adusta, P. chrysosporium e T. versicolor foram escolhidos pelos autores para um detalhado estudo de transformações do violeta reativo 5 (HRV5), um corante que contém cobre, e do azul reativo 38 (HRB38), um complexo de níquel-phthalocyanina, em meio líquido. Os autores verificaram que HRB38 foi descolorido por volta de 40% por B. adusta e T. versicolor em 24 horas e 95% de descoloração foi alcançada em 4 dias. Houve redução de 30% da concentração de níquel durante o

tratamento com B. adusta e T. versicolor. A descoloração de HRV5 começou mais

lentamente que a descoloração de HRB38 e alcançou 95% de descoloração em 6 dias com

B. adusta e T. versicolor. A concentração de cobre permaneceu constante durante o experimento.

A descoloração em meio sólido dos corantes amaranto, new coccine (vermelho), orange G (alaranjado) e tartrazina, foi avaliada utilizando Phanerochaete chrysosporium e

Pleurotus sajorcaju. Foram determinadas as atividades enzimáticas de lignina peroxidase, álcool veratrílico oxidase (AVO), lacase (o-dianisidina e siringaldazina) e manganês peroxidase. Após oito dias P. chrysosporium não havia descolorido totalmente tartrazina e amaranto, porém descoloriu totalmente new coccine e orange G, enquanto Pleurotus

sajor-caju descoloriu totalmente amaranto e new coccine e, parcialmente, orange G. Nenhum

dos fungos apresentou atividade de LiP ou AVO nas condições experimentais. P.

chrysosporium praticamente não mostrou atividade de lacase (o-dianisidina), mas apresentou atividade de MnP, CBQ, ?-glucosidase e lacase (siringaldazina). P. sajor-caju

não apresentou atividade de MnP, no entanto mostrou atividade de lacase (CHAGAS & DURRANT, 1999).

Segundo SHIN et al. (1997), Pleurotus produz um tipo de peroxidase extracelular

(PoP), glucose oxidase e um sistema gerador de H2O2. A especificidade da PoP ao

substrato é similar à conhecida para MnP que não oxida compostos fenólicos, mas não é dependente da atividade catalítica do manganês. De acordo com estes autores, a correlação entre a degradação da lignina e a descoloração de RBBR já foi demonstrada. O RBBR é semelhante a certos compostos poliméricos aromáticos que são substratos para LiP.

Embora ainda não se conheça com precisão qua is as enzimas que são capazes de degradar a lignina “in vivo”, dois grupos de peroxidases, a lignina peroxidase (LiP) e a manganês peroxidase (MnP), parecem estar associadas à atividade ligninolítica. Essas enzimas têm sido extensivamente estudadas em P. chrysosporium e outros fungos da podridão branca, tais como Panus tigrinus, Panus brevispora, Trametes versicolor e Phlebia radiata.

Trametes versicolor, Bjerkandera sp., Pleurotus ostreatus e Trametes hirsuta, além de Phanerochaete chrysosporium, foram ut ilizados por SWAMY & RAMSAY (1999), para avaliar a habilidade de descoloração de amaranto, tropaeolin O, preto remazol B, laranja remazol 3R, azul brilhante remazol R e azul reativo 15 em placas de agar- malte 2%. Das cinco espécies testadas, P. chrysosporium, T. versicolor e Bjerkandera sp. apresentaram a maior extensão de descoloração. As três espécies não descoloriram os corantes em cultivo estático. Em cultivo agitado, a 200 rpm e com formação de “pellets”,

Bjerkandera sp. descoloriu amaranto, preto remazol B e laranja remazol. Os “pellets” de P. chrysosporium e T. versicolor foram capazes de descolorir a maioria dos corantes, sendo

que a descoloração por T. versicolor foi muito mais rápida. Culturas em batelada de

Bjerkandera sp. e P. chrysosporium apresentaram habilidade limitada para descolorir adições repetidas de corantes. Entretanto, T. versicolor descoloriu rapidamente adições repetidas de diferentes corantes e misturas dos mesmos, sem se verificar qualquer adsorção visual do corante aos “pellets”. A escolha da solução tampão teve um profundo efeito sobre a adição repetida de corante, e conseqüentemente, à descoloração. A utilização de ácido 2,2’-dimetilsuccínico permitiu um excelente controle de pH e resultou em alta habilidade de descoloração.

Culturas de P. sanguineus foram testadas por THOMAS & PINKOSKI (1999) na

descoloração dos corantes vermelho congo e verde malaquita. Verificou-se que houve redução da concentração do vermelho congo em todas soluções inoculadas com

Pycnoporus sanguineus, sendo que as maiores variações ocorreram quando foi adicionada glicose às soluções, tanto em pH 5,0 como em pH 6,0. Constatou-se que as maiores taxas de redução do corante aconteceram nas primeiras 48 horas. Ao final do período de incubação as porcentagens de remoção variaram de 52%, nas soluções de glicose com pH 5,0, a 92% nas soluções de glicose a pH 6,0. Porém, com relação ao corante verde malaquita em pH 5,0, não houve muita diferença na remoção do corante, na presença ou não de glicose, alcançando uma redução de 28% da concentração inicial ao final do período de incubação. Em pH 6,0, houve um máximo de 40% de descoloração.

RODRÍGUEZ et al. (1999) estudaram a descoloração de 23 corantes industriais por

fungos da podridão branca. Culturas dos fungos Phanerochaete chrysosporium (ATCC

24725) e Pleroutus ostreatus (IE8) crescendo em meio complexo de agar contendo um dos 23 corantes testados mostraram que P. ostreatus foi capaz de descolorir 12 dos 23 corantes industriais, enquanto P. chrysosporium descoloriu apenas cinco. Extratos extracelulares de

Trametes híspida crescidos em grãos de cereais foram capazes de descolorir “in vitro” 11

dos 23 corantes industriais. Segundo os autores, todas as linhagens de P. ostreatus

apresentaram alta atividade de lacase e manganês peroxidase, mas a maior atividade volumétrica de lacase foi encontrada em T. hispida.

Segundo BALAN (1998), a descoloração por basidiomicetos em meio líquido contendo uma concentração de 0,02% do corante índigo, indicou a descoloração e remoção do corante. A descoloração iniciou-se em poucas horas, sendo 100% do corante degradado por Phellinus gilvus no quarto dia. As porcentagens de descoloração obtidas por Pleurotus sajor-caju, Pycnoporus sanguineus e Phanerochaete chrysosporium foram de 94%, 90% e 70-75%, respectivamente. Uma quantidade parcial do corante índigo foi removida do meio por adsorção no micélio.

A descoloração do corante cristal violeta por fungos foi estudada em cultura líquida

e monitorada por espectrofotometria. Phanerochaete chrysosporium apresentou a menor

porcentagem de descoloração, 62%, no entanto, Coriolus versicolor e Fumagalia troggi

descoloriram 92% e 82%, respectivamente (YESILADA, 1995).

KAPDAN et al. (2000) testaram a descoloração dos corantes amarelo everzol 4GL, vermelho everzol RBN, Orange K-GL, Amarelo supra everdirect PG e Azul turquesa everzol G por Phanerochaete chrysosporium 671.71, P. chrysosporium MUCL, Coriolus versicolor e Coriolus versicolor MUCL em frascos agitados por um período de 9 dias de incubação. Os autores verificaram uma descoloração pelo P. chrysosporium por volta de 90% para todos os corantes testados. Para o Coriolus versicolor o grau de descoloração variou entre 34% a 100%.

TEKERE et al. (2001) estudaram o crescimento, descoloração de corantes,

atividade ligninolítica e temperatura ótima de fungos da podridão branca do Zimbábue. A temperatura ótima foi encontrada entre 25-37ºC, variando de acordo com os isolados. Os isolados foram testados por sua habilidade em degradar os corantes poliméricos azul dextran e Poly R478 e os corantes trifenilmetanos vermelho cresol, violeta cristal e azul bromofenol. Os autores não detectaram presença de lignina peroxidase nos isolados, mas todos os isolados apresentaram atividade de manganês peroxidase e lacase. Os autores

verificaram que as maiores taxas de descoloração em culturas líquidas para o corante Poly R478 foram obtidas utilizando Trametes cingulata, Trametes versicolor, Trametes poças, DSPM95 (uma espécie a ser identificada), Datronia concentrica e Pycnoporus sanguineus.

CHAGAS & DURRANT (2001) examinaram a descoloração de quatro azo-corantes em duas culturas de fungos da podridão branca. Em meio de cultura solidificado,

Phanerochaete chrysosporium descoloriu parcialmente todos os corantes testados, enquanto Pleurotus sajorcaju descoloriu totalmente amaranto, new coccine e laranja G, mas não tartrazina. Em meio de cultura líquido, P. chrysosporium descoloriu totalmente amaranto, new coccine e laranja G e 60% tartrazina. P. sajorcaju descoloriu totalmente amaranto e new coccine, 50% laranja G e no máximo 20% tartrazina. Segundo as autoras nenhum dos fungos apresentou atividade de lignina peroxidase ou álcool veratrílico oxidase. Atividades de manganês peroxidase e ?-glucosidase podem estar envolvidas na descoloração dos corantes por P. chrysosporium, enquanto para P. sajorcaju, lacase e glicose-1 oxidase podem participar no processo de descoloração.

GUGLIOTA (2002), citado por OMORI (2004), recentemente avaliou a capacidade de basidiomicetos em descolorir o corante índigo carmim em meio sólido de extrato de malte acrescido de corante. Todas as linhagens foram capazes de crescer neste meio de cultura, sendo que das 30 linhagens avaliadas, 28 foram capazes de descolorir o corante.

Apenas as linhagens Pycnoporus sanguineus CCB277 e Hydnopolyporus fimbriatus

CCB289 não formaram halo de descoloração no período de quatorze dias. As linhagens que apresentaram maior halo de descoloração associado a maior taxa de extensão micelial foram: Hygrocybe sp. CCB342, Panaeolus papilionaceus CCB187, Psilocybe castanella

CCB444, Stereum ostrea CCB267, Trametes villosa CCB165 E CCB291. Numa segunda

etapa, três linhagens foram selecionadas e avaliadas quanto à capacidade de descolorir um efluente têxtil em meio de cultura líquida (batata-dextrose) adicionada de efluente. As

porcentagens de remoção de cor do efluente foram 75,32% para Panaeolus papilionaceus

CCB187, 87,82% para Trametes villosa CCB165 e 92,89% para Hygrocybe sp. CCB342. HARAZONO et al. (2003) investigaram a descoloração de um corante azo-reativo, vermelho reativo 120, por um fungo da podridão branca, Phanerochaete sordida linhagem YK-624. Em cultura líquida de P. sordida em um meio contendo 3% de extrato de malte e 200mg/l do corante, obteve-se uma descoloração do corante de 90,6 % após sete dias. A atividade de Manganês Peroxidase (MnP) foi detectada durante o processo de descoloração. Os autores verificaram que o corante pode ser descolorido por MnP purificada de P. sordida na presença de Mn(II) Tween 80. Sob agitação, o corante pode ser

descolorido sem adição de peróxido de hidrogênio. Além disso, observaram que a descoloração não ocorre em condições anaeróbicas, sugerindo que a descoloração do corante por MnP é influenciada por oxigênio dissolvido.

A habilidade do fungo da podridão branca Lentinus edodes em descolorir vários corantes sintéticos foi investigado por BOER et al. (2004) usando culturas em estado sólido com sabugo de milho como substrato. Para testar a habilidade deste sistema em estado sólido em descolorir corantes industriais, cada corante foi adicionado na cultura de espiga de milho e glicose em uma concentração de 200 ppm. As autoras observaram, visualmente, uma completa descoloração, após dezoito dias, de oito dos dez corantes testados: preto amido, vermelho congo, azul trypan, verde metil, RBBR, violeta metil, violeta etil e Poly R478. Dois corantes, azul cresyl brilhante e azul metileno, foram parcialmente descoloridos.

A produção de enzimas ligninolíticas pelo L. edodes em culturas de espiga de milho também foi analisada pelas autoras, que detectaram alta atividade de manganês peroxidase e muito baixa atividade de lignina peroxidase e lacase.

SANTOS (2004) selecionou fungos ligninolíticos para descoloração do corante RBBR. Os fungos estudados foram Lentinus edodes CCB047, Lentinus edodes 1, Lentinus edodes 2, Phanerochaete chrysosporium CCB478, Pleurotus cornucopiae var. citrinopileatus CCB085, Pleurotus ëous CCB016, Pleurotus ëous CCB440, Pleurotus ostreatus CCB002, Pleurotus pulmonarius CCB017, Pleurotus pulmonarius CCB019,

Pleurotus pulmonarius CCB020, Agaricus blazei, Pleurotus ostreatus, Schizophuyllum comumne, Rhyzopus arrhyzus, e quatro fungos isolados de efluente têxtil não identificados. Na seleção dos fungos foi utilizado meio agar extrato de malte-2% acrescido de 0,05 % de “Remazol Brilliant Blue R”. Todos os fungos avaliados apresentaram crescimento no meio utilizado, entretanto, nem todos foram capazes de descolorir o meio corante. Dentre os fungos avaliados, os isolados Pleurotus ëous CCB016 E CCB040 e Pleurotus pulmonarius

CCB019 foram os que se destacaram, apresentando potencial para descoloração deste corante.

LEVIN et al. (2004), comparando com o bem conhecido degradador de corante

Phanerochaete chrysosporium, identificaram um novo fungo potencialmente candidato ao uso em processos de biodescoloração: Coriolus versicolor antarcticus. Segundo os autores culturas de dezoito dias deste fungo foram capazes de descolorir em uma hora 28 %, 30 %, 43 %, 88 % e 98 % de Xylidine (24 mg/L), Poly R-478 (75 mg/L), Remazol Brilliant Blue R (9 mg/L), verde malaquita (6 mg/L) e Índigo Carmine (23 mg/L), respectivamente. Os

autores também verificaram a presença da enzima lacase nos fluidos extracelulares no dia de incubação. Manganês peroxidase e lignina peroxidase não foram detectadas.

KIM et al. (2004) estudaram a descoloração de soluções coloridas em um biorreator com membrana (MBR) usando fungos da podridão branca. Os autores combinaram a descoloração das soluções coloridas por Trametes versicolor (KCTC 16781) com filtração em membrana. A aplicabilidade do MBR usando biodegradação por fungos foi estudada com membranas de nanofiltração e osmose inversa para melhorar o fluxo de permeado a eficiência da separação. Os autores verificaram que a combinação do MBR fúngico com RO se apresenta eficiente para descoloração e remoção orgânica de efluente colorido.

CHRISTIAN et al. (2005) avaliaram a descoloração do corante Remazol Brilliant

Blue R (RBBR) pelo fungo Trametes versicolor. Os autores verificaram que a

descoloração do RBBR por T. versicolor envolve a atividade de LiP e uma atividade

dependente de H2O2 a qual não é influenciada por álcool veratrílico e Mn(II). No entanto a descoloração do RBBR foi observada largamente como uma função de LiP durante os últimos estágios do crescimento.

EICHLEROVÁ et al. (2005) recentemente avaliaram a descoloração, em meio

líquido, dos corantes Alaranjado G e Remazol Brilliant Blue R (RBBR) pelos fungos da podridão branca Dichomitus squalens, Ischonoderma resinosum e Pleurotus calyptratus. As três linhagens de fungos descoloriram tanto Alaranjado G como RBBR, mas eles se diferenciaram na capacidade de descoloração dependendo das condições de cultivo e da produção de enzimas ligninolíticas. Duas tendências diferentes de descoloração foram

encontradas nas linhagens: a descoloração do Alaranjado G por I. resinosum e P.

calyptratus foi causada principalmente por lacase, enquanto a descoloração do RBBR foi

afetada por manganês peroxidase (MnP); no caso de D. squalens, lacase e MnP

cooperaram nos processos de descoloração.

Além de avaliar fungos e corantes de forma isolada, alguns autores também avaliaram a descoloração fúngica de misturas de corantes, a utilização seqüencial dos fungos, bem com a descoloração de efluentes têxteis.

SANTOS et al. (2002) estudou o isolado Pleurotus pulmonarius CCB019 quanto a

descoloração de uma mistura de corantes comerciais reativos: azul R (122 ppm), vermelho-4B (3 ppm) e azul-5G (4 ppm) em meio líquido. As variáveis testadas foram quantidade de biomassa (10, 20 e 30 % (v/v)) e pH (4.5, 5.0 e 5.5). No sétimo dia de experimento 2 mL de uma solução com 5 g/L de glicose foi acrescentada ao meio. A descoloração iniciou somente depois da adição de glicose e as porcentagens de descoloração obtidas foram

maiores que 30 %. A melhor descoloração foi 85 % quando se utilizou 30 % de inóculo em pH 4,5, no décimo nono dia experimental.

Recentemente, HAZAROMO & NAKAMURA (2005) avaliaram a descoloração de misturas dos corantes RB5, RG5, RO14 e RR120 por um fungo basidiomiceto da podridão branca Phanerochaete sordida. O fungo P. sordida descoloriu em 90 %, após 48 h, as misturas de corantes (200 mg/L) em meio líquido de glicose-amônia com nitrogênio limitante. Os autores verificaram que para a descoloração das misturas de corantes foi preciso a adição de Mn²⁺ e Tween 80 ao meio.

Os autores testaram o efeito da presença de PVA, SDBS e amido na descoloração das misturas de corantes e verificaram que SDBS e amido nas concentrações de 10-1000 mg/L não afetaram a descoloração por culturas de P. sordida na presença de 1 % de Tween 80. Para verificar o efeito inibitório de PVA, cada corante foi tratado com MnP adicionado de Tween 80 na presença de várias concentrações de PVA. Apesar do PVA não afetar na