Chamamos de derivados os cristais onde ´atomos pesados foram incorpo- rados e est˜ao ligados `as mol´eculas de prote´ına de forma ordenada, em contra- partida aos cristais chamados nativos, onde est˜ao presentes apenas mol´eculas de prote´ına. Alguns aspectos da escolha e prepara¸c˜ao dos derivados propria- mente ditas s˜ao dados a seguir (informa¸c˜oes na internet podem tamb´em ser encontradas em http://www.bmm.icnet.uk/had/heavyatom.html).
2.3.1
Crit´erios de escolha dos compostos utilizados
Os reagentes contendo ´atomos pesados podem ser classificados de acordo com as suas intera¸c˜oes com a mol´ecula de prote´ına, por ex., quanto `a pre- ferˆencia por ligantes que cont´em carboxilatos ou outros grupos onde h´a oxigˆenio ou ligantes mais leves como enxofre, nitrogˆenio e haletos. Mais de
2.3 Derivados de ´atomos pesados 26 uma classifica¸c˜ao pode ser feita mas, em linhas gerais, a classifica¸c˜ao abaixo, em 6 grupos, ´e adequada2:
Metais da Classe A: incluem metais alcalinos (X+), terras raras (X2+), lantan´ıdeos(X3+) e o actn´ıdeo U O2+2 . Al´em destes, alguns outros que apresentam caracter´ısticas mistas com a Classe B abaixo, s˜ao T l+, P b2+ e Cd. Ligam-se a grupos contendo F−, OH−, H2O carboxilatos e fosfatos. Devem ser utilizados em pHs ´acidos. Em pHs mais altos (> 7.5) h´a problemas de solubilidade.
Metais da Classe B : os compostos mais utilizados pertencem a esta classe, que inclui Hg2+, Ag+, P t2+, Au3+, P d2+, Ir3+, Os4+ e Cd2+. Preferem ligantes que cont´em N, S e haletos como, por ex., histidinas, ciste´ınas e metioninas (no caso da Pt). N˜ao devem ser usados em pHs ´
acidos (< 6) e, em pHs mais altos, apresentam menos problemas do que os metais da Classe B.
Aniˆonicos: neste caso, a intera¸c˜ao d´a-se atrav´es de sua carga negativa total, ligando-se a regi˜oes b´asicas da prote´ına. A liga¸c˜ao ser´a favorecida em pHs baixos, onde a prote´ına est´a mais carregada positivamente, facili- tando a protona¸c˜ao de histidinas. O grupo inclui iodeto e complexos de metais aniˆonicos e est´aveis: I−, (HgI3)−, (P t(CN )4)2−, (IrCl6)3−, (Au(CN )2)−.
Catiˆonicos: em oposi¸c˜ao aos compostos aniˆonicos, a intera¸c˜ao predomi- nante ocorre atrav´es de sua carga total positiva, ligando-se a regi˜oes ´
acidas da prote´ına. Seu uso ´e favorecido por pHs mais altos, onde a prote´ına estar´a mais negativamente carregada, havendo tamb´em maior chance de deprotona¸c˜ao de histidinas. Alguns exemplos de com-
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postos com estas caracter´ısticas s˜ao (P t(N H3)4)2+, (Ir(N H3)6)3+ e (Hg(N H3)2)2+.
Hidrof´obicos: em geral, os reagentes que cont´em os grupos acima ligam-se `a superf´ıcie da mol´ecula prot´eica, tanto devido ao tamanho, que impede a entrada no interior da prote´ına, quanto por serem carregados. Os principais exemplos desta classe s˜ao os gases nobres Xe e Kr, capazes de penetrar a mol´ecula, interagindo em regi˜oes hidrof´obicas.
Selenometionina: atualmente, uma estrat´egia largamente empregada ´e a utiliza¸c˜ao, durante a express˜ao da prote´ına, de res´ıduos de metionina onde o elemento S tenha sido substitu´ıdo por Se. O espalhamento anˆomalo advindo dos ´atomos de Se permite resolver o problema das fases pelos m´etodos MAD ou SAD (p´ag. 44).
Al´em das propriedades qu´ımicas dos reagentes, outros fatores devem ser levados em considera¸c˜ao durante o planejamento do experimento de deri- vatiza¸c˜ao. Os compostos contendo ´atomos pesados s˜ao bastante reativos, podendo romper as fr´ageis liga¸c˜oes que mant´em coeso o cristal de prote´ına. Em geral, s˜ao utilizadas quantidades muito pequenas e tempos de exposi¸c˜ao (banho do cristal em solu¸c˜ao contendo ´atomo pesado) que variam de horas at´e dias, permitindo que os ´atomos pesados liguem-se `a prote´ına. A escolha dos compostos a serem utilizados pode ser limitada pelas pr´oprias condi¸c˜oes de cristaliza¸c˜ao da prote´ına nativa, por exemplo, faixa de pH na qual ´e poss´ıvel manter os cristais coesos e presen¸ca de precipitantes como sulfato de amˆonio ou outros sais que possam competir com os ´atomos pesados por s´ıtios de liga¸c˜ao `a prote´ına.
Outro aspecto de fundamental importˆancia est´a na possibilidade de uso do sinal anˆomalo que pode resultar quando da inclus˜ao de ´atomos pesados no cristal. O espalhamento anˆomalo, que ´e uma fun¸c˜ao do comprimento de onda utilizado durante a coleta, pode ser otimizado atrav´es da escolha
2.3 Derivados de ´atomos pesados 28 de ´atomos pesados apropriados para o aparato experimental dispon´ıvel. No caso de difratˆometros convencionais, com comprimento de onda fixo, a esco- lha fica mais limitada. No caso de radia¸c˜ao s´ıncrotron, existe a possibilidade de selecionar o comprimento de onda desejado, havendo uma maior liber- dade de escolha. Entretanto, a intensidade da radia¸c˜ao s´ıncrotron depende do comprimento de onda e, na pr´atica, ´e utilizada uma faixa limitada de comprimentos de onda para os quais h´a intensidade suficiente para coleta de dados cristalogr´aficos. Esta faixa depende do s´ıncrotron onde a coleta ´e feita. No caso da β-manosidase, conjuntos de dados foram coletados em dois s´ıncrotrons muito diferentes, o LNLS e o ESRF. No primeiro, foram utilizados comprimentos de onda pr´oximos a 1.5 ˚A, bastante perto do comprimento de onda da linha Cu Kα (1.54 ˚A) dos difratˆometros convencionais, enquanto que no ESRF, o comprimento de onda onde a intensidade ´e maior est´a em torno de 1 ˚A (o que maximiza o sinal anˆomalo de ´atomos como Se e viabiliza o emprego de selenometioninas).
A Tabela 2.1 mostra o c´alculo te´orico (CROSSEC, CCP4, 1994; Winn et al., 1997) das componentes real (f0) e imagin´aria (f00) do fator de espa- lhamento atˆomico (Apˆendice A) dos ´atomos pesados presentes nos derivados de β-manosidase que foram coletados (Cap´ıtulo 3). No ESRF, apenas cris- tais “nativos” (contendo Cd) foram usados para coleta. A Tabela ilustra a varia¸c˜ao do sinal anˆomalo para dois comprimentos de onda. Se foi inclu´ıdo para compara¸c˜ao apenas.
2.3.2
Prepara¸c˜ao de cristais derivados
Normalmente, o processo de derivatiza¸c˜ao ´e feito a partir de cristais na- tivos, crescidos da maneira usual, nas condi¸c˜oes de cristaliza¸c˜ao previamente determinadas. Os cristais s˜ao transferidos para uma solu¸c˜ao onde foi acres- centado o reagente que cont´em o ´atomo pesado. Uma vez que n˜ao tenham
f0 f00 λ = 1.0˚A λ = 1.5˚A λ = 1.0˚A λ = 1.5˚A Cd -0.4468 -0.0825 2.2092 4.4480 Se -3.4770 -0.9357 0.5185 1.0845 Au -9.3039 -5.2288 9.5197 6.9941 Ag -0.4981 -0.0696 2.0274 4.0920 Eu -0.8273 -6.2647 6.5228 12.5103 Hg -12.1619 -5.1081 10.0235 7.3676 Pb -9.0076 -4.9095 4.2712 8.1549 Pt -8.4785 -5.3970 9.0510 6.6373 Sm -0.6970 -4.7558 6.1361 11.8122 U -5.9026 -5.2950 6.8472 12.8715
Tabela 2.1: f0 e f00 para dois comprimentos de onda.
sido detectados visualmente danos ao cristal, o modo de avaliar se o objetivo principal, que ´e a liga¸c˜ao de ´atomos pesadas `a mol´ecula de prote´ına, foi atin- gido, ´e atrav´es da coleta de dados e posterior busca de s´ıtios de liga¸c˜ao. O intervalo de tempo do banho (soaking) e a concentra¸c˜ao de reagente ideais s˜ao determinados experimentalmente.
As condi¸c˜oes do banho em solu¸c˜ao contendo ´atomos pesados devem ser compat´ıveis com as condi¸c˜oes de crioprote¸c˜ao pr´e-determinadas para os cris- tais nativos, um fator primordial para a coleta de dados.