5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.5 DESENHO EXPERIMENTAL
As etapas desta pesquisa podem ser acompanhada através do desenho experimental (Figura 13).
Figura 13: Ilustração das etapas do projeto.
Contaminado 0,60μg/L CHLO 0,60 Exposição 0,60μg/L CHLO
Histologia de Gônadas e Fígado Controle Acetona 2,39 µl/L Controle Água de cultivo Controle Acetona 2,39 µl/L Teste de sensibilidade Controle Água de cultivo Contaminado 0,60μg/L CHLO 0,60 Tempo de exposição 14 dias Tempo de exposição 21 dias
6. RESULTADOS
6.1 TESTE DE SENSIBILIDADE:
A CL (I)50 96h estimada para ambos os teste de toxicidade com a substância de
referência NaCl foi de 9,235 g. L-1, com limite superior (LS) de 11,87 g. L-1 e inferior (LI) de 6,595 g. L-1 (Figura 14). Os limites foram obtidos com a adição e subtração de duas vezes o desvio padrão (DP) as médias encontradas entre as CL(I)50 96h obtidas nos
dois testes.
Valores próximos foram determinados por Santos (2009) onde o autor por meio de dez testes de sensibilidade obteve em sua carta-controle a CL(I)50 96h de 9,79 g. L-1,
com LS de 11,53 g. L-1 e LI de 8,06 g.L-1.
Figura 14: Carta-controle de sensibilidade do Danio rerio ao NaCl.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 1 2 3 Con ce n traçã o (g L -1 ) Testes
Carta-controle
CL50 Linear (Média) Linear (Média + 2DP) Linear (Média - 2DP)6.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
As análises histológicas também podem ser vistas apresentadas em 4 pranchas comparativas ao final da descrição individual de cada órgão de estudo, sendo: Prancha 1- Gônadas das fêmeas para os testes de 14 e 21 dias (Figura 19); Prancha - 2 - Gônadas dos Machos para os testes 14 e 21 dias (Figura 23); Prancha 3 - Fígado de machos para os testes de 14 e 21 dias (Figura 27) e Prancha 4 - Fígado das fêmeas para os testes 14 e 21 dias (Figura 31).
As análises histológicas das gônadas das fêmeas do controle (CC) 14 dias e 21 dias e controle acetona (CA) 14 e 21 dias, revelaram padrão normal de distribuição e maturação gonadal, mostrando células em diferentes fases de desenvolvimento e ovários em diferentes estádios de maturação gonadal (SCHULTZ et al., 2002; OECD 2010), conforme características da própria espécie, uma vez que D. rerio apresenta, em condições favoráveis, o desenvolvimento assincrônico dos ovócitos, ou seja, apresenta desova contínua conforme a maturação das células germinativas (SILVA, 2016).
Nas Figuras 15 (A e B) e 16 (C e D), é possivel observar as fases de desenvolvimento ovocitário, I (ovogônias); II (ovócitos de estoque reserva), percebe-se grande núcleo em relação ao tamanho do ovócito; III (ovócitos com vacúolos lipídicos) nesta fase podemos ver o núcleo e o nucléolo mais evidentes, e seus vacúolos lipídicos mais acentuados; IV (ovócitos com vitelogênese lipidica e protéica), destaca-se também o envelope vitelogênico bem evidente; V (vitelogênese completa), grânulos de vitelo evidentes e em grande quantidade, ovócitos maduros (SCHULTZ et al. 2002; OECD, 2010).
Figura 15: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio indivíduos adultos controles (CC) do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B).
Fonte: acervo pessoal
Legenda: A e B ovário apresentando ovócitos em diferentes fases de desenvolvimento ovocitário. II - ovócitos estoques de reserva (Fase II); III - ovócito com vitelogênese lipídica (Fase III); IV - ovócito com vitelogênese lipídica e proteica (Fase IV); V- ovócito com vitelogênese completa (Fase V); N - núcleo, n- nucléolo, EV - envelope vitelínico, GV- grânulo de vitelo, VCL- vacúolo lipídico. Coloração (HE).
Figura 16: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio dos controles acetona (CA) do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D).
Fonte:Acervo pessoal
Legenda: C e D ovários apresentando ovócitos em diferentes fases de desenvolvimento ovocitário, evidenciando fases intermediárias e maduras de desenvolvimento. II - ovócitos estoques de reserva (Fase II), III - ovócito com vitelogênese lipídica (Fase III), IV - ovócito com vitelogênese lipídica e proteica (Fase IV), V- ovócito com vitelogênese proteica (Fase V). Coloração (HE).
Para as fêmeas expostas ao (CHLO) a 0,60μg/L por 14 dias, foi possível observar um predomínio de ovócitos com vitelogênese lipídica e protéica (IV) e ovócitos com vitelogênese completa (V), poucas ovogônias e ovócitos de reserva (II), além de alterações como um aumento da vacuolização interna de ovócitos de estádio (IV), com uma basofilia predominante (Figura17 E) . Já em 21 dias, foram observados poucos ovócitos na fase II, nenhuma na fase I e uma quantidade maior de ovócitos nas fases IV e V (Figura 17 F). Na Figura 18 (G), podemos observar com mais detalhes os ovócitos na fase IV com grandes areas de basofilia atípica. Foi observado também a presença de muitos grânulos de vitelo acidófilos fundidos, compondo uma massa única, homogênea e coalescente ocupando boa parte do citoplasma de alguns ovócitos na fase V (Figura 18 H e I).
Figura 17: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO nos testes de 14 dias (E) e nos testes de 21 dias (F).
Fonte:Acervo pessoal
Legendas: E e F ovário apresentando ovócitos em diferentes fases de desenvolvimento ovocitário evidenciando o predomínio de fases avançadas de maturação. II - ovócitos estoques de reserva (Fase II), III - ovócito com vitelogênese lipídica (Fase III), IV - ovócito com vitelogênese lipídica e proteica (Fase IV), V- ovócito com vitelogênese proteica (Fase V). E- apresentando ovocitos IV com um aumento de vacuolos basófilos, nota-se coloração basofilica atípica com aumento da vacuolização. F- (seta preta) nota- se ovócito V com grânulos vitelogênicos fundidos, alterados. Coloração (HE).
Figura 18: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO no teste de 14 dias (G) e no teste de 21 dias (H).
Fonte:Acervo pessoal
Legendas: G- Apresentando ovocitos fase IV com um aumento de vacuolos basófilos atípicos e aumento da vacuolização; H- nota-se ovócito de fase V com grânulos vitelogênicos fundidos, alterados, compondo massa única; I- Ovócito V com grânulos vitelogênicos fundidos. Coloração (HE).
Em relação aos machos, a análise histológica do Controle (CC) e Controle Acetona (CA) mostraram um padrão de desenvolvimento gonadal normal, sem alterações, apresentando todas as fases de desenvolvimento das células germinativas, fase inicial de diferenciação onde ocorrem sucessivas divisões mitóticas chamadas de espermatogônia, fase secundária com divisões meióticas responsáveis pela formação dos espermatócitos e espermátides e a fase de diferenciação das espermátides em espermatozóides, além da presença das células de Leydig responsáveis pela produção de hormônios esteróides em peixes (NÓBREGA et al. 2009) e as células de Sertoli que facilitam o desenvolvimento das células germinativas (SCHULZ et al. 2015), sendo assim juntas elas compõe as células somáticas do testículo (Figura 20 A e B; Figura 21 C e D).
Figura 20: Corte histológico de gônadas de macho de D. rerio dos Controles (CC) do teste de 14 dias (A) do teste de 21 dias (B).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: A e B Espermatogênese apresentando diversas fases de desenvolvimento, (EG) - Espermatogônia, (ET) - Espermatócitos, (EM) - Espermátide, (EZ) – Espermatozoides; DE – Ducto Espermático; CL – Células de Leydig. Coloração (HE).
Figura 21: Corte histológico de gônadas de machos de D. rerio do Controle Acetona (CA) do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D).
Fonte:Acervo pessoal
Legenda: C e D Espermatogênese apresentando diversas fases de desenvolvimento, (EG) - Espermatogônia, (ET) - Espermatócitos, (EM) - Espermátide, (EZ) – Espermatozoides; CS – Células de Sertoli e CL – Células de Leydig. Coloração (HE).
No teste de 14 dias, não foram encontrados indivíduos machos, entre os organismos estudados, provavelmente a aleatoriedade das escolhas dos organismos para submeter ao teste histológico, levou a organismos muito parecidos na qual não puderam ser avalidos. Mas para organismos machos expostos por 21 dias com 0,60μg/L de CHLO, além das fases normais de desenvolvimento já descritas anteriormente, pôde-se notar uma hipertrofia das células gaméticas, especialmente em espermatócitos, ou seja, um aumento no tamanho da células, podendo ser vista em um tamanho muito maior do que o esperado nesta fase. Principalmente ao redor do lúmen (onde se concentram maior quantidade de espermatozóides) ou ao redor de cistos de espermatócitos. Outra alteração vista, foi a degeneração de algumas células gaméticas, também em sua maioria nos espermatócitos, percebe-se esta por perder sua estrutura interna, tornando regiões lisa e em maiores proporções, percebe-se coloração acidófila (Figura 22 E e F).
Figura 22: Corte histológico de gônadas de machos de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de 21 dias (E e F).
Fonte: Acervo Pessoal
Legenda: E e F Espermatogênese apresentando diversas fases de desenvolvimento, (EG) - Espermatogônia, (ET) - Espermatócitos, (EM) - Espermátide, (EZ) – Espermatozoides. DE – Ducto Espermático; CS – Células de Sertoli e CL – Células de Leydig, HT – Hipertrofia; DG - Célula em Degeneração. Coloração (HE).
Nas análises histológicas dos tecidos do fígado dos organismos machos (CC) e (CA) 14 e 21 dias apresentaram um complexo arranjo de cordões hepáticos, hepatócitos e núcleos íntegros evidentes em quase sua totalidade com vasos e células sanguíneas que irrigam o sistema. Porém, algumas células hepáticas encontraram-se em tamanho maior que o esperado (hipertróficas) e algumas poucas regiões com degenerações, ou seja, regiões que perderam sua estrutura intracelular. (Figura 24 A e B; Figura 25 C e D).
Figura 24: Corte histológico de fígado de machos de D. rerio dos Controles (CC) do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: VS – Vasos Sanguíneos; CH – Cordões Hepáticos; HP – Hepatócito e N – Núcleo. Coloração (HE).
Figura 25: Corte histológico de fígado de machos de D. rerio do Controle Acetona (CA) do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: CH – Cordões Hepáticos; HP – Hepatócito; DG – Degeneração; HT - Hipertrofia. Coloração (HE).
Já para os organismos expostos ao CHLO por 14 dias não foi possível encontrar organismos machos entre os organismos estudados. Mas para 21 dias de exposição, em grande parte do tecido hepático, houve a presença de degeneração celular e vacuolização dos hepatócitos, estando ausente a estrutura normal do tecido sadio comparado ao controle (Figura 26 E e F).
Figura 26: Corte histológico de fígado de machos de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO no teste de 21 dias (E) e (F).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: VS – Vasos Sanguíneos; CH – Cordões Hepáticos; HP – Hepatócito; DCH – Desarranjo dos Cordões Hepáticos; DG – Degeneração, VCH – Vacuolização dos Hepatócitos. Coloração (HE).
Nas análises histológicas do fígado dos organismos fêmeas do Controle (CC) e do Controle Acetona (CA), dos testes de 14 e 21 dias, também apresentaram um complexo arranjo de cordões hepáticos, hepatócitos e núcleos íntegros evidentes em quase sua totalidade com vasos e células sanguíneas irrigando o sistema. Algumas partes do tecido em ambos os tempos apresentaram poucas regiões com degenerações ou seja regiões que perderam sua estrutura intracelular. Estas alterações também foram vistas nos organismos machos descritos acima (Figura 28 A e B; Figura 29 C e D).
Figura 28: Corte histológico de fígado de fêmeas de D. rerio dos Controles (CC) do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: VS – Vasos Sanguíneos; CH – Cordões Hepáticos; HP – Hepatócito e N – núcleo. DCH – Desarranjo dos Cordões Hepáticos. Coloração (HE).
Figura 29: Corte histológico de fígado de fêmeas de D. rerio do Controle Acetona (CA) do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D).
Fonte: Acervo pessoal
Legenda: VS – Vasos Sanguíneos Sinusóides; CH – Cordões Hepáticos; HP – Hepatócito. Coloração (HE).
Para organismos fêmeas expostos a (CHLO) 0,60μg/L o tecido hepático apresentou degeneração ou seja, perdeu sua estrutura intracelular, apresentou desorganização dos cordões hepáticos, hipertrofia dos hepatócitos e vacuolização. Porém em 14 dias houve menos áreas afetadas quando comparadas ao teste de 21 dias de exposição (Figura 30 E). Para 21 dias de exposição as degenerações estavam na maior parte do tecido hepático apresentando vacuolização dos hepatócitos, e desarranjos dos cordões hepáticos (Figura 30 F).
Figura 30: Corte histológico de fígado de fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO dos testes de 14 dias (E) e dos testes de 21 dias (F).
Fonte: Acervo pessoal.
Legenda: DCH – Desarranjo dos Cordões Hepáticos; DG – Degeneração, VCH – Vacuolização dos Hepatócitos; VS- Vaso Sanguíneo. Coloração (HE).
7. DISCUSSÃO:
Os resultados obtidos da histologia de gônadas de fêmeas, machos e tecidos hepáticos de Danio rerio indicam potencial de atuação de interferência endócrina, diante de relatos da literatura que demonstram alterações semelhantes a outros pesticidas e poluentes ja descritos como IE e estão referenciadas nesta discussão.
As fêmeas expostas à 0,60μg/L de CHLO apresentaram alterações morfo- histológicas em comparação ao padrão normal (SCHULTZ et al. 2002; OECD, 2010) e foram descritas como um aumento da vacuolização interna de ovócitos de fase IV, com uma basofilia atípica, no entanto vale lembrar que ovócitos em fase IV tende apresentar menos basofilia nesta fase (SCHULTZ et al. 2002). No entanto, Leandro (2014) aponta esta característica observada, como uma fase inicial de atresia do folículo além de, outras alterações como a descontinuidade da zona radiata e hipertrofia das células foliculares também observada por outros autores (MIRANDA et al. 1999; SANTOS et al. 2008; SARASQUETE et al. 2002).
Entretanto, Melo et al. (2014) observaram que alguns folículos atrésicos da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) apresentaram uma zona radiata aparentemente intacta. Já Marcon (2013), em um estudo utilizando o lambari (Astyanax bimaculatus) submetido ao inseticida Thiodan®, obervou essa característica no estádio de atresia parecidos com as encontradas neste trabalho, classificando como fase intermediária do processo de atresia.
Outra alteração encontrada em ovócitos em fase de desenvolvimento V de organismos expostos por 21 dias ao CHLO na presente pesquisa e que também difere da normalidade segundo a literatura, foi a presença de muitos grânulos de vitelo acidófilos fundidos, compondo uma massa única homogênea e coalescente. Esta característica foi observada em ovócitos maduros de espécie de Salminus hilarii (HONJI, 2007) e em alguns outros Teleostei (ROCHA; ROCHA 2006) porém, para a espécie D. rerio, não foram encontrados registros desta condição na literatura.
Outra interpretação que pode ser feita desta alteração, estaria relacionada a uma fase do processo de atresia. A atresia folicular é um processo degenerativo hormonalmente controlado no qual os folículos perdem a sua integridade e são reabsorvidos antes da ovulação (SANTOS et al. 2008; WOOD E VAN DER KRAAK, 2001). Nesse processo, ocorre a desorganização do núcleo e do citoplasma do ovócito, desintegração da zona radiata, fusão e liquefação dos glóbulos de vitelo e hipertrofia das
células foliculares, que adquirem características fagocíticas para ingestão e digestão do vitelo (MIRANDA, 1999; SILVA, 2016).
Entretanto, o aumento da atresia, particularmente em folículos vitelogênicos, a qual foi visto nesta pesquisa, pode indicar uma condição patológica (GRIER et al. 2009; SANTOS et al. 2008). Condições ambientais também podem aumentar a incidência de folículos atrésicos, como a nutrição insuficiente e a exposição a contaminantes, resultando em uma diminuição da capacidade reprodutiva (MIRANDA et al. 1999; SANTOS et al. 2008; GRIER et al. 2009). A atresia folicular também tem sido utilizada como um biomarcador histopatológico para avaliar impacto ambiental (SANTOS et al. 2008). A atresia foi citada por vários autores juntamente com outras alterações e consta na lista de Dietrich e Krieguer (2009) que catalogaram 1200 pesquisas relacionando danos histológicos à exposição de poluentes considerados IE.
Koc et al. (2009), também observaram alterações histológicas em sua pesquisa com Deltametrina, um inseticida do grupo dos Piretróides onde fêmeas de Danio rerio foram expostas a concentrações de 0,5 μg/L e 1μg/L por 96 horas e em ambas exposições causaram alterações histopatológicas, apresentando a inibição do crescimento de ovócitos, aumentando os números de atresia e retardando a ovogênese. A pesquisa revelou também as primeiras informações sobre aspectos histológicos reprodutivos, concluindo que a Deltrametrina é uma ameaça aos ecossistemas aquáticos.
Outro pesticida capaz de interferir no sistema endócrino e afetar negativamente a função reprodutora de D. rerio é o Carbaril, do grupo dos Carbamatos. Mensah et al. (2012) expuseram organismos à diferentes concentrações por até 50 dias após a eclosão dos ovos e pela análise em microscopia de luz observaram uma reversão sexual nos grupos estudados.
Assim como em fêmeas, os machos de D. rerio além sua espermatogênese normal descrita por (OECD, 2010), também apresentaram algumas alterações nas gônadas para organismos expostos por 21 dias ao CHLO, tais, alterações descritas como hipertrofia (aumento do tamanho das células) e degenerações (alterações celulares, geralmente reversíveis quando o estímulo cessa). Porém, para organismos expostos por 14 dias, não encontrou-se machos entre os organismos estudados. Essas alterações podem interferir na espermatogênese dos peixes podendo resultar em danos para a espécie e também consta entre as alterações encontradas em exposição à poluentes de IE, conforme verificado em pesquisas relacionadas por DIETRICH; KRIGER (2009).
Outros autores descrevem alterações em gônadas de peixes machos decorrentes de exposições a outros pesticidas como Agbohessi, et al. (2015) que encontraram algumas alterações em gônadas de machos de Clarias gariepinus decorrentes da exposição em Endosulfan substância comprovadamente denominada de IE e de Tihan 175, como necroses, fibroses, vacuolização, células imaturas liberadas no lúmen, o despreendimento de membranas e presença de espumas de células no lúmen.
Diversos inseticidas são capazes de causar alterações histoanatômicas nas gônadas de peixes machos, como no caso do piretróide sintético Cipermetrina que é metabolizado e eliminado mais lentamente pelos peixes, de forma que peixes expostos por 15, 30 e 45 dias a este inseticida apresentaram diversos danos morfológicos como condensação de células, vacuolização, distorção de epitélio tubular, encolhimento de células, levando ao atraso da maturidade gonadal e da produção de esperma (SRIVASTAVA, et al. 2008).
Assim, podemos verificar que alterações histológicas em gônadas de peixes são alvos diretos ou indiretos quando expostos a agrotóxicos e outros poluentes (WILLEY; KRONE, 2001) e as alterações histológicas com efeitos endócrinos também como, mostra os estudos de TRAMUJAS et al. (2006); DUMITRESCU et al. (2010); ARAÚJO, (2012); KELLOCK, (2013); ARMILATO, (2014) comprometendo desta forma o processo reprodutivo das espécies.
Outro tecido estudado nesta pesquisa foi o tecido hepático (fígado) de machos e fêmeas de D. rerio. Para as fêmeas tanto nos testes de 14 e 21 dias houve a presença de alterações no tecido hepático, porém foi possível perceber que em 21 dias as alterações tomaram a maior parte do tecido e células degeneradas estavam presentes com alta frequência. Para o teste de 14 dias não houve machos entre os organismos estudados sendo relatado apenas para os machos do teste de 21 dias as lesões da mesma grandeza que foi observado para as fêmeas. Este tecido desempenha muitas funções vitais no metabolismo, entre elas: o metabolismo de carboidratos, o armazenamento de lipídios, tendo um papel importante na síntese e oxidação de ácidos graxos (HINTON; LAURÉN, 1990; CONNOLLY, 2014). Além da função digestiva, as células hepáticas armazenam glicogênio, sintetizam proteínas plasmáticas (HEATH, 1987) constituindo o principal meio de detoxificação do organismo (HEATH, 1987; HINTON et al. 1992; TAKASHIMA; HIBIYA, 1995).
De acordo com Dutta et al. (1993), o fígado é o principal sítio de biotransformação da maioria dos agrotóxicos, tanto podendo ocorrer a detoxificação como a bioativação.
Assim, qualquer lesão em seu tecido, pode afetar o funcionamento deste órgão e acarretar graves complicações no metabolismo do organismo. A concentração de agentes externos (xenobiontes) no fígado pode comprometer a excreção desses próprios agentes ou de seus metabólitos através da bile ou ainda a conversão dessas substâncias nos hepatócitos, contribuindo para a vulnerabilidade do fígado a outros agentes químicos de modo geral (HEATH, 1987; HINTON et al. 1992).
Pesquisas realizadas por THOMAS, (1990); KÕHLER, et al. (1992); TEH, (1997) mostraram que em relação as análises dos tecidos do fígado de machos e fêmeas, diversas áreas do tecido hepático apresentaram alterações morfológicas e que de acordo com a literatura, tratavam-se da vacuolização dos hepatócitos, depleção de glicogênio e degeneração, as quais podem ser interpretadas como resposta ao estresse ambiental. Algumas destas alterações também foram encontradas em fígados de machos e fêmeas de D. rerio nesta pesquisa.
No estudo realizado com peixes jundiás (Rhamdia quelen) e o herbicida Clamazone pertencente ao grupo químico isoxazolinonas, também foi constatado a vacuolização nos hepatócitos após 192 horas de exposição a concentrações de 0,5 e 1 mg/L (CRESTANI, 2007).
As alterações histopatológicas hepáticas observadas no presente estudo descritas nos resultados como degeneração celular e nuclear, vacuolização citoplasmática, hipertrofia dos hepatócitos e desarranjo dos cordões hepáticos, parecem constituir uma resposta comum de peixes em ambientes aquáticos degradados ou em testes realizados em laboratório com agrotóxicos, pois também foram citadas e verificados por outros pesquisadores (TAKASHIMA; HIBIYA, 1995; TEH et al. 1997; LEADLEY et al. 1998; FANTA et al. 2003 ALBINATI, et al.2009; ZAGO, et al. 2012; CATTANEO, 2012).
Tagliaferro (2009) estudando a avaliação do inseticida Endosulfan, considerado um IE, encontrou diversas alterações que corroboram as alterações encontradas nesta pesquisa a organismos exposto a CHLO. Estas alterações podem ser descritas como degeneração e vacuolização citoplasmática e foram observadas como as alterações mais frequentes.
Pereira (2012) avaliando a toxicidade do herbicida Atrazina, também classificado como IE, verificou que a exposição de peixes a 2, 10 e 100 μg/L causou diversas alterações morfológicas nos tecidos de órgãos estudados e, semelhante a esta pesquisa, detectou a vacuolização do hepatócitos além de necrose e infiltração leucocitária. Zha et al. 2007 observaram a hipertrofia dos hepatócitos após a exposição de compostos a base de etinilestradiol, um estrógeno encontrado em ambientes aquáticos.
A presente pesquisa trouxe os primeiros relatos a respeito de alterações morfo- histológicas de tecidos de gônadas e fígado de peixes da espécie D. rerio expostos a 0,60 μg/L de Chlorantraniliprole. Também relatou pela primeira vez que a concentração sugerida no documento da European Food Safety Authority (EFSA, 2013) de 0,58 μg/L como concentração regulatória aceitável para organismos aquáticos, é inviável quando se trata de alterações morfo-histológicas de tecidos de gônadas e