Eutanásia dos animais

No final do período experimental, após jejum de 8 horas, todos os animais foram pesados e anestesiados (100 mg/kg ketamina + 5 mg/kg xilazina). Em seguida o sangue foi coletado por punção cardíaca e os animais foram submetidos à eutanásia por aprofundamento de anestesia. O sangue de cada animal foi distribuído em microtubos de 0,5 mL contendo 10 µL de anticoagulante EDTA sódico a 10 % para realização dos parâmetros hematológicos, e em um microtubo de 1,0 mL sem EDTA para centrifugação do soro e posterior realização das análises bioquímicas.

2.11.1 Avaliação dos parâmetros sanguíneos

O sangue coletado em microtubos com EDTA (0,5 mL de sangue para 10

µL de EDTA) foi analisado em aparelho veterinário para análise de hemograma (Sysmex®, modelo pocH-100iV, Curitiba, Brasil), avaliando-se: leucócitos totais (WBC), eritrócitos (RBC), hematócritos (HCT), hemoglobina (Hbg) e plaquetas (PLT).

2.11.2 Avaliação dos parâmetros bioquímicos

A determinação dos parâmetros bioquímicos foi realizada no soro sanguíneo, portanto os microtubos de 1,0 mL foram centrifugados durante 15 min a 3500 rpm (rotações por minuto), o sobrenadante (soro) foi coletado em microtubo e armazenado a 10 ºC para posterior análise. Os parâmetros bioquímicos foram dosados através do analisador automatizado Reflotron plus (Roche, EUA), empregando o método cinético UV, utilizando-se kits comerciais de reagentes padrão Reflotron Roche. Todas as medidas de atividade enzimática foram realizadas na temperatura de 37 ºC (selecionada no aparelho). Uma alíquota de 30 µL de soro de cada animal foi inserida no centro da zona vermelha reativa da tira, removendo anteriormente a banda protetora. Após 15 s, a tira foi introduzida horizontalmente no aparelho e o aparecimento no visor confirma que a leitura do código magnético específico do teste foi corretamente lida pelo mesmo. Os parâmetros analisados foram gama-glutamil transferase (GGT), LDL-colesterol, HDL-colesterol, colesterol total e triglicérides.

2.11.3 Peso relativo dos tecidos

Após eutanásia, foram excisados os tecidos (coração, fígado, rins, baço e pulmão) de cada animal, os quais foram pesados em balança analítica (Bel, São Paulo, Brazil). O fígado, rins e coração foram separados em frascos, identificados e armazeados em ultrafrezzer (Revco, ULT1386-3-D36, Asheville, EUA) para análises posteriores.

2.11.4 Atividade antioxidante nos rins e coração 2.11.4.1 Preparo do homogenato

A concentração de proteína nos homogenatos dos rins e do coração foi determinada pelo método de Bradford (Bradford, 1976). Os homogenatos foram tratados com etanol: água ultrapura (2:1) e ácido metafosfórico 0,75 mol/L (Batista et al., 2014). As amostras foram centrifugadas a 14000 g durante 5 min a 4 °C e o

sobrenadante removido. A capacidade antioxidante dos extratos dos homogenatos do rins e coração foi estimada pelo ensaio de FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro) conforme método descrito por Benzie & Strain (1996) e ORAC (Capacidade de Redução do Radical Oxigênio) de acordo com o método descrito por Ou et al. (2013).

2.11.4.2 Ensaio FRAP

O reagente FRAP foi preparado sob proteção da luz com tampão acetato 300 mmol/L (pH 3,6), 10 mmol 2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazina (TPTZ) em solução de 40 mmol de HCl e 20 mmol FeCl3 (Benzie & Strain, 1996). Em eppendorf foram adicionados 20 µL da amostra, 600 µL de reagente FRAP e 60 µL de água ultrapura e em seguida foram misturados e mantidos em banho-maria durante 30 min a 37 °C. Após resfriamento até a temperatura ambiente, todas as amostras foram lidas a 595 nm no leitor de microplacas (SynergyHT, Biotek,Winooski, EUA). Preparou-se também uma curva padrão Trolox (10-800 µmol TE). Os resultados foram expressos em µmol Trolox equivalente (TE)/mg proteína. Todas as medidas foram realizadas em triplicata para cada homogenato dos tecidos.

2.11.4.3 Ensaio ORAC

Os ensaios ORAC (Capacidade de Redução do Radical Oxigênio) baseia-se na capacidade fluorescente da fluoresceína sódica na presença de radicais de oxigênio, sendo realizado conforme o método descrito por Ou et al. (2013). O radical peroxil foi gerado pela solução de AAPH (2,2'-azobis (2-metilpropionamidina) dicloridrato) sendo preparada imediatamente antes da análise e utilizada fluoresceína como substrato. Sob proteção da luz, foram adicionados 20 µL de amostra, 120 µL de fluoresceína em tampão fosfato (pH 7,4) e 60 µL de AAPH em microplacas escuras. O leitor de microplacas (SynergyHT, Biotek, Winooski, USA) foi ajustado (filtros fluorescentes, comprimento de onda de excitação, 485 nm, comprimento de onda de emissão, 520 nm) e Trolox foi utilizado como padrão (5-50 µmol). Os valores de ORAC foram expressos em µmol Trolox equivalente (TE)/mg proteína. Todas as medidas foram realizadas em triplicata para cada extrato analisado.

2.11.5 Análises hepáticas

O teor de lipídeos totais no tecido hepático dos animais foi determinado utilizando a metodologia de extração de lipídeos totais em tecido animal (Folch et al., 1957). Adicionou-se 1,9 mL de clorofórmio: metanol (2:1, v/v) em 0,1 g de fígado fresco, misturou-se e submeteu-se à trituração (Polytron, EUA). Assim, uma alíquota de 0,4 mL de metanol PA foi adicionada e o material foi centrifugado a 3500 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido, adicionado 0,8 mL de clorofórmio, 0,64 mL de solução de NaCl a 0,73 % e em seguida foi centrifugado a 3500 rpm durante 10 min.

O sobrenadante foi descartado e na fase inferior foi realizada a adição de 1 mL de solução de Folch (clorofórmio:metanol:água:NaCl 0,2 % - 3:48:47:2, v/v/v/v), sendo lavada por três vezes. Em seguida foi adicionado 5 mL de solução de clorofórmio:metanol (2:1, v/v), e o conteúdo foi seco em estufa a 37 ºC por 8 hs. O teor de lipídeos totais da amostra foi determinado, e o conteúdo seco foi ressuspenso em 1 mL de isopropanol para as análises de colesterol total e triglicérides. Os níveis hepáticos de colesterol total e triglicérides foram determinados utilizando kits de ensaio enzimático, de acordo com as instruções do fabricante para os respectivos kits (Colestat enzimático AA e TG color GPO/PAP AA, Wiener laboratories, Rosario, Argentina).

2.11.5.2 Perfil dos ácidos graxos no fígado

A extração lipídica do fígado dos camundongos Balb/C foi realizada segundo método de Folch (1957), com adaptações. A extração seguiu todas as etapas conforme o item 2.11.5.1, porém o conteúdo de lipídeos foi ressuspenso em 1 mL de éter de petróleo. A composição dos ácidos graxos presentes na fração lipídica do tecido hepático dos animais foi determinada por cromatografia gasosa, após esterificação, utilizando a metodologia descrita por Hartmann & Lago (1973).

Os ésteres metílicos foram separados segundo o método AOCSCe 2-66 (2009), analisados em cromatógrafo gasoso capilar (marca CGC Agilent 6850 Series GC System) com detector de ionização de chama. Os componentes foram separados em coluna capilar de sílica fundida DB-23 Agilent (50 % cianopropil metil polisiloxano modificado), com dimensões de 60 m, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 µm. As condições de operação foram fluxo de 1,00 mL/min, temperatura programada do detector de 280 ºC, temperatura do injetor a 250 ºC, temperatura do forno: 110 ºC – 5 min.; 110 – 215 ºC – 5 min, 215 ºC – 24 min., gás de arraste: hélio; velocidade linear do gás de arraste de 24 cm/s, volume injetado de 1,0 µL. A quantificação e identificação dos ácidos graxos foi realizada através da comparação do

tempo de retenção dos ácidos graxos das amostras e dos padrões. As análises cromatográficas foram realizadas em duplicata.