Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE MICROCONTAMINANTES
EMERGENTES EM ÁGUAS SUPERFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Keila Letícia Teixeira Rodrigues
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Keila Letícia Teixeira Rodrigues
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA DETERMINAÇÃO SIMULTÂNEA DE MICROCONTAMINANTES
EMERGENTES EM ÁGUAS SUPERFICIAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do título: “Mestre em
Engenharia Ambiental – Área de Concentração: Meio
Ambiente”
Orientador: Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
R696d Rodrigues, Keila Letícia Teixeira.
Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação simultânea de microcontaminantes emergentes em águas superficiais por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas [manuscrito] / Keila Letícia Teixeira Rodrigues – 2012.
156f. : il. color.; grafs.; tabs.; mapas.
Orientador: Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas e Pós-graduação em
Recursos Hídricos. Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental. Área de concentração: Meio Ambiente.
1. Águas superficiais - Teses. 2. Fármacos - Teses. 3. Cromatografia líquida - Teses. 4. Espectrometria de massa - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 628.32:543.42
“
Algo só é impossível até que alguém
duvide e resolva provar o contrário
.”
Agradeço a Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força para superar as dificuldades, mostrar os caminhos certos nas horas incertas e por suprir todas as minhas necessidades.
À minha mãe, por ser um exemplo de mulher, ter me apoiado sempre e colaborado para a realização dos meus sonhos. À minha irmã Cátia por ser sempre atenciosa e amiga. Aos meus irmãos Carlos e César pelo apoio e carinho. Aos meus cunhados Nivaldo e Glauciene pelo incentivo. Aos meus sobrinhos pela alegria. Ao meu primo Daniel por ter sido um grande amigo em Ouro Preto.
À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e estímulo.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Robson José de Cássia Franco Afonso, pelo seu grande profissionalismo e dedicação. Por contribuir para o meu crescimento profissional e por ser também um exemplo a ser seguido. Sua participação foi fundamental para a realização deste trabalho.
À Profª Dra. Gilmare Antônia da Silva por sua atenção, paciência e pela grande contribuição fornecida ao trabalho com sua experiência na área de quimiometria. Ao Prof. Dr. Maurício Xavier Coutrim por estar sempre disposto a ajudar com sua experiência.
Aos professores do curso de graduação e pós-graduação por todo o conhecimento compartilhado e aos colegas do mestrado pela amizade e companheirismo.
Aos amigos do laboratório Bárbara, Amanda, Rafaela, Júlia, Fernanda Queiroz, Júlio, Bruno Baeta, Carlúcio, Taciana, Gustavo, Regiane, Débora, Claúdia, Dani, Raíssa, André, Luciana, Ramon pelo companheirismo, ajuda e amizade. Em especial a Ananda pelos conselhos e por estar sempre disposta a ajudar. Vocês foram minha segunda família em Ouro Preto!
Aos amigos, em especial aos amigos do colegial Dias, Ives e Gilmar e aos amigos da faculdade Alexandre, Amália, Ariane, Paula, Sílvia e Natália, que mesmo de longe torceram por mim.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
1.
INTRODUÇÃO ... 17
2.
OBJETIVO ... 20
2.1 Geral ... 20
2.2 Específicos ... 20
3.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 21
3.1 Caracterização geral da bacia do Rio Doce ... 21
3.2 Microcontaminantes Emergentes ... 23
3.2.1 Fontes de contaminação ... 26
3.2.2 Classes de Microcontaminantes ... 27
FÁRMACOS ... 28
PLASTIFICANTES ... 35
SUBPRODUTOS DE DETERGENTES ... 35
HORMÔNIOS NATURAIS E SINTÉTICOS ... 36
3.3 Métodos analíticos utilizados para determinar microcontaminantes em matrizes ambientais ... 40
3.3.1 Efeito Matriz ... 42
3.3.2 Preparo da amostra ... 44
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO (LLE) ... 44
MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) ... 44
A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE) ... 45
3.3.3 Condições cromatográficas e espectrométricas ... 47
3.4 Quimiometria ... 56
4.
METODOLOGIA ... 58
4.1 Região de Estudo ... 58
4.2 Reagentes e consumíveis ... 60
4.3 Procedimentos de coleta e preservação ... 60
4.4 Procedimento de preparação da amostra ... 61
4.4.1 Filtração e ajuste de pH ... 61
4.4.2 Extração ... 62
4.5 Cromatografia ... 64
METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA ... 70
4.5.3 Aperfeiçoamento do método otimizado ... 73
4.6.1 Seletividade do método ... 76
4.6.2 Ajuste da curva analítica ... 76
4.6.3 Limite de detecção/limite de quantificação ... 77
4.6.4 Precisão ... 78
4.6.5 Exatidão ... 79
4.7 Aplicação do método desenvolvido na análise de amostras das águas superficiais ... 81
5.
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ... 82
5.1 Região de Estudo ... 82
5.2 Desenvolvimento e otimização do método ... 93
5.2.1 Otimização dos parâmetros operacionais ... 93
TRIAGEM ... 93
METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA ... 103
5.3 Validação ... 108
5.3.1 Seletividade ... 108
5.3.2 Ajuste da curva analítica ... 114
5.3.3 Limite de detecção e Limite de Quantificação ... 122
5.3.4 Precisão ... 123
5.3.5 Exatidão ... 125
5.4 Aplicação da metodologia desenvolvida na análise das amostras de águas superficiais da bacia do Rio Doce ... 131
FÁRMACOS ... 131
PLASTIFICANTES ... 135
SUBPRODUTOS DE DETERGENTES ... 138
HORMÔNIOS ... 140
6.
CONCLUSÕES ... 145
7.
PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS ... 147
Figura 3.1: Localização da bacia do Rio Doce. ... 21
Figura 3.2: Unidades de análise da bacia do Rio Doce. ... 22
Figura 3.3: Principais fontes de contaminação de Microcontaminantes no meio ambiente. ... 27
Figura 3.4: Esquema dos componentes de uma fonte ESI. ... 41
Figura 3.5: Esquema dos componentes de uma fonte APCI ... 42
Figura 3.6: Grupo ligante do cartucho Strata X. ... 47
Figura 3.7: Grupo ligante do cartucho Oasis HLB. ... 47
Figura 4.1: Diagrama sistemático do procedimento de preparo de amostra. ... 61
Figura 4.2: Sistema de filtração utilizado nesse estudo. ... 62
Figura 4.3: (a) Manifold utilizado para a etapa de condicionamento, clean up e eluição dos cartuchos; (b) aparato de extração utilizado para a passagem da amostra e (c) cartucho empregado no procedimento de extração. ... 63
Figura 4.4: Cromatógrafo líquido acoplado ao espectrômetro de massas – HPLC/MS/IT/TOF (Shimadzu) ... 64
Figura 4.5: Coluna cromatográfica Kinetex C18 (50 × 3,0 mm; 2,6 µm - Phenomenex) ... 64
Figura 4.6: Configuração do sistema estudado, identificando os parâmetros operacionais que foram avaliados no desenvolvimento e otimização do método. ... 66
Figura 4.7: Sistemática utilizada na triagem, mostrando os seis planejamentos executados. ... 67
Figura 5.1: Gráfico de pesos definidos pela 1 e 2° componentes principais mostrando os discriminantes químicos (indicadores da qualidade da água) das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce no período de 2008 à 2010. ... 82
Figura 5.2: Gráfico bidimensional de valores correspondentes à classificação de 192 amostras de águas superficiais das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce no período de 2008 à 2010. ... 84
Figura 5.3: Mapa de localização das estações de coleta selecionadas para o estudo ao longo da Bacia do Rio Doce . ... 85
Figura 5.4: Ponto de amostragem (RD079) no Rio do Peixe, a montante de sua foz no rio Santo Antônio, na cidade Carmésia. ... 89
Figura 5.7: Ponto de amostragem (RD077) no Rio Santo Antônio próximo à sua nascente, nas proximidades da cidade Conceição do Mato Dentro. ... 92 Figura 5.8: Resultado dos ensaios obtidos através do planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, com triplicata no ponto central para cada subsistema estudado mostrando o percentual de analitos em relação as suas três melhores respostas (área) e a pior resposta. 94 Figura 5.9: Avaliação da eficiência dos modificadores de fase móvel investigados no subsistemas que estudaram o uso da APCI (a) e do ESI (b)... 96 Figura 5.10: Cromatogramas dos melhores ensaios obtidos na triagem, modo SCAN, utilizando as fontes de ionização APCI (à esquerda) e ESI (à direita) para avaliação da resolução e eficiência de separação proporcionada pelos modificadores de fase móvel investigados. ... 97 Figura 5.11: Gráfico de probabilidade normal do analito 4-nonilfenol para o planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, com fase móvel água / metanol utilizando o modificador de fase hidróxido de amônio e fonte de ionização APCI. ... 98 Figura 5.12: Gráfico de probabilidade normal do analito bezafibrato para o planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, com fase móvel água/metanol utilizando o modificador de fase hidróxido de amônio e fonte de ionização ESI. ... 99 Figura 5.13: Distribuição dos efeitos das variáveis sobre a resposta de interesse, empregando a APCI e o modificador de fase hidróxido de amônio. C1 (concentração do hidróxido de amônio), C2 (fluxo da fase móvel), C3 (temperatura da interface) e C4(tempo de acumulação do octapolo) foram as variáveis investigadas nesse sistema. ... 100 Figura 5.14: Distribuição dos efeitos sobre a resposta de interesse, empregando o ESI e o modificador de fase hidróxido de amônio. C1 (concentração do hidróxido de amônio), C2 (fluxo da fase móvel), C3 (temperatura do bloco de aquecimento) e C4(fluxo do gás de secagem) foram as variáveis investigadas nesse sistema. ... 101 Figura 5.15: a) Gráfico do modelo de calibração proposto para o diltiazem b) Gráfico de resíduos para o modelo de calibração do diltiazem. ... 103
obtidos pela análise da amostra RD059 fortificada com 30 µg/L dos padrões dos analitos de interesse. ... 113 Figura 5.20: Curvas analíticas dos fámacos estudados obtidas por calibração externa. .... 118
Figura 5.21: Curvas analíticas dos plastificantes, subprodutos de detergentes, e hormônios estudados obtidas por calibração externa. ... 119
Figura 5.22: Avaliação do resíduo obtido para o modelo de calibração linear do composto 4-nonilfenol por meio dos gráficos de (a) probabilidade normal dos resíduos, (b) resíduos
versus os valores ajustados, (c) histograma dos resíduos e (d) resíduos versus ordem dos
dados. ... 120 Figura 5.23: Avaliação do resíduo obtido para o modelo de calibração quadrática do composto bezafibrato por meio dos gráficos de probabilidade normal dos resíduos (a), resíduos versus os valores ajustados (b), histograma dos resíduos (c) e resíduos versus
ordem dos dados (d). ... 121
Figura 5.24: Boxplot da distribuição dos fármacos nas amostras de águas superficiais das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce, sendo N o número de estações de coletas que apresentaram o analito acima do LQ. ... 132 Figura 5.25: Distribuição da cafeína nas amostras das estações de coleta agrupadas de acordo com suas características antropogênicas e geológicas. ... 134 Figura 5.26: Boxplot da distribuição dos plastificantes nas amostras de águas superficiais das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce, sendo N o número de estações de coletas que apresentaram o analito acima do LQ. ... 136 Figura 5.27: Distribuição do bisfenol-A nas amostras das estações de coleta agrupadas de acordo com suas características antropogênicas e geológicas. ... 137 Figura 5.28: Boxplot da distribuição dos subprodutos de detergentes nas amostras de águas superficiais das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce, sendo N o número de estações de coletas que apresentaram o analito acima do LQ. ... 139 Figura 5.29: Boxplot da distribuição dos hormônios nas amostras de águas superficiais das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce, sendo N o número de estações de coletas que apresentaram o analito acima do LQ. ... 141 Figura 5.30: Gráfico de pesos definidos pela 1 e 2° componentes principais mostrando os discriminantes químicos (indicadores da qualidade da água) das estações de coleta ao longo da bacia do Rio Doce no período de 2008 à 2010. ... 142
Tabela 3.1: Estrutura e propriedades físico-químicas das classes dos fármacos estudados. 31
Tabela 3.2: Estrutura e propriedades físico-químicas dos plastificantes, hormônios e subproduto de detergentes estudados. ... 38 Tabela 3.3: Revisão da literatura de monitoramento e métodos de LC/MS empregados para a determinação quantitativa de fármacos em águas superficiais. ... 50 Tabela 3.4: Revisão da literatura de monitoramento e métodos de LC/MS utilizados para a determinação quantitativa dos plastificantes, hormônios, subprodutos de detergentes em amostras de águas superficiais. ... 53 Tabela 4.1: Lista dos parâmetros manipulados e seus respectivos códigos ... 59 Tabela 4.2: Tempo de análise e o gradiente de concentração da fase móvel. ... 65 Tabela 4.3: Planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV aplicado na otimização dos parâmetros operacionais do LCMS-IT-TOF para determinação de microcontaminantes emergentes. ... 69
Tabela 4.4: Variáveis e níveis decodificados investigados no planejamento experimental Doehlert, modelo quadrático com três variáveis quantitativas, para a otimização do método cromatográfico para determinação de microcontaminantes emergentes empregando o ESI ou a APCI. ... 71 Tabela 4.5: Planejamento experimental Doehlert aplicado na otimização dos parâmetros operacionais do LCMS-IT-TOF, nos subsistemas que investigaram o uso da APCI e do ESI, para determinação de microcontaminantes emergentes. ... 72 Tabela 4.6: Parâmetros espectrométricos adotados na determinação dos microcontaminantes. ... 74 Tabela 4.7: Tempo de análise e variação da fase móvel. ... 75
Tabela 5.1: Descrição dos pontos de amostragem selecionados ao longo da bacia do Rio Doce. ... 86
Tabela 5.2: Domínio experimental definido pela triagem dos parâmetros operacionais investigados para o subsistema que empregou a APCI e para o que fez uso do ESI. ... 103
se o parâmetro regressão e ajuste do modelo é significativo ou não significativo. ... 106 Tabela 5.6: Área média e o coficiente de variação das sete repetições de cada concentração dos padrões de fármacos empregados para a construção das curvas analíticas... 115 Tabela 5.7: Área média e o coficiente de variação das sete repetições de cada concentração dos padrões de plastificantes, subprodutos de detergentes e hormônios empregados para a construção das curvas analíticas. ... 116 Tabela 5.8: Limites de detecção e quantificação do método considerando limites do equipamento, correções de diluição, rendimento de extração e efeitos da matriz... 122
Tabela 5.9: Resultados dos testes de precisão para os fármacos. ... 123 Tabela 5.10: Resultados dos testes de precisão para os plastificantes, subprodutos de detergentes, e hormônios. ... 124
Tabela 5.11: Índice de recuperação para os fármacos estudados nos três níveis de concentração. ... 125
Tabela 5.12: Valores de recuperação da extração para os plastificantes, subprodutos de detergentes, e hormônios estudados nos três níveis de concentração. ... 126 Tabela 5.13: Médias de recuperação dos diferentes níveis de concentração e os parâmetros do modelo de calibração para a extração. ... 127 Tabela 5.14: Avaliação do efeito matriz nos diferentes níveis de concentração para cada fármaco utilizado. ... 128 Tabela 5.15: Avaliação do efeito matriz nos diferentes níveis de concentração para cada plastificantes, subprodutos de detergentes, e hormônios estudados. ... 130 Tabela 5.16: Ocorrência dos fármacos nas estações de coleta localizadas na bacia do Rio Doce em ng/L. ... 131 Tabela 5.17: Ocorrência dos plastificantes nas estações de coleta localizadas na bacia do Rio Doce em ng/L. ... 135 Tabela 5.18: Ocorrência dos subprodutos de detergentes nas estações de coleta localizadas na bacia do Rio Doce em ng/L. ... 138
ACET Acetaminofeno
ACN Acetonitrila
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC Association of Official Analytical Chemists
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization
APPI Atmospheric Pressure Photoionization
ARCEM Austrian Research Cooperation on Endocrine Modulators
BEZ Bezafibrato
CAF Cafeína
CBHs Comitês das Bacias Hidrográficas
CCD Central Composite Design
CENIBRA Celulose Nipo-Brasileira S/A
CETEC/MG Centro Tecnológico de Minas Gerais
COMPREHEND Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and
Environmental Hormones
CSTEE Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment
CV Coeficiente de Variação
CVRD Companhia Vale do Rio Doce
DIL Diltiazem
DO1 Comitê de Bacia Hidrográfica do Rio Piranga
DO2 Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Piracicaba
DO3 Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Santo Antonio
DO4 Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Suaçuí
E- Evento realizado no modo Negativo
E+ Evento realizado no modo Positivo
EDSP Endocrine Disruption Screening Program
EDSTAC Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee
EDTA Endocrine Disrupter Testing and Assessment Task Force
ESI Electrospray Ionization
ETE Estações de Tratamento de Esgoto
FDA United States Food and Drug Administration
FEM Fator de correção do Efeito Matriz
FFCDA Federal Food, Drug and Cosmetic
Frepulsão Força de repulsão
FWHM Full width at half maximum
ɤ líquido Tensão superficial do líquido
GC Gas Chromatography
GEN Genfibrozila
HPLC High Performance Liquid Cromatograph
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IBU Ibuprofeno
ICH International Conference on Harmonization
IGAM Instituto Mineiro de Gestão das Águas
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Instrumental
ISO International Standards Organization
IT Ion Trap
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LC Liquid Chromatography
LD Limite de Detecção
LLE Liquid-Liquid Extraction
LQ Limite Quantificação
MEOH Metanol
MIC Miconazol
MM Massa Molecular
MS Mass Spectrometry
NAPR Naproxeno
NE Não Encontrado
PC Ponto Central
PCA Principal Component Analysis
PVC Policloreto de Polivinila
Q1 1° Quadrante
Q2 2° Quadrante
Q3 3° Quadrante
RASBQ Reunião Anual da sociedade Brasileira de Química
SCAN Escaneamento de íons
SIM Selected Ion Monitoring
SPE Solid Phase Extraction
SPME Solid Phase Microextraction
SULF Sulfametoxazol
TOF Time off flight
TRI Trimetoprima
UPGRH Planejamento e Gestão dos Recursos Hídricos
Os microcontaminantes emergentes são indicadores de atividade antrópica e estão associados a um conjunto diversificado de compostos orgânicos que é usado em grandes quantidades pela sociedade para diversos fins. O interesse crescente por essas substâncias ocorre, principalmente, porque elas podem apresentar atividade biológica em concentrações muito baixas, o que confere grande relevância ambiental. A dificuldade para detectar e quantificar os microcontaminantes no meio ambiente incentiva o desenvolvimento de métodos analíticos adequados. Assim, esse trabalho focou no desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação simultânea de microcontaminantes em amostras de águas superficiais. Realizou-se um estudo sistemático de detecção simultânea de 25 microcontaminantes, os quais incluíram: fármacos, plastificantes, hormônios e subprodutos de detergente, por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas de alta resolução, empregando o planejamento fatorial fracionário 24-1, resolução IV, na triagem e planejamento Doehlert na otimização. Os parâmetros qualitativos selecionados foram fonte de ionização (APCI e ESI) e tipo de modificadores da fase móvel (ácido fórmico, hidróxido de amônio e ácido fórmico/formiato de amônio), e para os parâmetros quantitativos avaliou-se a concentração dos modificadores da fase móvel, taxa de fluxo da fase móvel, temperatura da interface, temperatura do bloco de aquecimento, o tempo de acumulação de íons no octapolo e a taxa do fluxo do gás secagem. Verificou-se que o modificador de fase hidróxido de amônio numa concentração de 3,5 mM, empregando a fonte de ionização ESI com um fluxo de 0,1 mL/min, uma temperatura do bloco de aquecimento à 300°C e pressão de 200 kPa de gás de secagem proporcionaram a condição mais apropriada para a análise simultânea dos microcontaminantes estudados. O método desenvolvido e validado, utilizando a extração em fase sólida, é aplicável para a determinação simultânea de 17 microcontaminantes dentre os avaliados, incluindo os farmácos sulfametoxazol, trimetoprima, ibuprofeno, naproxeno, acetaminofeno, bezafibrato, genfibrozila, cafeína, miconazol e ditiazem; os plastificantes bisfenol-A e dietilftalato; os subprodutos de detergentes 4-octilfenol e 4-nonilfenol; os hormônios naturais estrona e 17β-estradiol; e o hormônio sintético
17α-etinilestradiol. Foram obtidos limites de detecção do método que variaram de 0,38 à 9,55 ng/L com mediana de 1,49 ng/L; e limites de quantificação do método numa faixa de 1,26 à 31,80 ng/L com mediana de 4,98 ng/L. O método desenvolvido foi aplicado na avaliação da ocorrência dos microcontaminantes emergentes nas águas superficiais ao longo da bacia do Rio Doce - MG/Brasil. O 4-nonilfenol foi o microcontaminante mais encontrado nas amostras, seguido da cafeína, bisfenol-A, ibuprofeno e bezafibrato. O diltiazem não foi encontrado em nenhuma das amostras e o miconazol ocorreu raramente.
The emerging microcontaminants are indicators of anthropogenic activity and are associated with a diverse set of organic compounds that are used in large quantities by the society for various purposes. The growing interest in these substances occurs mainly because they may have biological activity at low concentrations, which gives them great environmental relevance. The difficulty to detect and quantify these microcontaminants in the environment encourages the development of appropriate analytical methods. Thus, this work focused on the development of analytical methods for the simultaneous determination of microcontaminants in surface water samples. It was carried out a systematic study of simultaneous detection of 25 microcontaminants, which included: pharmaceutical compounds, plasticizers, hormones and detergent by-products, by liquid chromatography coupled to mass spectrometry of resolution high, using the 24-1 fractional factorial experimental design, resolution IV , for screening and Doehlert experimental design in optimization. The qualitative parameters selected were ionization source (APCI and ESI), and the type of mobile phase modifiers (formic acid, ammonium hydroxide and formic acid / ammonium formate). The quantitative parameters evaluated were phase modifiers concentrations, mobile phase flow rate, interface temperature, heating block temperature, ion accumulation time in the octapolo and drying gas flow rate. It was found that the phase modifier ammonium hydroxide in a concentration of 3.5 mM, using ESI ionization source with a flow of 0.1 mL/min, heating block temperature to 300°C and 200kPa of drying gas provided the most suitable condition for the simultaneous determination of studied microcontaminants. The method developed and validated, using the solid phase extraction, is applicable to the simultaneous determination of 17 microcontaminants among those evaluated, including the pharmaceutical compounds sulfamethoxazole, trimethoprim, ibuprofen, naproxen, acetaminophen, bezafibrate, gemfibrozil, caffeine, miconazole and ditiazem, the plasticizers bisphenol-A and diethylphthalate; the detergent by-products 4-octylphenol and 4-nonylphenol; the natural hormones estrone and 17β-estradiol, and the synthetic hormone 17α-ethinylestradiol. The obtained method’s detection limit ranged from 0.38 to 9.55 ng/L with median of 1.49 ng/L
and method’s quantification limit a ranged from 1.26 to 31.80 ng/L with median 4.98 ng/L.
The developed method was applied to evaluate the occurrence of emerging microcontaminants in surface waters along the basin of the Rio Doce - MG / Brazil. The 4-nonylphenol was the microcontaminante mostly found in the samples, followed by caffeine, bisphenol-A, ibuprofen and bezafibrate. Diltiazem was not found in any samples and miconazole occurred rarely.
1.
INTRODUÇÃO
Atualmente, o reconhecimento relativo à contaminação do meio ambiente por substâncias químicas levou a sociedade a acentuar o interesse por outros poluentes, também conhecidos por contaminantes emergentes. Eles afetam a saúde e o bem-estar de uma comunidade de diversas formas. Eles são candidatos a regulamentações futuras, estando apenas dependentes dos resultados das pesquisas relacionadas aos potenciais efeitos nos ecossistemas e aos dados de monitoramento da respectiva ocorrência no meio ambiente (Silva, 2010). Em muitos países, ações governamentais e não-governamentais buscam definir parâmetros universais de debate sobre o tema, abrangendo a minimização de substâncias químicas, o estabelecimento de normas e condutas. Os Estados Unidos por meio da Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (United States Environmental
Protection Agency, US EPA) e a União Europeia têm publicado listas selecionando
substâncias prioritárias para maior avaliação dos seus efeitos (EPA, 2010; Comission of the European Communities, 2007).
O termo microcontaminantes emergentes tem sido usado na literatura em referência aos contaminantes orgânicos que são encontrados em concentrações da ordem de microgramas a nanogramas por litro (Rodil et al., 2009; Yoon et al., 2010). Esses compostos compreendem produtos farmacêuticos e de higiene pessoal, hormônios naturais e sintéticos, subprodutos industriais e drogas ilícitas (Rodil et al., 2012; Sodré et al., 2010). Muitos deles são classificados como interferentes endócrinos, ou seja, substâncias ou misturas exógenas que alteram a função do sistema endócrino de humanos e animais e, consequentemente, causam efeitos adversos em um organismo saudável, ou em seus descendentes ou subpopulações (Bila et al., 2007).
Os microcontaminantes têm chegado ao meio ambiente, principalmente, em função das deficiências dos processos de tratamento de efluentes industrial e de esgotos (Trenholm et al., 2008; Melo et al., 2009). Nos países industrializados, a maioria do esgoto produzido é tratada em estações de tratamento de esgoto (ETE) antes de serem lançados no ambiente. No entanto, alguns hormônios naturais e produtos químicos sintéticos podem ser encontrados em águas superficiais. Muitas destas substâncias são resistentes à biodegradação em ETEs ou são lançadas diretamente em compartimentos aquáticos sem qualquer tratamento (Yoon et al., 2010; Melo et al., 2009; Bila et al., 2007).
subterrâneas, esgoto doméstico, efluentes de ETE, sedimentos marinhos, solo e lodo biológico (Céspedes et al., 2006). Dentre às técnicas mais comuns, destacam-se a utilização de cromatografia acoplada à espectrometria de massas, uma vez que permite a identificação e quantificação simultânea de várias substâncias de interesse ambiental. A análise por cromatografia gasosa (gas chromatography, GC) acoplada à espectrometria de massas (mass spectrometry, MS) foi a mais utilizada inicialmente, no entanto muitos compostos não são passíveis de serem analisados por GC devido a sua instabilidade térmica e polaridade; para produzir compostos voláteis, alguns analitos requerem derivatização (Brossa et al., 2004). Já a técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS) teve progresso tanto na tecnologia quanto na sua aplicação no início da década de 1990. Alterações nos formatos das fontes de ionização trouxeram mais sofisticação e eficiência. As fontes de ionização mais comumente utilizadas para a determinação de microcontaminantes por LC/MS no ambiente aquático são: ionização por eletronebulização
(electrospray ionization, ESI), ionização química por pressão atmosférica (atmospheric
pressure chemical ionization, APCI) e fotoionização em pressão atmosférica (atmospheric
pressure photoionization, APPI). Estas técnicas promovem uma ionização branda e são
extremamente adequadas para a determinação de compostos químicos em diferentes matrizes (Wick et al., 2010; Cai e Syage, 2006).
Com o intenso desenvolvimento das técnicas instrumentais e a disponibilidade de grande volume de dados, tornou-se necessário, e praticamente indispensável, o uso de tratamentos mais complexos do ponto de vista matemático e estatístico, a fim de se obter respostas mais precisas e interpretações mais completas (da Silva et al., 2007). A análise multivariada de dados químicos tem exercido grande interesse e aceitação, pois permite a extração de maiores informações químicas relevantes ao sistema alvo. A quimiometria entra nesse contexto, pois ela faz uso de métodos matemáticos e estatísticos para planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada, e disponibiliza ferramentas para o processamento dos dados químicos estudados, com a finalidade de fornecer o máximo de informação pela análise dos dados obtidos (Ferreira et al.,1999).
2.
OBJETIVO
2.1 GeralEste trabalho teve como objetivo desenvolver metodologia analítica para a determinação simultânea de microcontaminantes emergentes em amostras de águas superficiais por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Estabelecer procedimentos para o monitoramento dos microcontaminantes nas águas da bacia do Rio Doce, avaliando sua contaminação, contribuindo desta forma para o avanço científico relacionado à ocorrência dos microcontaminantes emergentes nos recursos hídricos do Brasil. Os compostos estudados foram: produtos farmacêuticos (ácido acetilsalicílico, acetaminofeno, azitromicina, bezafibrato, cimetidina, ciprofloxacino, claritromicina, diclofenaco, genfibrozila, diltiazem, ibuprofeno, miconazol, naproxeno, ranitidina, sulfametoxazol, trimetoprima e cafeína), hormônios naturais e sintéticos (estrona, 17β -estradiol e 17α-etinilestradiol), plastificantes (dietilftalato, bis(2-etilhexil)ftalato e bisfenol-A) e subprodutos de detergentes (4-nonilfenol e 4-octilfenol).
2.2 Específicos
Estabelecer os pontos de coleta das amostras de águas superficiais ao longo da bacia do Rio Doce;
Estabelecer métodos de preparo da amostra e extração dos microcontaminantes emergentes;
Otimizar as condições operacionais do cromatógrafo líquido acoplado ao espectrômetro de massas utilizando planejamentos experimentais multivariados;
Validar o método desenvolvido para a identificação e quantificação dos microcontaminantes emergentes;
Levantar dados sobre os níveis de contaminação dos microcontaminantes emergentes nas águas da bacia do Rio Doce;
3.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Caracterização geral da bacia do Rio Doce
A bacia do Rio Doce situa-se na região Sudeste, entre os paralelos 17°45' e 21°15' S e os meridianos 39°30' e 43°45' W, integrando a região hidrográfica do Atlântico Sudeste. Esta bacia possui uma população superior a 3,5 milhões de habitantes e apresenta uma área de drenagem de aproximadamente 86.715 km², dos quais 86% pertencem ao Estado de Minas Gerais e o restante ao Espírito Santo, abrange um total de 230 municípios (IGAM, 2007).
As nascentes do Rio Doce situam-se no Estado de Minas Gerais (figura 3.1), nas serras da Mantiqueira e do Espinhaço, sendo que suas águas percorrem cerca de 850 km, até atingir o oceano Atlântico, junto ao povoado de Regência, no Estado do Espírito Santo.
Figura 3.1: Localização da bacia do Rio Doce.
Fonte: (IGAM, 2007).
Os principais afluentes do Rio Doce pela margem esquerda são os rios do Carmo, Piracicaba, Santo Antônio, Corrente Grande e Suaçuí Grande, em Minas Gerais; São José e Pancas no Espírito Santo. Já pela margem direita são os rios Casca, Matipó,
Caratinga/Cuieté e Manhuaçu em Minas Gerais; Guandu, Santa Joana e Santa Maria do Rio Doce no Espírito Santo (IGAM, 2007).
No estado de Minas Gerais a bacia do Rio Doce é dividida em seis Unidades de Planejamento e Gestão dos Recursos Hídricos (UPGRHs), com Comitês de Bacia já estruturados, conforme descrito abaixo:
DO1 – Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Piranga; DO2 – Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Piracicaba; DO3 – Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Santo Antonio; DO4 – Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Suaçuí;
DO5 – Comitê de Bacia Hidrográfica do rio Caratinga; DO6 – Comitê de Bacia Hidrográfica Águas do rio Manhuaçu.
No Estado do Espírito Santo, embora inexistam subdivisões administrativas da bacia do Rio Doce, têm-se os Comitês das Bacias Hidrográficas (CBH) do rio Santa Maria do Doce e do rio Guandu, os Consórcios dos rios Santa Joana e Pancas, bem como a Comissão Pró-Comitê da bacia do rio São José, que se encontra em processo de mobilização para a criação de CBHs. A figura 3.2 ilustra este aspecto (IGAM, 2007).
Figura 3.2: Unidades de análise da bacia do Rio Doce.
Fonte: (IGAM, 2007).
Neste trabalho será abrangido apenas o domínio de Minas Gerais, que é gerido pelo Instituto Mineiro de Gestão das Águas (IGAM), por meio do Projeto Águas de Minas, em execução desde 1997 (IGAM, 2011).
A atividade econômica da bacia do Rio Doce é bastante diversificada, destacando-se: a agropecuária (reflorestamento, lavouras tradicionais, cultura de café, cana-de-açúcar, criação de gado leiteiro e de corte e na suinocultura); a agroindústria (sucroalcooleira); a mineração (ferro, ouro, bauxita, manganês, pedras preciosas e outros); a indústria (celulose, siderurgia e laticínios); o comércio e serviços de apoio aos complexos industriais; e a geração de energia elétrica (IGAM, 2007).
Na região encontra-se instalado o maior complexo siderúrgico da América Latina, com destaque para a Companhia Siderúrgica Belgo Mineiro, a ACESITA e a USIMINAS. Ao lado da siderurgia estão associadas empresas de mineração, com destaque para a Companhia Vale do Rio Doce – CVRD - a maior mineradora a céu aberto do mundo - e empresas reflorestadoras, que cultivam o eucalipto para fornecer matéria-prima para as indústrias de celulose (IGAM, 2007; PROJETO ÁGUAS DO RIO DOCE). Todo esse complexo industrial desempenha papel significativo nas exportações brasileiras de minério de ferro, aços e celulose. Além deles, a bacia contribui na geração de divisas pelas exportações de café (MG e ES) e polpa de frutas (ES) (PROJETO ÁGUAS DO RIO DOCE). Contribuindo para impactos nas águas do Rio Doce (IGAM, 2007).
O desmatamento generalizado e o mau uso dos solos, seja para a monocultura do eucalipto como para agricultura ou pastagem, tem conduzido a região a um intenso processo de erosão, cujos sedimentos resultantes tendem a assorear os cursos d'água. O assoreamento é um dos problemas sérios que atinge a bacia, em especial o baixo curso do Rio Doce, que recebe carga de sedimentos provenientes das áreas a montante. O problema da erosão é ainda agravado nas áreas em que as rochas e o solo possuem grandes concentrações de alumínio. O uso indiscriminado de agrotóxicos nas lavouras também contribui para a contaminação dos cursos d'água. A urbanização da bacia também contribui significativamente para os impactos nos cursos d'água, principalmente pelo quase inexistente sistema de tratamento de esgotos (PROJETO ÁGUAS DO RIO DOCE).
3.2 Microcontaminantes Emergentes
grande quantidade pela sociedade, para variados fins, incluindo a produção e conservação de alimentos, processos industriais, bem como para cuidados da higiene, saúde humana e animal (Lapworth et al., 2012). O interesse crescente por essas substâncias ocorre, principalmente, porque elas podem apresentar atividade biológica em concentrações muito baixas, o que confere a elas grande relevância ambiental (Zwiener et al., 2004).
Alguns microcontaminantes são classificados como interferentes endócrinos, ou seja, substâncias ou misturas exógenas que alteram a função do sistema endócrino de humanos e animais e, consequentemente, causam efeitos adversos em um organismo saudável, ou em seus descendentes ou subpopulações (Bila et al., 2006). Essa classe tem despertado grande interesse, pois já foram constatados efeitos cancerígenos, alterações crônicas no desenvolvimento e na reprodução de várias espécies, perturbação nos sistemas cardiovascular e o neuroendócrino (Waye et al., 2011), além dessa classe esta sendo associada com a incidência da obesidade (Newbold et al., 2008).
Os contaminantes emergentes podem ser candidatos a futuras regulamentações, estando apenas dependentes dos resultados das pesquisas relacionadas com os potenciais efeitos destes nos ecossistemas e com os dados de monitoramento da respectiva ocorrência no meio ambiente (Silva, 2010). Em muitos países, ações governamentais e não-governamentais buscam definir parâmetros universais de debate sobre o tema, incluindo-se a minimização de substâncias químicas e o estabelecimento de normas e condutas (2° WORKSHOP SOBRE CONTAMINANTES EMERGENTES EM ÁGUA PARA CONSUMO HUMANO, 2010).
Os Estados Unidos por meio da Agência de Proteção Ambiental (Environmental
Protection Agency, EPA) divulgou sua segunda lista de produtos químicos e substâncias
para quais a EPA pretende emitir ordens de ensaio sob o Programa de Triagem de Perturbadores Endócrinos (Endocrine Disruption Screening Program, EDSP). A EPA estabeleceu o EDSP em resposta a seção 408 da Lei Federal de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic, FFCDA) que aborda a Tolerância e isenções para os resíduos químicos de pesticidas (EPA, 2010).
A União Européia estabeleceu uma lista de 553 substâncias classificadas como substâncias candidatas e que seriam avaliadas como possíveis interferentes endócrinos
de alcanos, ftalatos, dioxinas/ furanos e bifenilpoliclorados. Destas substâncias 194 possuem clara evidência de efeitos no sistema endócrino (Comission of the European Communities, 2007).
Vários consórcios foram criados em todo o mundo com o objetivo de avaliar a complexa situação dos microntaminantes, o que revela a crescente preocupação mundial com essas substâncias. Diversos assuntos são abordados e investigados, tais como o monitoramento de substâncias estrogênicas em amostras de águas naturais (Austrian
Research Cooperation on Endocrine Modulators, ARCEM); a validação dos métodos de
ensaios que determinam as substâncias com potencial de desregulação endócrina
(Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee, EDSTAC; Endocrine
Disrupter Testing and Assessment Task Force, EDTA); a identificação e caracterização de
todos os efeitos relatados (Environmental Disruptor Screening Program, EDSP;
Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and Environmental
Hormones, COMPREHEND e o Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment,
CSTEE) entre outros (Bila et al., 2006).
compostos e identificar grupos de pesquisa na área, bem como discutir subsídios à políticas públicas quanto à exposição humana. O workshop foi coordenado por Wilson Jardim e Maria Olimpia de Oliveira Rezende e contou com a participação dos pesquisadores: Tânia Mara Pizzolato (UFRGS), Fernando Fabriz Sodré (UnB), Mary Rosa Rodrigues de Marqui (UNESP), Robson José de Cássia Franco Afonso (UFOP) (34° RASBQ, 2011).
3.2.1 Fontes de contaminação
A principal fonte de contaminação de microcontaminantes no meio ambiente é o lançamento de esgotos domésticos, tratados ou não, em cursos de água (Bila et al., 2007). As ETEs (Estações de Tratamento de Esgoto) recebem um grande espectro de contaminantes das águas residuais domésticas e/ou industrial, que não são completamente eliminados durante o processo de tratamento. Assim, nas saídas das ETEs uma mistura complexa de contaminantes, incluindo os contaminantes e os seus metabólitos são descarregados para os rios. Em muitos locais, as águas do efluente tratado são diluídas com água a partir de outras fontes. As concentrações dos microcotaminantes presentes em águas podem aumentar ou diminuir dependendo das concentrações e do fluxo de contaminantes despejadas nas águas superficiais (Yoon et al., 2010).
Os fármacos, drogas de abuso, hormônios são continuamente liberados no meio ambiente principalmente através de excreções urinárias ou fecais e pela disposição inadequada de fármacos não utilizados ou com expiração do prazo de validade (Gros et al., 2006; Van Nuijs et al., 2011; Bila et al., 2007). Os produtos de higiene e limpeza pessoal são eliminados continuamente no meio ambiente através das descargas de esgotos domésticos e industriais (Silva, 2010). Outro exemplo de rota de contaminação de microcontaminantes pode ser o composto proveniente do lodo digerido e do estrume, usados como fertilizante na agricultura, que são capazes de promover a contaminação das águas subterrâneas e superficiais. Os excrementos da criação de animais (gado, porcos, galinha, etc.) são considerados fontes potenciais de contaminação por fármacos e estrógenos no ambiente (Veras, 2006).
Microcontaminantes
Efluentes das ETEs
Efluentes industriais
Lodos
Figura 3.3: Principais fontes de contaminação de Microcontaminantes no meio ambiente.
Fonte: Adaptada (Silva, 2010).
3.2.2 Classes de Microcontaminantes
FÁRMACOS
Fármacos são substâncias biologicamente ativas e persistentes reconhecidas como uma ameaça permanente para a estabilidade ambiental. Dados de ecotoxicidade crônica, bem como informações sobre os níveis atuais de distribuição nos diferentes compartimentos ambientais continuam a ser escassos e concentram a atenção nas classes terapêuticas mais frequentemente prescritas e consumidas. (Santos et al, 2007).
Os produtos farmacêuticos pertencem à classe de microcontaminantes orgânicos emergentes que mais têm chamado à atenção dos pesquisadores, devido aos números crescentes de utilização de medicamentos (Silva e Collins, 2011). Cerca de 3000 diferentes compostos são utilizados como componentes de medicamentos na medicina humana e veterinária. Eles abragem uma grande variedade de estruturas químicas (Ternes, 2001). Essa extensa utilização tem sido considerada alarmante em países desenvolvidos, como é o caso da Alemanha, onde o consumo de medicamentos superou, desde 2001, a quantidade de 100 toneladas por ano. A quantidade real de medicamentos consumidos é ainda maior, pois nesses dados não estão inclusos medicamentos consumidos sem receituário médico ou adquiridos ilegalmente. No caso do Brasil, os números de consumo de medicamentos podem ainda ser maiores, porém ainda não há dados disponíveis (Silva e Collins, 2011).
Esses compostos presentes no ambiente podem interagir com a biota do meio interferindo significativamente na fisiologia, no metabolismo e no comportamento das espécies, podendo ocasionar severos danos ao organismo humano e aos demais seres vivos. Alguns podem ocasionar efeitos secundários como, por exemplo, alteração na defesa imunológica de organismos tornando-os mais suscetíveis a doenças (Belizário et al., 2009). Além de oferecer riscos para os animais aquáticos, no caso de antibióticos, podem ocasionar a resistência bacteriana (González et al., 2012).
Antibióticos
2009). Os antibióticos também possuem o potencial de afetar a comunidade microbiana em sistemas de esgotos. A inibição de bactérias presentes em águas residuais pode afetar seriamente a degradação da matéria orgânica (Van Nuijs et al., 2011).
Anti-inflamatórios e Analgésicos
Os anti-inflamatórios e analgésicos são um dos grupos de medicamentos mais comercializados em todo o mundo. Nos Estados Unidos, estima-se que cerca de 17 milhões de pessoas usam essas substâncias diariamente, pois várias delas podem ser obtidas sem prescrições. Calcula-se, por outro lado, que aproximadamente 60 milhões de prescrições sejam feitas anualmente. A maioria dos usuários são adultos e idosos (Chahade et al., 2008).
Reguladores Lipídicos
Fármacos moduladores do metabolismo de lipídeos são frequentemente prescritos no mundo e têm como objetivo diminuir a concentração de triglicérides e colesterol no sangue sendo conhecidos assim como reguladores lipídicos. Essa classe de fármacos pode ser dividida em dois grupos: o das estatinas e o dos fibratos. Os fibratos constituem uma importante classe largamente utilizada para o tratamento de hiperlipidemias (elevação dos níveis plasmáticos de colesterol e triglicérides). Dentro do grupo dos fibratos, podemos destacar o bezafibrato e a genfibrozila. Recentemente, bezafibrato foi incluído na lista dos medicamentos mais utilizados no mundo (Queiroz, 2011). Quinn e colaboradores (2008) evidenciaram em seu trabalho que a genfibrozila e o bezafibrato afetam significativamente
a alimentação e o crescimento da espécie Hidra attenuata, pertencente ao filo dos animais aquáticos chamado cnidário. A genfibrozila foi classificada como tóxica e o bezafibrato como prejudicial para organismos não-alvo (Quinn et al., 2008).
Antifúngicos
Substâncias azólicas são muito utilizadas como princípio ativo em medicamentos antifúngicos para homens e animais. Pesquisas têm revelado o potencial impacto de alguns antifúngicos no sistema endócrino de organismos aquáticos. Alguns antifúngicos azólicos como o miconazol têm sido frequentemente detectados em água residuárias e superficiais (Queiroz, 2011).
A cafeína é uma das drogas mais consumidas em todo o mundo (Braga, et al., 2000). Ela é um estimulante encontrado em analgésicos como a Neosaldina® (Gishelli, 2006). Também está presente em diversas espécies de plantas, é encontrada em chás, café, cacau, guaraná, chocolate e nos refrigerantes (Braga, et al., 2000). Ela é considerada um excelente traçador de atividades antropogênicas na qualidade das águas. Se for encontrada, é muito provável encontrar outros compostos da classe chamada contaminantes emergentes (Reynol, 2010).
Tabela 3.1: Estrutura e propriedades físico-químicas das classes dos fármacos estudados.
Classe Nome molecular Fórmula MM LogKow pka
Solubilidade em água
(mg/L) Estrutura Química
Antibiótico
Azitromicina C38H72N2O12 748,9845 4,02 8,74 7,09
Ciprofloxacina C17H18FN3O3 331,3415 0,28 6,09 3,00 × 104
Claritromicina C38H69NO13 747,9534 3,16 8,99 2,17 × 10²
Trimetoprima C14H18N4O3 290,3177 0,91 7,12 4,00 × 102
Anti-inflamatório
e analgésico
Acetaminofeno
(paracetamol) C8H9NO2 206,2808 0,34 4,54 3,0 × 10
4
Ácido
acetilsalicílico C9H8O4 180,1574 1,19 3,50 4,6 × 104
Diclofenaco C14H11Cl2NO2 296,149 4,51 4,20 2,37
Ibuprofeno C13H18O2 206,2808 3,72 4,54 4,10 × 10
Reguladores Lipídicos
Bezafibrato C19H20ClNO4 361,82 4,30 3,30 1,20
Genfibrozila C15H22O3 250,33 4,39 4,80 4,90
Anti-fúngico Miconazol C18H14Cl4N2O 416,129 6,10 6,70 0,76
Cimetidina (Anti-ácido
gástrico) C10H16N6S 252,339 0,40 6,80 5,00 × 10³
Ranitidina (Tramento de
úceras)
C13H22N403S 314,39 NE NE 24,70 × 103
Diltiazem (Anti-hipertensivo)
C22H26N2O45 414,518 2,70 8,06 4,65 × 102
Nota:MM: Massa Molecular, Kow: Coeficiente de Partição octanol/água, NE: Não Encontrado.
PLASTIFICANTES
O bisfenol-A é um monômero polar de policarbonato, é usado pra revetimento de produtos de alimentos enlatados, cubas de armazenamento de vinho, recipientes de água. Plásticos de policarbonato são usados para fabricar garrafões de água, reutilizáveis (Céspedes
et al., 2006; Diana et al., 2011). Outras aplicações incluem a sua utilização como um
anti-oxidante na produção de pneus, intermediário na síntese de resinas epóxi, retardadores de chama, como aditivo em papéis térmicos ou revestimentos de papel (Voutsa et al., 2006). Ele tem sido apontado como um produto químico com poder de perturbar o sitema endócrino, devido à sua capacidade de imitar a ação de hormônios estrogênicos endógenos (Kunz, et al., 2011). Ocorre no ambiente principalmente, nos efluentes de plantas industriais de produção de produtos plásticos e de aterros sanitários (Céspedes et al., 2006).
Ftalatos têm sido utilizado há mais de 50 anos principalmente na fabricação de PVC, e em um menor grau em resinas, bem como na fabricação de plastificantes para materiais de construção e de decoração, embalagens de alimentos e repelentes de insetos (Liang et al., 2008; Céspedes et al., 2006; Diana et al., 2011). Também podem ser encontrados em produtos tais como: tintas, adesivos e cosméticos (Diana et al., 2011). Eles são facilmente liberados e podem migrar para os alimentos, bebidas e água potável a partir dos materiais de embalagem ou de engarrafamento ou processos de fabricação (Diana et al., 2011). Ftalatos possuem baixa solubilidade em água (3 μg/L) e, quando liberados no ambiente aquático, eles tendem a adsorver fortemente as partículas em suspensão e sedimentos (Céspedes et al., 2006). Como conseqüência, o bis(2-etilhexil)ftalato e o dietilftalato constituem os ftalatos mais onipresente encontrados em águas residuais (Céspedes et al., 2006). Os ftalatos bis(2-etilhexil)ftalato e o dietilftalato mostraram efeitos estrogênico em ensaios in vitro (Diana et al., 2011).
SUBPRODUTOS DE DETERGENTES
limpeza, desinfectantes e formulações de pesticidas. (Diana et al., 2011). Sua ocorrência comum em águas superficiais é certamente devido à sua ampla utilização doméstica e industrial. Eles são encontrados na água e no material particulado em suspensão presente na água doce, marinha e em sedimento de águas residuais (Céspedes et al., 2006).
O nonilfenol e octilfenol causam alterações no sistema endócrino e por isso estão incluídos na lista das 32 substâncias prioritárias da European Water Framework Directive, cujo principal objetivo é prevenir e evitar a contaminação da água na União Europeia. Também estão incluídos na lista poluentes prioritários US EPA. (Céspedes et al., 2006). Desde Janeiro de 2005, houve uma restrição na Europa sobre a venda e utilização de produtos que contenham mais de 0,1 % de 4-nonilfenol etoxilatos ou 4-nonilfenol ( Diana et al., 2011).
HORMÔNIOS NATURAIS E SINTÉTICOS
A estrona e o 17β-estradiol são hormônios esteróides naturais responsáveis pelas características secundárias femininas, agem no controle da ovulação, no desenvolvimento e preparo cíclico do sistema reprodutor feminino para a fertilização e implantação do óvulo, e podem também influenciar no crescimento, desenvolvimento e comportamento das fêmeas (Queiroz, 2011). São produzidos em níveis elevados durante a gravidez, sendo excretados pelas mulheres grávidas por volta de 7 µg/ dia de estrona e 2,4 µg/ dia de 17β-estradiol (Velicu et al., 2009).
O 17α-etinilestradiol é um estrógeno sintético, derivado do 17β-estradiol, sendo um
bioativo oral usado em muitas formulações modernas de pílulas de contraceptivos orais e na terapia de reposição hormonal (Moreira et al., 2011; Grover et al., 2011). A existência do grupo metil a mais em sua estrutura, em relação ao 17β-estradiol, confere um maior potencial estrogênico e também o torna mais resistente ao metabolismo fazendo com que grande parte do que é excretado chegue inalterado à rede de esgoto. Como os tratamentos de esgoto convencionais são ineficientes frente à degradação/remoção desse composto, grande parte é lançada aos corpos d’água, chegando intactos ao meio ambiente (Andrew et al., 2010).
Tabela 3.2: Estrutura e propriedades físico-químicas dos plastificantes, hormônios e subproduto de detergentes estudados.
Classe Nome molecular Fórmula MM Log K
ow pKa
Solubilidade Em água
(mg/L) Estrutura Química
Plastificantes
Bisfenol-A C15H16O2 228,2863 3,32 10,2 1,73 × 102
Bis(2-etilhexil)ftalato C24H38O4 390,5561 7,45 NE 0,29
Dietilftalato C12H14O4 222,0893 3,15 NE 6,87 × 10
Subprodutos de detergentes
4-nonilfenol C15H24O 220,3505 4,48 10,7 1,57
Hormônio Naturais
Estrona C18H22O2 270,3661 3,13 10,5 1,47 × 102
17β-Estradiol C18H24O2 272,382 3,94 10,4 8,19 × 10
Hormônio Sintético 17α-etinilestradiol C20H24O2 296,403 3,67 10,4 1,16 × 102
Nota:MM: Massa Molecular, Kow: Coeficiente de Partição octanol/água, NE: Não Encontrado.
3.3 Métodos analíticos utilizados para determinar microcontaminantes em matrizes ambientais
Um crescente número de metodologias analíticas tem sido reportado na literatura para a determinação de microcontaminantes orgânicos, tanto de águas superfíciais quanto de águas residuais. As análises instrumentais são normalmente realizadas por cromatografia em fase gasosa (gas chromatography, GC) ou cromatografia em fase líquida (liquid chromatography,
LC), podendo serseguidas por acoplamento a espectrometria de massa (mass spectrometry, MS). GC/MS só pode ser aplicada com sucesso por um número limitado de compostos, sendo mais apropriada para compostos não-polares e de baixa temperatura de ebulição, é possível analisar polares, porém esses necessitam de uma derivatização, que em alguns casos são trabalhosas e muitas vezes irreprodutíveis. Por outro lado, a rápida evolução no campo da LC/MS a transformaram em uma técnica essencial para a determinação de contaminantes emergentes ambientais. LC/MS ganhou popularidade devido a sua versatilidade, especificidade e seletividade, sendo aplicada como um método de escolha para a análise de microcontaminantes em amostras ambientais complexas e águas residuais (Gros et al., 2006).
As principais fontes de ionização empregadas em LC/MS são: ionização por eletronebulização (electrospray ionization, ESI), ionização química à pressão atmosférica
(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) e fotoionização à pressão atmosférica
(atmospheric pressure photoionization, APPI) (Wick et al., 2010; Cai and Syage, 2006). Cada
tipo de interface possui um mecanismo específico de ionização, logo são influenciadas de maneira distinta em relação à produção dos íons, sendo assim cada técnica possui sua especialidade e limitações (Antignac et al., 2005; Matuszewski, 2006; Remane et al., 2010). A seguir é descrito os mecanismos de ionização das fontes usadas nesse trabalho (APCI e ESI).
Princípio de ionização do ESI:
da fase líquida para a fase vapor possam estar acontecendo, dependendo do analito e das condições operacionais da fonte de ionização. Os processos de competição por carga entre o analito e outros componentes da matriz podem levar a variações significativas nas quantidades formadas de íons do analito, quando comparado com padrões em solvente puro.
Figura 3.4: Esquema dos componentes de uma fonte ESI.
Fonte: Adaptado (Kostiainen e Kauppila., 2009).
Para este tipo de fonte de ionização os solventes ideais são aqueles que apresentam menores valores de tensão superficial, ponto de vaporização, energia de solvatação, e valores de condutividade satisfatórios, sendo que apenas solventes polares e de média polaridade são empregados (Kostiainen e Kauppila, 2009).
Princípio de Ionização da APCI
ocorrerem às reações de transferência de cargas (Kostiainen and Kauppila, 2009). A figura 3.5 apresenta um esquema do funcionamento da APCI.
Figura 3.5: Esquema dos componentes de uma fonte APCI
Fonte: Adaptado (http:// www. bris.ac.uk/ nerclsmsf/ techniques/ hplcms.html).
A fase móvel ideal na APCI é aquela constituída de solventes que apresente energia dos íons (por exemplo, afinidade prótica no modo positivo, afinidade eletrônica no modo negativo e menor energia de ionização em ambos os casos) favorável às reações químicas de ionização dos analitos, sendo que tanto solventes polares como não-polares podem ser usados (Kostiainen e Kauppila, 2009; Gao et al., 2005).
3.3.1 Efeito Matriz
Vários autores têm reportado a ocorrência da supressão ou aumento do sinal causado pela influência dos componentes da matriz ou outros interferentes presentes nas amostras (Cappiello et al., 2008; Niessen et al., 2006; Kruve et al., 2008; Gosetti et al., 2010; Ismaiel
et al., 2007; Dussault et al., 2009; Mei et al., 2003; Gru et al., 2010; Kruve et al., 2011). Esse
fenômeno, também conhecido como efeito matriz, é uma das desvantagens mais relevantes das técnicas de LC-MS. O efeito da matriz é definido pela IUPAC como o “efeito combinado
de todos os componentes da amostra, diferentes do analito, sobre a medição da quantidade. Se um componente específico pode ser identificado como causador de um efeito, então este é
referido como um interferente” (IUPAC, 2006).
da matriz na etapa de formação dos íons, na interface do espectrômetro de massas. Dependendo do ambiente em que o processo de ionização e de evaporação dos íons aconteça, esta competição pode efetivamente diminuir ou aumentar a formação dos íons dos compostos de interesse (Matuszewski et al., 2003).
Vários tipos de espécies podem ser capazes de afetar a eficiência de ionização dos analitos. Elas podem ser espécies endógenas, componentes presentes na amostra que permanecem mesmo após o pré-tratamento ou extração. Dentre elas estão incluídas: as espécies iônicas (eletrólitos inorgânicos, sais), compostos polares (fenóis, sulfonatos de arila) e outras moléculas orgânicas (carboidratos, aminas, uréia, lipídios, peptídeos, ácidos orgânicos), em geral, outros compostos ou metabólicos caracterizados por uma estrutura química semelhante à do analito alvo (Gosetti et al., 2010; Mallet et al., 2004; Pris et al., 2008). Ou espécies exógenas, materiais advindos de fontes externas, tais como: polímeros contidos em diferentes materiais usados no preparo de amostras, plastificantes tais como ftalatos, os detergentes e seus produtos de degradação (alquilfenóis), a heparina comumente utilizada como agente anticoagulante na análise de sangue, impurezas dos solventes, materiais advindos do cartucho da extração em fase sólida (solid phase extraction, SPE) ou da fase estacionária da coluna do LC (Van Eeckhaut et al., 2009; Mei et al., 2003; Kruve et al., 2011; Antignac et al., 2005). Agentes modificadores da fase móvel, usualmente empregados para a melhoria da resolução no LC, também afetam a intensidade dos íons, já que os mesmos influenciam fortemente na etapa de ionização (Mallet et al., 2004; Van De Steene et al., 2006).
3.3.2 Preparo da amostra
O processo de preparo da amostra é primordial para determinação de microcontaminantes, pois nessa etapa procura-se isolar e concentrar os analitos a níveis apropriados de tal forma a conseguir um extrato da amostra original enriquecido com as substâncias de interesse analítico e relativamente livre de interferentes. Além disto, devem apresentar recuperações razoáveis, boa exatidão e precisão.
As técnicas mais utilizadas atualmente para extração de compostos em matrizes aquosas ambientais são: extração líquido-líquido (liquid-liquid extraction, LLE), microextração em fase sólida (solid phase microextraction , SPME) e extração em fase sólida
(solid phase extraction, SPE).
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO (LLE)
A LLE é considerada uma técnica clássica de preparação de amostra, que ocorre através do mecanismo de partição dos componentes da amostra entre duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa) permitindo a transferência e o enriquecimento do analito para uma das fases (Queiroz et al., 2001). A eficiência da extração depende da afinidade do soluto pelo solvente de extração e da razão das fases e do número de extrações (Queiroz et al., 2001). A configuração mais comum desse procedimento utiliza um funil de separação ou tubos de centrífuga (Queiroz et al., 2001). A LLE emprega uma ampla diversidade de solventes, o que confere uma grande faixa de solubilidade e seletividade (Queiroz et al., 2001). No entanto, existem algumas desvantagens, tais como formação de emulsão, tempo de análise, o uso de grandes volumes de amostra e solventes orgânicos tóxicos, gerando grandes quantidades de efluentes que são prejudiciais ao meio ambiente (Zhou et al., 2011).
MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
A SPME desenvolvida por Arthur e Pawliszyn baseia-se no princípio do particionamento dos analitos entre a amostra e a fase estacionária revestida por uma fibra (Chang et al., 2009; Chen, 1995). A dinâmica da SPME é controlada pelo transporte de massa através da difusão dos analitos da fase aquosa para a fase estacionária da fibra revestida, que pode ser melhorado por meio de agitação da amostra aquosa (Chang et al., 2009). O
dispositivo básico de SPME consiste de um tubo capilar de sílica fundida de 100 μm de
adsorvente (Oliveira, 2008). A sensibilidade do método pode ser assegurado, desde que as fases estacionárias poliméricas utilizadas possuam uma elevada afinidade com as moléculas orgânicas de interesse (Chang et al., 2009).
A SPME tem vantagens de ser um método portátil, simples de usar, relativamente rápido, e pode ser automatizado e acoplado a instrumentação analítica em linha (Zhou et al., 2011). No entanto a técnica tem encontrado empecilho devido ao pequeno número de fibras disponível comercialmente, o que limita a seletividade da técnica, além delas serem geralmente caras, e para algumas aplicações, têm vida útil limitada (Chang et al, 2009; Zhou, 2011).
A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE)
A SPE utiliza uma fase sólida pura ou modificada como um adsorvente seletivo para isolar o analito em sua superfície enquanto entra em contato com as amostras. A fase sólida adsorvente, contendo analito, é lavada para remover os constituintes indesejáveis retidos juntamente com o analito, que é eventualmente dessorvido da fase sólida através da eluição com o solvente orgânico específico. A fase sólida adsorvente é normalmente acondicionada em cartuchos tais como uma coluna de cromatografia líquida pequena (Chang et al., 2009), nas formas de barril ou seringa. Um dos parâmetros mais importantes na aplicação de um método SPE é a escolha de um adsorvente sólido seletivo para o analito de interesse, bem como o uso de solventes para lavagem e eluição (Chang et al., 2009). Os grupos frequentemente usados como adsorventes à base de sílica quimicamente modificada são: fase reversa, quando o sorvente é menos polar que o solvente de eluição; fase normal, quando o solvente é menos polar que o sorvente e troca iônica (Queiroz et al., 2001).
O método SPE é mais rápido e mais eficiente do que LLE (Chang et al., 2009). Além disso, a SPE requer menos solvente, produzindo pequenas quantidades de resíduos tóxicos. A alta concentração do analito no extrato final, a maior seletividade as alternativas de escolha de fase sólida e a facilidade de automação, têm permitido o uso da SPE de praticamente todos os compostos de matrizes aquosas ou orgânicas, com pequeno manuseio da amostra, ausência de emulsão, o baixo consumo de vidrarias (Freitas et al., 2009).
