Descrição do equipamento e acessórios utilizados

A análise dos microcontaminantes foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (high performance liquid

cromatograph/ high resolution mass spectrometry, HPLC/MS). O cromatógrafo líquido em

questão (figura 4.4) é equipado com um sistema binário de bombas (modelo LC-20AD Shimadzu) e um amostrador automático (modelo SIL 20AC - Shimadzu). O espectrômetro de massas (Shimadzu LC/IT/TOF) possui dois analisadores de massa em série: um capturador de íons (íon trap, IT) seguido por um Tempo de vôo (time of flight, TOF), que confere alta sensibilidade e resolução na obtenção de espectros. As duas fontes de ionização avaliadas nesse estudo foram: ionização por eletronebulização (electrospray ionization, ESI) e ionização química à pressão atmosférica (atmospheric pressure chemical ionization, APCI), sendo que, em ambas as fontes, utilizou-se uma voltagem de -3,5 kV, no caso da ionização negativa, e + 4,5 kV no caso da ionização positiva.

Figura 4.4: Cromatógrafo líquido acoplado ao espectrômetro de massas – HPLC/MS/IT/TOF (Shimadzu)

A separação cromatográfica foi feita por meio da coluna cromatográfica Kinetex C18 (50 × 3,0 mm; 2,6 µm - Phenomenex), figura 4.5, com temperatura do forno à 40 °C. O tempo de corrida inicialmente foi de 28 min. e o volume da amostra injetada foi de 10 µL.

O gradiente de concentração da fase móvel, apresentado na tabela 4.2, foi mantido o mesmo durante todo o estudo de otimização do método, sendo aprimorado na etapa de aperfeiçoamento do método. O metanol foi escolhido como constituinte da fase orgânica porque este é considerado um solvente orgânico aceptor de próton, que viabiliza uma ionização mais significativa dos analitos, no modo negativo. E a fase aquosa foi a água.

Tabela 4.2: Tempo de análise e o gradiente de concentração da fase móvel. Tempo de análise (min) % Fase orgânica (metanol)

0,0 a 5,0 Variação de 20 a 80 5,0 a 8,0 Estabilização a 80 8,0 a 15,0 Aumento para 95 15,0 a 20,0 Estabilização a 95 20,5 a 25,0 Redução para 20 25 a 28,0 Estabilização a 20

4.5.2 Desenvolvimento e otimização do método

A etapa de desenvolvimento e otimização do método consistiu em realizar um estudo minucioso da influência dos parâmetros mais significativos na resposta do sistema (figura 4.6), encontrando as condições analíticas ótimas para a quantificação simultânea dos microcontaminantes estudados. O critério de seleção das variáveis adotadas baseou-se na influência que elas proporcionariam na intensidade do sinal do sistema em estudo, considerando a função de cada parâmetro. Por exemplo, o estudo do tipo de interface utilizada (ESI ou APCI) é de fundamental importância, pois ela influencia a etapa de ionização, e cada uma delas apresenta um tipo de mecanismo diferente para ionizar os analitos de interesse, o que influi em especialidade e limitações para cada uma das técnicas de ionização. A composição da fase móvel além de poder influenciar a separação cromatográfica dos analitos, também poderia ser importante quanto à ionização dos mesmos dependendo da interface utilizada. E os demais parâmetros instrumentais, tais como: fluxo da fase móvel, temperatura da interface e do bloco de aquecimento, tempo de acumulação dos íons no octapolo, fluxo do gás de secagem poderiam contribuir com o aumento da dectabilidade do método de acordo com a fonte de ionização empregada.

Figura 4.6: Configuração do sistema estudado, identificando os parâmetros operacionais que

foram avaliados no desenvolvimento e otimização do método.

Para a concretização dessa etapa foi executado inicialmente um experimento de triagem com o interesse em se determinar as variáveis experimentais que provavelmente interferem no sistema e a influência de suas interações. Posteriormente ao experimento de triagem, as variáveis significativas foram selecionadas e uma metodologia de análise de superfícies de respostas pôde ser executada para otimização das condições operacionais estudadas.

TRIAGEM

Para a execução do experimento de triagem foi aplicado o planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, com triplicata no ponto central, para se obter o domínio experimental. Esse planejamento possibilita investigar em dois níveis (-1 e 1) a influência das variáveis experimentais de interesse e os efeitos de interação na resposta. Pelo fato de ser de resolução IV, esse planejamento não confunde efeitos principais entre si e nem com efeitos de interação entre duas variáveis, porém confunde efeitos principais com efeitos de interação entre três variáveis e os efeitos entre duas variáveis se confundem com outros efeitos, inclusive entre eles. O ponto central (nível zero) possui o valor médio dos níveis de todas as variáveis, sendo incluso no centro do planejamento experimental para se obter uma boa estimativa dos erros do modelo estatístico por meio da realização das replicatas apenas nesse ponto. Ele foi selecionado para realizar a etapa de triagem, pois permite obter as informações dos efeitos mais importantes e retirar, na maioria das vezes, as mesmas conclusões caso fosse realizado um fatorial completo, porém com menos ensaios experimentais.

Nessa triagem, investigaram-se os possíveis parâmetros e suas interações que poderiam afetar significativamente a intensidade do sinal do sistema. Os parâmetros qualitativos selecionados foram fonte de ionização (APCI e ESI) e tipo de modificadores da fase móvel

(ácido fórmico, hidróxido de amônio e ácido fórmico/formiato de amônio) e, para os parâmetros quantitativos, estudou-se a concentração dos modificadores da fase móvel, taxa de fluxo da fase móvel, temperatura interface, tempo de acumulação de íons no octapolo e taxa do fluxo de secagem do gás.

Para a realização do estudo as variáveis foram agrupadas em seis subsistemas. Para cada subsistema investigado foi realizado um planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, com triplicata no ponto central, portanto a triagem foi composta por seis planejamentos experimentais. Em três subsistemas investigaram-se a fonte de ionização APCI inserindo quatro variáveis: concentração dos modificadores da fase móvel (C1), taxa de fluxo da fase móvel (C2), temperatura de interface (C3) e tempo de acumulação de íons no octapolo (C4), sendo que para cada um desses subsistemas foi estudado um tipo de modificador de fase móvel. Os outros três subsistemas delimitados investigaram o ESI como fonte de ionização e as quatro variáveis: concentração dos modificadores da fase móvel (C1), taxa de fluxo da fase móvel (C2), temperatura do bloco de aquecimento (C3) e taxa de fluxo de secagem de gás (C4), agregando o estudo de um tipo de modificador de fase móvel para cada um desses subsistemas. A figura 4.7 esquematiza a estratégia empregada na triagem.

APCI Hidróxido de amônio Ácido fórmico Ácido fórmico/formiato de amônio C1 C2 _C3 C4 C1 C2 _C3 C4 C1 C2 _C3 C4 Subsistema 1 (Planejamento 1) Subsistema 2 (Planejamento 2) Subsistema 3 (Planejamento 3)

C1: Concentração do modificador da fase móvel C2: Fluxo da fase móvel

C3: Temperatura da Interface

C4: Tempo de acumulação de íons no octapolo

ESI Hidróxido de amônio Ácido fórmico Ácido fórmico/formiato de amônio C1 C2 _C3 C4 C1 C2 _C3 C4 C1 C2 _C3 C4 Subsistema 4 (Planejamento 4) Subsistema 5 (Planejamento 5) Subsistema 6 (Planejamento 6)

C1: Concentração do modificador da fase móvel C2: Fluxo da fase móvel

C3: Temperatura do bloco de aquecimento C4:Fluxo do gás de secagem

Figura 4.7: Sistemática utilizada na triagem, mostrando os seis planejamentos executados.

Em todos os subsistemas estudados a concetração dos modificadores foram variadas da mesma maneira, sendo que para o modificador de fase hidróxido de amônio a concentração estudada no menor nível (-1) foi de 1,5 mM e no maior nível (+1) foi de 4,5 mM, com o ponto central (0) 3,0 mM. Já o modificador ácido fórmico foi investigado em uma concentração de 2,6 mM no menor nível e 26,1 mM no maior nível, com o ponto central 14,4 mM. Para o

modificador ácido fórmico/formiato de amônio a concentração avaliada foi de 26,1 mM de ácido fórmico com 1,6 mM de formiato de amônio no menor nível e 182,7 mM de ácido fórmico com 31,8 mM de formiato de amônio no maior nível, e o ponto central com 104,4 mM de ácido fórmico com 16,7 mM de formiato de amônio.

As demais variáveis modificaram de acordo com o tipo de fonte avaliada. No caso dos subsitemas que investigaram o efeito da APCI, as variáveis fluxo da fase móvel, temperatura da interface e tempo de acumulação de íons no octapolo foram estudadas numa mesma faixa independendo do modificador utilizado. O fluxo da fase móvel foi estudado em 0,2 mL/min no menor nível e em 0,5 mL/min no maior nível, a temperatura da interface foi investigada em 350 °C no menor nível e a 500°C no maior nível, e o tempo de acumulação no octapolo foi analisado em 10 ms no menor nível e 100 ms no maior nível.

Já para o subsistemas que exploraram a influência do ESI, as variáveis fluxo da fase móvel, temperatura do bloco de aquecimento e fluxo do gás de secagem variaram da mesma forma para esses subsistemas independendo do modificador de fase móvel utilizado. O fluxo da fase móvel para esses subsistemas foi avaliado numa faixa de 0,1 à 0,3 mL/min, a temperatura do bloco de aquecimento de 200 à 300°C e o fluxo do gás de secagem de 100 à 200 kPa.

Para a montagem dos planejamentos e tratamentos dos resultados foram utilizadas planilhas eletrônicas para cálculos de planejamentos experimentais, disponíveis no endereço eletrônico do Laboratório de Quimiometria Teórica e Aplicada (LQTA) da Universidade de Campinas – UNICAMP (Teófilo et al., 2010). Os níveis adotados pelo planejamento para cada ensaio experimental e os respectivos valores codificados das variáveis experimentais podem ser visualizados na tabela 4.3. As repetições foram realizadas em torno do ponto central (PC) num total de três.

Tabela 4.3: Planejamento fatorial fracionário 24-1_{, resolução IV aplicado na otimização dos}

parâmetros operacionais do LCMS-IT-TOF para determinação de microcontaminantes emergentes. Planejamento Ensaio (C1) Concentração do agente modificador de fase móvel (C2) Fluxo da fase móvel (C3) Temperatura da interface (APCI) ou temperatura do bloco de aquecimento (ESI) (C4) Tempo de acumulação de íons no octapolo (APCI)

ou Fluxo do gás de secagem (ESI) 1 -1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 1 3 -1 1 -1 1 4 1 1 -1 -1 5 -1 -1 1 1 6 1 -1 1 -1 7 -1 1 1 -1 8 1 1 1 1 PCa 0 0 0 0

Nota: aPonto central com 3 replicatas; 1 ( nível de maior valor), -1 (nível de menor valor) e 0 (nível intermediário).

A análise procedeu-se sob o modo SCAN positivo e SCAN negativo sequencialmente, no caso do emprego da fonte de ionização APCI e simultaneamente no caso da utilização do ESI. As respostas foram dadas nos valores de área de pico cromatográfico obtida pela injeção de 10 µL de uma solução contendo todos os padrões de microcontaminantes em estudo preparadas em metanol, na concentração de 60 µg/L. Os compostos foram identificados pelos seus íons moleculares, obtidos por espectros de massa exata (<10 ppm) e alta resolução (10.000 FWHM). Assim, foi possível avaliar o comportamento individual dos analitos quando submetidos a cada grupo de variáveis estabelecidas.

Com os resultados obtidos foram selecionados dois subsistemas, um de cada fonte de ionização, discriminando qual o tipo de modificador de fase móvel apresentou a melhor resposta para cada um desses subsistemas. Posteriormente analisou-se a magnitude das variáveis quantitativas com seus respectivos efeitos para a obtenção de um domínio experimental que foi explorado com mais profundidade na etapa da construção da superfície de resposta.

METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA

A metodologia de superfície de resposta foi aplicada posteriomente a triagem para investigar com maior profundidade as variáveis que possuíram maiores influências nas respostas e explorar com mais detalhes a região experimental delimitada por meio da triagem. Para a concretização dessa etapa foi aplicado o planejamento experimental Doehlert, que possibilitou avaliar as variáveis mais importantes em mais níveis e as menos importantes em menos níveis.

O modelo foi investigado para cada analito ao nível de significância de 0,05 e com cinco replicatas no ponto central, a fim de validar o modelo pela estimativa da variância experimental. Para a execução do planejamento redefiniu-se a faixa de trabalho, explorando as variáveis quantitativas que foram significativas considerando sua magnitude. O hidróxido de amônio foi definido pela triagem como o modificador de fase móvel mais indicado para a determinação da maioria dos microcontaminantes, portanto ele foi selecionado entre os demais modificadores estudados para ser explorado na metodologia de superfície de resposta. Apenas três variáveis quantitativas mostraram-se relevantes para prosseguir na otimização, sendo que em cada subsistema a magnitude delas se apresentou diferente. Para o subsistema que é composto pela fonte de ionização ESI a variável que apresentou maior magnitude foi o fluxo da fase móvel, seguida da concentração do modificador da fase móvel e da temperatura da interface, que apresentou menor magnitude. Já o subsistema que empregou a APCI a ordem decrescente da magnitude das variáveis foi: temperatura de interface, fluxo da fase móvel e concentração do modificador da fase móvel. A tabela 4.4 apresenta as variáveis quantitativas e as novas faixas de trabalho estudadas para os subsistemas empregando o ESI e a APCI, destacando-se as suas relevâncias na influência do sistema.

Tabela 4.4: Variáveis e níveis decodificados investigados no planejamento experimental

Doehlert, modelo quadrático com três variáveis quantitativas, para a otimização do método cromatográfico para determinação de microcontaminantes emergentes empregando o ESI ou a

APCI.

Fonte de

ionização Variáveis Níveis decodificados

APCI

Concentração de hidróxido de amônio

(mM)

1,00 2,25 3,5 4,75 6,00 Fluxo da fase móvel

(mL/min) 0,0500 0,0917 0,1332 0,1750 0,2167 0,2582 0,3000 Temperatura do bloco de

aquecimento (°C) 200 250 300

ESI

Fluxo da fase móvel

(mL/min) 0,3 0,375 0,45 0,525 0,6 Temperatura da interface (°C) 250 275 300 325 350 375 400 Concentração de hidróxido de amônio (mM) 0,5 1,25 2,0

As respostas cromatográficas foram dadas em valores de área de pico cromatográfico. Posteriormente foram calculados os efeitos das variáveis e construídos os modelos de regressão por meio de planilhas eletrônicas, disponíveis no endereço eletrônico do Laboratório de Quimiometria Teórica e Aplicada (LQTA) da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP (Teófilo et al., 2010). Os níveis adotados pelo planejamento para cada ensaio experimental e os respectivos valores decodificados das variáveis experimentais podem ser visualizados na tabela 4.5. As repetições foram realizadas em torno do ponto central (PC) num total de cinco.

Tabela 4.5: Planejamento experimental Doehlert aplicado na otimização dos parâmetros

operacionais do LCMS-IT-TOF, nos subsistemas que investigaram o uso da APCI e do ESI, para determinação de microcontaminantes emergentes.

Planejamento Ensaio APCI ESI Fluxo da fase móvel (mL/min) Temperatura da interface (°C) Concentração de hidróxido de amônio (mM) Concentração de hidróxido de amônio (mM) Fluxo da fase móvel (mL/min) Temperatura do bloco de aquecimento (°C) 1 0,6000 325 1,25 6,00 0,1750 250 2 0,5250 400 1,25 4,75 0,3000 250 3 0,5250 350 2,00 4,75 0,2167 300 4 0,3000 325 1,25 1,00 0,1750 250 5 0,3750 250 1,25 2,25 0,0500 250 6 0,3750 300 0,50 2,25 0,1333 200 7 0,5250 250 1,25 4,75 0,0500 250 8 0,5250 300 0,50 4,75 0,1333 200 9 0,3750 400 1,25 2,25 0,3000 250 10 0,4500 375 0,50 3,50 0,2583 200 11 0,3750 350 2,00 2,25 0,2167 300 12 0,4500 275 2,00 3,50 0,0917 300 PCa 0,4500 325 1,25 3,50 0,1750 250

Nota: aPonto central com cinco replicatas

Para avaliar os modelos matemáticos propostos para cada microcontaminante foi investigado o gráfico de regressão para verificar se esse é aplicado ao modelo proposto, ou seja, se ele apresenta um coeficiente de correlação (R²) que seja capaz de descrever a relação entre as áreas observadas (x) e as áreas estimadas (y). Também foi investigado o gráfico de resíduos do modelo para analisar se os dados apresentam comportamento aleatório, e que não apresente erro sistemático, o ideal é que os dados estejem bem distribuídos.

Análise de variância (ANOVA) foi utilizada para avaliar a qualidade do ajuste do modelo. A ANOVA investiga se a regressão é significativa e se existe falta de ajuste do modelo. O ideal é que a maior parte da variação total das observações em torno da média seja descrita pela equação de regressão e o restante pelos resíduos. Da variação que fica com os resíduos é esperado que a maior parte fosse atribuída ao erro puro, que é o erro experimental, e não com a falta de ajuste, que está diretamente relacionada com o modelo. Para essa análise foi

aplicado o teste F, no qual a hipótese nula (H0) admitia que não existisse diferença entre as

fontes de variação comparadas. Esta hipótese se reflete na seguinte regra de decisão:

a) Rejeição da hipótese nula com 0,05 de significância, quando o valor de Fcalculado se situar

fora do intervalo definido por Fα (|Fcalculado| ≥Fα), ou seja, p ≤ α = 0,05. Isso equivale a

dizer que o valor estatístico amostral observado é significativo ao nível de 5% de significância e as fontes de variação comparadas são diferentes.

b) Aceitação da hipótese nula, caso contrário, Fα (|Fcalculado| < Fα), ou seja, p > α = 0,05.

Isso equivale a dizer que o valor estatístico amostral observado não é significativo no nível de 5% de significância e as fontes de variação comparadas são iguais.