Delineamento experimental antitumoral

Foram utilizados grupos experimentais para avaliar a atividade antitumoral do óleo de chia em camundongos Balb/C machos (Figura 1). No experimento foram

utilizados 36 camundongos machos da linhagem Balb/C. O ensaio sadio utilizou um grupo (n=6) de camundongos machos Balb/C e o ensaio tumoral utilizou 30 camundongos Balb/C machos que foram aleatoriamente divididos em cinco grupos (n=6/ por grupo) e receberam as seguintes dietas:

A) Ensaio Sadio:

• Grupo sadio: Dieta controle (DC Sadio) – dieta padrão controle AIN-93M; B) Ensaio tumoral:

• Grupo I: Dieta controle (DC) – dieta controle AIN-93M;

• Grupo II: Dieta Doxo (DCDX) – dieta controle AIN-93M com tratamento de doxorrubicina (3 mg/kg) tratados intraperitonealmente;

• Grupo III: Dieta com óleo de chia (DO5) – dieta com adição de 5 % (m/m) de óleo de chia e 2 % (m/m) de óleo de soja;

• Grupo IV: Dieta com óleo de chia (DO6) – dieta com adição de 6% (m/m) de óleo de chia e 1 % (m/m) de óleo de soja;

• Grupo V: Dieta com óleo de chia (DO7) – dieta com adição de 7 % (m/m) de óleo de chia.

O grupo controle sadio (n=6) foi pré-alimentado com dieta controle AIN- 93M (DC) no período de 56 dias sem inoculação do tumor, sendo utilizado como referência para avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos dos grupos com tumor sólido de Ehrlich.

O experimento in vivo foi realizado no período total de 56 dias no biotério da Divisão de Farmacologia e Toxicologia – CPQBA – UNICAMP, em salas com temperatura controlada de 25 ± 2 °C, umidade relativa de 50 a 60 % ± 5 %, e em ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso livre à água e dieta.

Figura 1. Esquema ilustrativo do ensaio tumoral.

2.7 Avaliações dos animais 2.7.1 Massa corporal

A quantidade de dieta consumida por grupo foi avaliada por meio do registro diário da ingestão alimentar dos animais (variação entre a oferta e as sobras da dieta deixadas nas gaiolas) durante os 56 dias de ensaio, para obtenção da ingestão nos diferentes grupos experimentais. Durante todo período experimental, os animais foram submetidos semanalmente à avaliações de massa corporal, de forma a minimizar a manipulação e estresse dos animais.

2.7.2 Eutanásia dos animais

No final do período experimental, após jejum de 8 horas, todos os animais foram pesados, anestesiados (100 mg/kg ketamina + 5 mg/kg xilazina). Em seguida o sangue foi coletado por punção cardíaca e os animais foram submetidos a eutanásia por aprofundamento de anestesia. O sangue de cada animal foi distribuído em microtubo de 0,5 mL contendo 10 µL de anticoagulante EDTA sódico a 10 % para realização dos parâmetros hematológicos e em um microtubo de 1,0 mL sem EDTA para centrifugação do soro e posterior realização das análises bioquímicas.

Após 56 dias, os animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia, sendo avaliado o perfil hematológico e as funções hepáticas, por meio de

análises bioquímicas dos níveis séricos de gama-glutamiltransferase (GGT), aspartato aminotransferase (TGO), alanina aminotransferase (TGP) e fosfatase alcalina (ALP). Os tecidos (fígado, rins, coração, pulmão e baço) foram retirados e pesados. Os fígados foram armazendados em ultrafreezer (Marca Revco, modelo ULT1386-3-D36) para serem analisados. Os tumores foram armazenados em solução de formol tamponada neutra a 10 % para posterior análise.

2.7.3 Avaliação dos parâmetros sanguíneos

O sangue coletado em microtubos com EDTA (0,5 mL de sangue para 10 µL de EDTA) foi lido em aparelho veterinário para análise de hemograma (Sysmex®, modelo pocH-100iV, Curitiba, PR, Brasil), avaliando-se: leucócitos totais (WBC), eritrócitos (RBC), hemoglobina (HGB), hematócritos (HCT) e plaquetas (PLT).

2.7.4 Avaliação dos parâmetros bioquímicos

A determinação dos parâmetros bioquímicos foi realizada no soro, portanto os microtubos de 1,0 mL foram centrifugados durante 15 min a 3500 rpm, o sobrenadante (soro) foi coletado em microtubo e armazenado a 10 ºC para posterior análise. Os parâmetros bioquímicos foram dosados através do analisador automatizado Reflotron (Roche, Reflotron plus, EUA), empregando o método cinético UV, utilizando kits comerciais de reagentes padrão (Roche, EUA).

Todas as medidas de atividade enzimática foram visualizadas para a temperatura 37 ºC. Uma alíquota de 30 µL de soro de cada animal foi inserida no centro da zona vermelha reativa da tira, removendo anteriormente a banda protetora. Após 15 s a tira foi introduzida horizontalmente no aparelho e o aparecimento no visor confirma a leitura do código magnético específico do teste. Os parâmetros bioquímicos analisados foram gama-glutamiltransferase (GGT), aspartato aminotransferase (TGO), alanina aminotransferase (TGP) e fosfatase alcalina (ALP).

2.7.5 Peso relativo dos tecidos

Após eutanásia, de cada animal, foram excisados os seguintes tecidos (coração, fígado, rins, baço e pulmão), foram pesados em balança analítica. Os fígados foram separados em frascos, identificados e armazenados em ultrafreezer (Marca Revco, modelo ULT1386-3-D36) para análises posteriores.

2.7.6 Análises histológicas do tumor

Os tumores dos animais dos grupos experimentais foram removidos e armazenados em solução de formol tamponado a 10 % por 24 hs, após esse período, seguiu-se a desidratação progressiva com série crescente de etanol: etanol 70°, etanol 80°, etanol 100°, xilol e inclusão em parafina. Os cortes foram realizados no micrótomo rotativo Biocut 1130 (Reichert-Jung, Munique, Alemanha), 5 µm de espessura. Para realizar a coloração, os cortes foram desparafinizados em série de xilol e reidratados em concentrações decrescentes de etanol. As lâminas foram coradas com hematoxilina- eosina (HE) para análise das áreas de necrose na massa tumoral.

2.7.6.1 Área de necrose

Para avaliação da área de necrose utilizou-se o sistema de análise de imagens computadorizada (Leica LAS X Core, Wetzlar, Alemanha) do Laboratório do Instituto de Biologia da UNICAMP. Esse sistema compõe-se de um microscópio óptico acoplado à uma câmera de video (Leica DM2500, Wetzlar, Alemanha) e um computador com placa digitalizadora. As áreas de necrose em meio a massa tumoral foram observadas no microscópio utilizando objetivas de 10x e 50x. A área de necrose foi quantificada utilizando-se o software ImageJ 1.46r (Bethesda, Maryland, USA) por meio da equação [% área de necrose = (área de necrose/ área total (área de necrose + área de tumor)) *100].

2.8 Análises hepáticas 2.8.1 Teor de lipídeos totais

O teor de lipídeos totais nos fígados dos animais foi determinado utilizando a metodologia de extração de lipídeos totais em tecido animal (Folch et al., 1957) em triplicata. Adicionou-se 1,9 mL de clorofórmio: metanol (2:1,v/v) em 0,1 g de fígado fresco, misturou-se e submeteu-se à trituração. Assim, uma alíquota de 0,4 mL de metanol PA foi adicionada e depois centrifugada a 3500 rpm durante 10 min.

O sobrenadante foi recolhido, adicionado 0,8 mL de clorofórmio, 0,64 mL de solução de NaCl a 0,73 % e em seguida foi centrifugado a 3500 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi descartado e na fase inferior foi realizada a adição de 1 mL de solução de Folch (clorofórmio:metanol:água:NaCl 0,2% - 3:48:47:2, v/v/v/v), sendo lavada por três vezes. Sendo assim, em seguida foi adicionado 5 mL de clorofórmio:metanol (2:1, v/v), e o conteúdo foi seco em estufa a 37 ºC por 8 hs. O teor

de lipídeos totais da amostra foi determinado. O conteúdo seco foi ressuspenso em 1 mL de isopropanol para as análises posteriores dos níveis hepático de colesterol total e triglicérides.

2.8.2 Análise do colesterol total e triglicérides

Os níveis hepático de colesterol total e triglicérides foram determinados utilizando kits de ensaio enzimático, de acordo com as instruções do fabricante para os respectivos kits (Colestat enzimático AA e TG color GPO/PAP AA, Wiener laboratories, Rosario, Argentina). Para tanto foi utilizado o material seco resultante do processamento do fígado (procedimento descrito em 2.8.1) ressuspenso em 1 mL de isopropanol.

2.9 Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão, avaliados pela análise de variância (ANOVA), seguida do teste de comparação de média, o teste de Tukey. Valores de p menores do que 0,05 (p<0,05) foram considerados como indicativos de significância. Os cálculos foram realizados utilizando o Software estatístico GraphPad Prism versão 5.0 (San Diego Califórnia, EUA).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO