CRISTINA ELENA DE SOUZA CORRÊA
Aspectos histológicos de gônadas e fígado de Danio rerio como potenciais biomarcadores indicativos de atuação de interferentes endócrinos do pesticida
Chlorantraniliprole.
CRISTINA ELENA DE SOUZA CORRÊA
Aspectos histológicos de gônadas e fígado de Danio rerio como potenciais biomarcadores indicativos de atuação de interferentes endócrinos do pesticida
Chlorantraniliprole.
Dissertação apresentada como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais pela Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” na Área de
Concentração Diagnóstico, Tratamento e Recuperação Ambiental
Orientador: Prof. Dra. Renata Fracácio
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Unesp
Instituto de Ciência e Tecnologia – Câmpus de Sorocaba
Corrêa, Cristina Elena de Souza.
Aspectos histológicos de gônadas e fígado de Danio
rerio como potenciais biomarcadores indicativos de
atuação de interferentes endócrinos do pesticida
Chlorantraniliprole / Cristina Elena de Souza Corrêa,
2016.
109 f.: il.
Orientador: Renata Fracácio.
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Autora: Cristina Elena de Souza Corrêa
Título: Aspectos histológicos de gônadas e fígado de Danio rerio como potenciais biomarcadores indicativos de atuação de interferentes endócrinos do pesticida Chlorantraniliprole.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Fracácio
Aprovado como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. Área de concentração: Diagnóstico, Tratamento e Recuperação Ambiental, pela Comissão Examinadora:
_________________________ Profa. Dra. Renata Fracácio
Universidade Estadual Paulista – Câmpus Experimental de Sorocaba
____________________________________ Profa. Dra. Maria da Graça Gama Melão Universidade Federal de São Carlos – São Carlos
______________________________
Profa. Dra. Evelise Nunes Fragoso de Moura Universidade Federal de São Carlos – São Carlos
- Dedico esta dissertação ao meu sogro Jairo Honório Corrêa (In Memorian),
por me insentivar ao estudo e ao mestrado;
- Ao meu marido Beto Corrêa, por todo o cuidado com nossa filha Carolina
durante as incansáveis horas de trabalho e por estar sempre ao meu lado
ouvindo, e trazendo tranquilidade as minhas angustias;
- A minha linda Carolina, por me ensinar a cada dia, ser uma pessoa melhor;
- A minha Mãe Vera Lucia Serra de Souza, pelas acolhidas, desabafos e todo o
apoio,carinho e amor;
- A minha Sogra Lilian Mari Honório Corrêa e cunhada Karina Honório Corrêa
por sustentar com amor carinho e dedicação minha família nos longos caminhos
que percorri de estudo e de ausência;
-Ao meu pai, Marcos Antonio de Souza (In Memorian), que estava sempre em
meus pensamentos;
... A eles todo meu amor e admiração e a certeza que nada seria possível
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todo o cuidado e Graça. A família que tanto amo;
A minha Orientadora Dra. Renata Fracácio, pela oportunidade, paciência e orientação;
Ao Dr. Eduardo Bertoletti, pelos grandiosos ensinamentos, conversas, apoio, discussão durante esta caminhada;
A professora Dra.Viviane pelo uso dos equipamentos de laboratório;
A Professora Dra. Evelise Nunes Fragoso de Moura, pelos ensinamentos em histologia;
Ao Gilberto Alkimin pelas conversas, pelo apoio técnico, por estar sempre pronto a ajudar;
A amiga Claudinha por todos os ensinamentos da química apoio e conversas; A amiga Vivian Lira por todo o apoio, dicas, ajuda e conversas, valeu Vi!; A amiga Leda pelas conversas, trocas de experiencias, palavras de amor e
carinho;
A amiga Marcela Merides pelo apoio, carinho, conversas e risadas;
Aos amigos que dividiram os dias de luta e pesquisa, durante os anos de mestrado;
As Técnicas de laboratório Susi, Letícia e Sandra pelo apoio técnico;
Aos estagiários Alessandra e Allan pela ajuda técnica durante o procedimento experimental;
Ao Seu João e Seu Décio responsáveis pela manutenção das dependencias da Unesp, que sempre ajudaram nas trocas de filtro, nas instalações elétricas e na manutenção da sala climatizada;
Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa demanda social;
A Unesp por todo o apoio em minha formação; A Fapesp pelo apoio ao projeto;
SUMÁRIO
1. RESUMO ... 14
2. ABSTRACT ... 16
3. INTRODUÇÃO ... 18
3.1 CLASSIFICAÇÃOTOXICOLÓGICADOSAGROTÓXICOS ... 20
3.1 CARACTERIZAÇÃOQUÍMICAETOXICOLÓGICADOPESTICIDADOGRUPO DIAMIDAS/ANTRANÍLICAS–CHLORANTRANILIPROLE ... 23
3.2 EFEITODOSINTERFERENTESENDÓCRINOSNOSSERES VIVOS ... 28
3.3 BIOMARCADORESHISTOLÓGICOS ... 33
3.3.1 Gônadas Masculinas: ... 33
3.3.2 Gônadas Feminin ... 35
3.3.3 Fígado ... 37
3.4 VIASDEEXPOSIÇÃODEPOLUENTESEMPEIXES... 38
4. OBJ ETIVO GERAL ... 41
4.1 OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 41
5. MATERIAIS E MÉTODOS... 42
5.1 ORGANISMO–TESTEDANIO RERIO ... 42
5.1.1 Características gerais da espécie ... 42
5.1.2 Cultivo e manutenção: ... 44
5.1.3 Teste de sensibilidade ... 46
5.2 TESTESDETOXICIDADE:EXPOSIÇÃODEDANIO RERIO AOPESTICIDA CHLORANTRANILIPROLEDURANTE14E 21DIAS ... 46
5.3 ANÁLISEHISTOLÓGICA ... 49
5.4 DISPOSIÇÃODOSRESÍDUOS ... 50
5.5 DESENHOEXPERIMENTAL ... 51
6. RESULTADOS... 52
6.1 TESTEDESENSIBILIDADE: ... 52
6.2 ANÁLISEHISTOLÓGICA ... 53
7. DISCUSSÃO: ... 78
8. CONCLUSÃO ... 82
9. REFERÊNCIAS ... 83
ANEXO 2: PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO (POP). PREPARO DE ÁGUA DE
CULTIVO (RECONSTITUÍDA) PARA CULTIVO DE DANIO RERIO.. ... 104
ANEXO 3: SOLUÇÃO DE LIXIVIAÇÃO DOS OVOS ... 107
ANEXO 4: PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE ... 108
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Modo de Ação das Diamidas Antranílicas...24
Figura 2: Fórmula estrutural do Chlorantraniliprole...25
Figura 3: Esquema com secções de testículo representando as três diferentes fases da espermatogênese em peixes (Fase Proliferativa, Fase das Divisões Meióticas e Fase da Diferenciação)...35
Figura 4: Esquema com imagens de ovócitos representando o desenvolvimento ovocitário em peixes ...37
Figura 5: Corte transversal do fígado...38
Figura 6: Vias de exposição de xenobióticos em peixes...40
Figura 7: Imagens das diferentes fases do desenvolvimento de Danio rerio e de sua morfologia externa e anatomia interna ...42
Figura 8: Adaptações para o controle da água de cultivo...45
Figura 9: Aquário de reprodução e Ovos...45
Figura 10: Desenho experimental dos testes de exposição ao Chlorantraniliprole por 14 e 21 dias: Ilustração da disposição dos aquários de teste contendo 2 litros de água e 3 indivíduos cada...48
Figura 11: Disposição experimental com D. rerio expostos ao controle, Controle Acetona e CHLO por 14 e 21 dias Teste Crônico...49
Figura 12: Etapas do processo histológico...50
Figura 13: Ilustração das etapas do projeto...51
Figura 14: Carta controle de sensibilidade de Danio rerio a Na Cl...52
Figura 15: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio dos controles (CC) do testes de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B)...54
Figura 16: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio dos controles acetona (CA) do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D)...55
Figura 17: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de 14 dias (E) e do teste de 21 dias (F)...57
Figura 18: Corte histológico de gônadas de fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de14 dias (G) e do teste de 21 dias (H)...58
Figura 20:Corte histológico de gônadas de macho de D. rerio dos Controles do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B)...61 Figura 21: Corte histológico de gônadas de machos de D. rerio dos controles Acetona dos testes de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D)...62 Figura 22: Corte histológico de gônadas de machos de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de 21 dias (E e F)...64 Figura 23: Prancha- Testes de 14 e 21 dias de exposição a Chlorantraniliprole
0,60μg/L. Análise histológica comparativa de gônadas de machos de Danio rerio em
relação ao controle...65 Figura 24: Corte histológico de Fígado de machos de D. rerio dos Controles do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B)...67 Figura 25: Corte histológico de fígado de machos de D. rerio dos Controles Acetona do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D)...68 Figura 26: Corte histológico de Fígado de Machos de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de 14 dias (E) e do teste de 21 dias (F)...70 Figura 27: Prancha- Testes de 14 e 21 dias de exposição a Chlorantraniliprole
0,60μg/L. Análise histológica comparativa de fígado de machos de Danio rerio em relação ao controle...71 Figura 28: Corte histológico de Fígado de Fêmeas de D. rerio dos Controles do teste de 14 dias (A) e do teste de 21 dias (B)...73 Figura 29: Corte histológico de Fígado de Fêmeas de D. rerio dos Controles Acetona do teste de 14 dias (C) e do teste de 21 dias (D)...74 Figura 30: Corte histológico de Fígado de Fêmeas de D. rerio expostos a 0,60μg de CHLO do teste de 14 dias (E) e do teste de 21 dias (F)...76 Figura 31: Prancha- Testes de 14 e 21 dias de exposição a Chlorantraniliprole
LISTA DE TABELAS
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT = Associação Brasileira de Normas Técnicas ABRASCO = Associação Brasileira de Saúde Coletiva ° C = Graus Celsius
CA = Controle de água CC = Controle
CAA = Controle de água com Acetona CHLO = Chlorantraniliprole
CL50 = Concentração letal para 50% dos organismos CL (I) 50 = Concentração letal inicial mediana CONAMA = Conselho Nacional do Meio Ambiente
CONGEA = Conselho Nacional de Controle de experimentação animal.
DBCA = Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino.
DE = Desregulador endócrino
EMBRAPA = Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EFSA = Europian Food Safety Autoritary
FT = Fator de toxicidade
FISPQ = Ficha de informação de segurança de produtos químicos IBGE =Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IE = Interferente endócrino kDa = Kilodalton
ng/L = Nanograma por litro μg/L = Micrograma por litro
OECD = Organisation for Economic Co-operation and Development (Organização de Cooperação e Desenvolvimento Econômicos).
RNAm = Ácido ribonucleico mensageiro.
SINDAG = Sindicato nacional das industrias de defensivos Agricola UNESP = Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" U.S.EPA = United States Environmental Protection Agency (Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos).
TERMOS E DEFINIÇÕES
ÁGUA DE CULTIVO: água utilizada para a manutenção das culturas do organismo teste.
ÁGUA DE DILUIÇÃO: água utilizada para preparar as soluçoes estoque.
ÁGUA RECONSTITUÍDA: água natural (de superfície ou subterrânea), processada ou desclorada, ajustada para pH e dureza exixidos pelo organismo teste, utilizada para o cultivo e diluição.
AMOSTRA: Volume ou massa definidos, retirados de efluentes, águas continentais superficiais ou subterrâneas ou de substancias químicas solúveis ou dispersas em água.
BIOMARCADOR: São considerados modificações biológicas que expressam a exposição e/ou o efeito tóxico de poluentes presentes no ambiente.
CONTROLE: Conjunto de organismos testes expostos somente a água de diluição, para avaliar as condições do ensaio.
ENSAIO SEMI-ESTÁTICO: Ensaio realizado com a renovação da solução teste.
FATOR DE DILUIÇÃO: Número de vezes que a amostra bruta foi diluida.
ORGANISMO TESTE: Organismo utilizado na realização do ensaio de ecotoxicidade.
SOLUÇÃO ESTOQUE: Amostra diluída em água de diluição ou sem diluição, a partir da qual é preparada a solução teste.
SOLUÇÃO TESTE: Amostra diluída ou sem diluição, na qual são expostos os organismos teste.
TOXICIDADE AGUDA: Efeito deletério causado pela amostra na sobrevivência dos organismos teste, no período de exposição do teste.
TOXICOCINÉTICA: Estuda a relação entre a quantidade de um agente tóxico que atua sobre um organismo e a concentração dele no plasma.
1.
RESUMO
O processo produtivo agrícola brasileiro está cada vez mais dependente dos agrotóxicos, tais produtos pelo uso constante e indevido atingem os corpos d’água e passam a interagir com a biota presente, podendo desencadear efeitos tóxicos agudos ou crônicos, além de atuar como interferentes endócrinos (IE). A maioria desses poluentes não apresenta na legislação vigente, limites de exposição segura, considerando-se os múltiplos usos dos recursos hídricos, destacando-se dentre eles a proteção da vida aquática. Diante do exposto, este estudo teve por objetivo verificar efeitos adversos do pesticida Chlorantraniliprole (CHLO) sobre a morfologia de gônadas e fígado de machos e fêmeas adultos de Danio rerio e o seu potencial para atuar como IE. O método consistiu na exposição de 63 machos e 36 fêmeas da espécie D. rerio por 14 e
21 dias a 0,60 μg/L de CHLO. O experimento foi realizado em regime semi-estático com troca total da solução teste a cada 48h, montados em aquários de vidro com capacidade para 2 L de solução teste, de modo a manter a proporção de 1g de peixe/L. O Controle (CC) foi apenas com água de cultivo e o Controle Acetona (CA) com 2,39
desenvolvimento das células germinativas, Espermatogônia, Espermatócitos, Espermátides, Espermatozóides, além da presença das células de Leydig e células de Sertoli. No teste 14 dias não constatou-se a presença de machos entre os organismos estudados, mas para 21 dias de exposição ao CHLO foi notado hipertrofia e degeneração em células gaméticas, especialmente em espermatócitos. Para os tecidos de fígado, degeneração e hipertrofia dos hepatócitos estavam muitos frequentes tanto em machos como em fêmeas expostas a CHLO. De acordo com os resultados apresentados, podemos dizer que a espécie de peixe de D. rerio pode ter sofrido influência do pesticida CHLO tanto nas gônadas quanto no fígado dos organismos estudados em ambos os tempos de exposição. As alterações encontradas neste estudo são os primeiros relatos morfo-histológicos para o CHLO e corroboram as alterações encontradas em estudos de IE para ambos os tecidos (gônadas e fígado). Sendo assim, as análises histológicas demonstraram ser uma ferramenta importante para detectar alterações xenobióticas, sendo considerado nesta pesquisa um biomarcador para o CHLO.
2.
ABSTRACT
The Brazilian agricultural production process is increasingly dependent on pesticides,
such products by constant misuse reach water bodies and begin to interact with this
biota and can trigger acute or chronic toxic effects, besides acting as endocrine
disruptors (IE). Most of these pollutants not presented in the current legislation, the safe
exposure limits, considering the multiple uses of water resources, highlighting among
them the protection of aquatic life. Given the above, this study aimed to verify the
adverse effects of pesticide Chlorantraniliprole (CHLO) on the morphology of gonads
and liver of adult male and female zebrafish and their potential to act as IE. The method
consisted of exposure of 63 males and 36 females of the species D. rerio for 14 and 21
days to 0.60 μg / L CHLO. The experiment was performed in a semi-static scheme with
complete exchange of the test solution every 48 hours, mounted on glass tanks with a
capacity of 2 L of the test solution, so as to maintain the proportion of fish 1 g / L. The
Control (CC) was only cultivation water and Control Acetone (CA) with 2.39 μL / L and cultivation of acetone water followed recommendations OECD (2000; 2010). After
the experimental period the fish were euthanized in ice water to 4C ° and intended for
histology procedure with inclusion in paraffin, staining with hematoxylin and eosin
(HE) staining and examination by light microscopy. Histological analysis of the gonads
of female control (CC) control and acetone (CA), 14 and 21 days showed normal
distribution pattern and maturation, showing cells at different stages of development
and ovaries in different maturation stages. For females exposed to (CHLO) to 0,60μg / L for 14 days, we observed a prevalence of oocytes with lipid and protein vitellogenesis
(IV) and oocytes with complete vitellogenesis (V), few ovogonia and reserve ovocytes
(II ), and changes such as increased internal vacuolization oocytes (III and IV) with a
predominant basophilia that these phases tends to be lower. As early as 21 days were
observed few oocytes in stage II, no phase I and a larger amount of oocytes in stages IV
and V. It was also observed the presence of many granules glued acidophilus calf,
making up a homogeneous and good coalescing mass occupying only of the cytoplasm
of some oocytes in phase V in regard to males, histologic analysis of the controls (CC
and CA) showed a standard normal gonadal development without changes, with all the
development stages of spermatogenesis, spermatogonia, spermatocytes, spermatozoa,
spermatozoa, and the presence of Leydig and Sertoli cells. In 14 test days there was
was noted CHLO hypertrophy and degeneration Gametic cells, especially in
spermatocytes. For liver tissue degeneration and hypertrophy of hepatocytes were many
common in both males and females exposed to CHLO. According to the results, we can
say that the species of fish D. rerio may have been influenced by the pesticide CHLO
both gonads and in the liver of the organisms studied in both exposure times. The
alterations found in this study are the first morphological and histological reports for
CHLO and corroborate the changes found in IE studies for both tissues (liver and
gonads). Thus, the histological analysis demonstrated to be an important tool for
detecting changes xenobiotic, this being considered a biomarker for research CHLO.
3.
INTRODUÇÃO
A produção agrícola brasileira está cada vez mais dependente dos agrotóxicos e fertilizantes químicos. A lei dos agrotóxicos n°7.802 (BRASIL, 1989) e o decreto n°4.074 que regulamenta esta lei (BRASIL, 2002) definem que essas substâncias são:
“Os produtos e os agentes de processos físicos, químicos ou biológicos,
destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos”.
No ano de 2013, as vendas de agrotóxicos geraram faturamento superior a US$ 10 bilhões, 8% a mais que 2012, quando o volume chegou a 823 mil toneladas (ABRASCO, 2015; SUSBRASIL, 2014).
Na safra de maio de 2015 no Brasil foram plantados mais de 76 milhões de hectares (ha) de lavoura temporária (soja, milho, cana, algodão) e permanente (café, cítricos, frutas, eucaliptos), o que corresponde a cerca de mais um bilhão de litros por safra de agrotóxicos pulverizados nessas lavouras, principalmente de herbicidas, fungicidas e inseticidas. Este uso representa 13 litros por ha cultivado, 5,2 litros para cada brasileiro, e 31 litros para cada brasileiro que mora no meio rural (IBGE/SIDRA, 2015a; 2015b; SINDAG, 2015). Em função do uso intensivo e continuo de pesticidas, são cada vez mais comuns casos de intoxicação dos aplicadores e contaminação do ambiente (PAPA, 2008; CARVALHO, 2012).
Deve-se ressaltar que as atividades agrícolas, principalmente aquelas relacionadas a grandes extensões de áreas de monoculturas, geram contaminação difusa em ambientes aquáticos. Os resíduos de agrotóxicos e de nitratos são frequentemente detectados nos escassos monitoramentos realizados nas diferentes regiões do Brasil (EMBRAPA, 2014; SODRÉ, 2012).
Em resumo, os modelos de desenvolvimento adotados pelo homem para a agricultura, a pecuária, a indústria e os centros urbanos não têm levado em conta, há muito tempo, o meio ambiente, e como resultado, diversas substâncias vem interagindo com a biota, causando problemas ambientais, muitos deles praticamente irreversíveis e de extrema relevância como os interferentes endócrinos (IE).
Em 2001, a Comissão da União Européia para Avaliação de Substâncias Potencialmente Desreguladoras Endócrinas divulgou uma lista com 553 substâncias artificiais e 9 hormonais (naturais e sintéticos) destas, 44 eram pesticidas. Já Mckinlay
et al. 2008 em seu estudo sobre os desregulação endócrina através de pesticidas,
listaram 127 pesticidas capazes de atuar no sistema endócrino como IE. Estes IEs, são substâncias sintéticas ou naturais, que influenciam a atividade hormonal de organismos vivos, em uma grande variedade de formas, afetando a saúde, o desenvolvimento e a reprodução e tem sido alvo de estudos nos últimos anos.
Na pesquisa realizada por Oliveira et al. (2013) em que foi feito um levantamento dos agrotóxicos classificados como IE mais utilizados no oeste-paulista, onde os autores destacaram a importância de testes toxicológicos mais específico para tais substâncias, os mesmos produtos citados por eles foram relacionados por varias organizações ambientais como sendo IE como o 2,4 D, Acetocloro, Atrazina, Clomazona, Endosulfan, Metribuzin, Simazina e Trifluralina.
Com o crescente aumento de substâncias químicas no mercado e entre elas muitas sendo classificadas como IE, fica cada vez mais evidente a necessidade de se investigar produtos de uso intensivo como os pesticidas.
O principio ativo Chlorantraniliprole (CHLO), pertencente ao grupo das Diamidas-Antranílicas vem sendo utilizado na formulação de pesticidas e recentemente entrou no mercado por ter um sistema de ação diferenciado pelo combate da broca da cana-de-açúcar e do café que outrora era combatido pelo já banido Endosulfan.
ETX 2.0 a mediana concentração perigo HC5 com valor de 2,91 μg /L, e com a
avaliação de fator 5 chegou-se a concentração regulatória aceitável (RAC) de 0,58 μg/L. Valor este utilizado nesta pesquisa arredondado para 0,60 μg/L para averiguar sua possível atuação como IE (Anexo 1).
Poucos estudos ecotoxicológicos foram encontrados envolvendo o princípio ativo CHLO e organismos aquáticos, sendo que alguns poucos estudos puderam ser vistos nos documentos (USEPA, 2008; EFSA, 2013) ou nas Fispqs (Ficha de
informação de segurança de produtos químicos) dos produtos formulados e estavam
relacionados a testes agudos onde, em sua maioria, se determinava Cl50, Cl(I)50, CE (50)
ou trabalhos relacionados a resistência do organismo-alvo, nenhum trabalho foi encontrado envolvendo estudos histológicos, histoquímicos ou envolvendo Interferentes endócrinos, nem para a molécula e nem para o grupo químico até o presente momento. Sendo assim esta pesquisa apresentará os primeiros relatos morfo-histológicos para a molécula de CHLO em fígado e gônadas de machos e fêmeas de D. rerio.
3.1 CLASSIFICAÇÃO TOXICOLÓGICA DOS AGROTÓXICOS
A cada ano, milhões de hectares de terra continuam sendo convertidos, sobretudo, ao uso agropecuário e também ao uso urbano (BERNARDI et al. 2008). Este crescimento causa o desmatamento, a poluição doméstica, industrial e agrícola, que são ameaças crescentes para a ictiofauna (RODRIGUES, 2003). Devido à liberação de dejetos industriais nas águas, a emissão de partículas poluentes na atmosfera (PIMPÃO, 2006) e a poluição difusa por agrotóxicos, a redução da qualidade da água se torna evidente.
Recentemente, novos pesticidas foram desenvolvidos com potencial de uso generalizado no ambiente, tais como, pulverização em cultura de pomares e florestas para controle de mosquitos, e inevitavelmente tem contato com o meio aquático (AYDIN et
al. 2005), como também deteriorando o ecossistema e afetando o sistema imune dos peixes
(NAYAK et al. 2004).
A classificação dos agrotóxicos segundo o seu grau de toxicidade para o ser humano é fundamental, pois fornece a toxicidade desses produtos relacionados com a Dose Letal 50 (DL50) (Tabela 1).
A classificação quanto ao potencial de periculosidade ambiental baseia-se nos parâmetros bioacumulação, persistência, transporte, toxicidade a diversos organismos, potencial mutagênico, teratogênico, carcinogênico (Tabela 2). E ambas as classificações são mais comumente encontradas, sendo a toxicológica a mais utilizada.
Tabela 1 : Classificação toxicológica dos Agrotóxicos.
Fonte:Brasil, (2005, 1998)
Tabela 2: Classificação de Periculosidade Ambiental:
Classes Grupos
I Produto altamente perigoso
II Produto muito perigoso
II Produto medianamente perigoso
IV Produto pouco perigoso
Fonte: IBAMA, 1989
Os dados relativos à toxicidade dos agrotóxicos autorizados no Brasil revelam o descumprimento da lei número 7.802/1989 (Brasil,1989), justificando-se o banimento de 114 ingredientes ativos, sendo 35 organofosforados; 27 carbamatos; 2,4-D e derivados; fosfina, fosfato de magnésio e fosfato de alumínio; dicloreto de paraquate; dicofol; além de outros 42 ingredientes ativos de diferentes grupos químicos (ANVISA, 2016a).
Dentre os ingredientes ativos de agrotóxicos autorizados no Brasil constam 467 substâncias, sendo 67 (14,3%) da classe I (Extremamente Tóxico), 90 (19,3%) da classe II (Altamente Tóxico), 198 (42,4%) da classe III (Medianamente Tóxico), 94 (20,1%) da classe IV (Pouco Tóxico) e 18 (3,9%) de classe toxicológica não definida.
Quanto à atividade biológica: inseticidas (147%), herbicidas (126%), fungicidas/bactericidas (114%), acaricidas (63%), reguladores de crescimento (36%), feromônios (34%), formicidas (17%), nematicidas (16%), raticidas (10%), cupinicidas
Classes Grupos DL 50(mg/Kg) Cor da faixa
I Extremamente tóxico < 5 vermelha
II Altamente tóxico 5 - 50 amarela
III Medianamente tóxico 50 - 500 Azul
(7%), moluscicidas (3%) e repelentes de insetos (2%). Não há ingredientes ativos da classe IV entre os nematicidas, raticidas, cupinicidas, moluscicidas e repelentes autorizados, e todos os cupinicidas são das classes I ou II. Por outro lado, há numerosos ingredientes ativos de agrotóxicos das classes III e IV autorizados e disponíveis no mercado, atendendo às atividades biológicas demandadas, não havendo justificativa para que ingredientes ativos das classes I e II continuem a ter uso autorizado no País (ANVISA, 2016).
Os agrotóxicos autorizados pela ANVISA são avaliados somente quanto à toxicidade dos ingredientes ativos, mas há outros possíveis ingredientes tóxicos presentes nas formulações, que não são avaliados, mas que poderiam ser contemplados nesta avaliação, pois eles também podem representar riscos à saúde humana e aos ecossistemas.
O próprio princípio ativo Chlorantraniliprole dentro de seus produtos comercializados possui uma classificação mais restritiva quando se fala em periculosidade ambiental, podendo ser visto na (Tabela 3), classificação toxicológica III ou IV enquanto a periculosidade ambiental varia de produto altamente perigoso ao meio ambiente I a produto perigoso ao meio ambiente II. No entanto seu uso é amplamente feito dentro de diversas culturas agrícolas.
Tabela 3: Classificação toxicológica e de periculosidade ambiental dos produtos formulados com Clorantraniliprole de acordo com a ANVISA.
Produtos formulados com o principio ativo Chlorantraniliprole Classificação Toxicológica Classificação de periculosidade Ambiental
Altacor® III II
Altacor BR® III II
Ampligo® II I
Coragen® I I
Dermacor® IV II
Durivo® III II
Instivo® II II
Premio® III II
Voliam Flex® III II
Voliam Targo® II II
Fonte: AGROFIT, 2016.Legenda: Classificação Toxicológica I (Extremamente Tóxico); II (Altamente
Dessa forma, nossa legislação precisa rever suas classificações toxicológicas e de periculosidade ambiental, adequar e incluir concentrações seguras, ajustar estudos e testes mais específicos que contemplem o uso de testes reprodutivos, biomarcadores histológicos, histoquímicos, análise de multigerações, entre outros testes para que se tenha o maior número de informações de como agem as moléculas químicas para daí sim, estabelecer padrões realmente seguros para o meio ambiente e as comunidades que dela fazem parte, pois uma vez lançadas no ambiente, quaisquer substâncias ou compostos químicos podem iniciar uma infinidade de interações entre si e com os constituintes do meio, que poderão resultar nas mais diferentes formas de ação e efeito sobre as comunidades biológicas a elas expostas (SILVEIRA, 2007).
3.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E TOXICOLÓGICA DO
PESTICIDA DO GRUPO DIAMIDAS / ANTRANÍLICAS – CHLORANTRANILIPROLE
Durante a década de 1940, estudos a partir de extratos da casca de Ryania
speciosa (Flacourtiaceae), uma planta nativa da America do Sul e Central (WARE,
1892) conduziram à identificação de uma série de moléculas com atividade inseticida de ação paralisante, denominadas rianoides (EDWARDS et al. 1948; JEFFERIES et al. 1992).
Dentre os rianoides descobertos, a rianodina detém maior estudo e atenção, devido a sua alta afinidade a determinados canais de cálcio (receptores) no retículo sarcoplasmático (CORONADO et al. 1994; CORDOVA, et al. 2006; LAHM et al. 2009). Devido à eficácia da rianodina como inseticida natural, sua afinidade a canais de Ca2+ bem como o conhecimento da dinâmica do sistema muscular de insetos, especulou-se que os ridionas especulou-seriam excelente alvo para inespeculou-seticidas sintéticos (SATELLE et al. 2008), pois resultavam em perda dos estoques de cálcio intracelular , levando à paralisia muscular e morte (HUMERICKHOUSE et al. 1993) (Figura 1).
Figura 1- Modo de Ação das Diamidas Antranílicas
Fonte: Las diamidas (2011).
O CHLO foi classificado como classe III (medianamente tóxico) pela ANVISA (Agencia Nacional de Vigilância Sanitária), é registrado em vários países, e utilizado para 11 grupos de frutas, 12 grupos de frutas de caroço, 4 grupos de legumes, 5 grupos de brássicas (brócolis, couve flor, couve manteiga, couve de bruxelas, agrião, rabanete, repolho, mostarda e rúcula), 9 grupos de cucurbitáceas, algodão, uvas, batatas, arroz,
ornamentais e gramas (USEPA, 2008). Uso agrícola pode ser feito na aplicação foliar nas culturas de abóbora, abobrinha, algodão, arroz, aveia, batata, brócolis, café, cana-de-açúcar, cevada, chuchu, citros, couve, couve-chinesa, couve-de-bruxelas, couve-flor, feijão, girassol, maçã, maxixe, melão, melancia, milho, pepino, pêssego, repolho, soja, tomate, trigo e uva. Pode ser aplicado diretamente no solo, pulverizados ou ainda diretamente nas sementes.
Apresenta como características químicas e físicas a fórmula molecular: C18H14BrCl2N5O2, e estrutural o nome químico 3-Bromo-N-[4-chloro-2-methyl-6-
a solubilidade na água: 1,0 mg/L (20⁰C) e densidade: 1,51 g/mL (20⁰C) (USEPA, 2008; LAHM et al. 2009) (Figura 2).
Figura 2 - Fórmula estrutural do Chlorantraniliprole.
Fonte: Sigma Aldrich, (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/FLUKA/32510). CHLO é caracterizado como substância persistente e móvel em ambientes aquáticos e terrestres. Pode causar acumulação do resíduo no solo de um ano para outro, as principais vias de dissipação são através da hidrolise alcalina catalisada, fotodegradação em água, lixiviação e escoamento (USEPA, 2008).
Em um trabalho sobre a degradação química e fotoquímica de CHLO, pôde ser observado por Lavtizar et al. (2014) a fotodegradação em água de torneira (pH = 8,0) a meia vida de 4,1 dias e em água deionizada (pH = 6,1) apresentou a meia vida de 5,1 dias. O estudo mostrou que a degradação de CHLO em água é uma combinação química e fotoquímica e as reações, são altamente dependentes do pH da solução, neste estudo a matéria orgânica e nitratos teve pouco efeito sobre a fotodegradação.
Os efeitos tóxicos para organismos aquáticos puderam ser obtidos nas FISPQs (Ficha de informação de segurança de produtos químicos) dos produtos formulados com o CHLO e do próprio padrão puro e em poucas pesquisas científicas encontradas. Nas FISPQs valores de toxicidade aguda para organismos aquáticos como a Daphnia
magma a CL50/48h foi de 0,029 mg/L e da alga verde Raphidocelis subcapitata antiga
Pseudokirchneriella subcapitata a CL50/72h foi de 5,0 mg/L; (DUPONT, 2012).
Tabela 4: Resumo das características de alguns pesticidas que contém o princípio ativo Chlorantraniliprole em sua formulação.
NOME DO
PRODUTO EMPRESA
% PRINCIPIO ATIVO PRINCIPAL UTILIZAÇÃO MODO DE
CONTATO DISPERSÃO
Cl (50) PARA PEIXES
Prêmio® Dupont 200g/L (20%
m/v) Algodão
25ml/ha á
150ml/há Cl(50) 96h 9,9 mg/L
Lepomis macrochirus
Dermacor® Dupont 625g/L (62,5% m/v)
Algodão;
Soja caldo
100ml/kg á 400ml/kg kg
de semente
CL(50) 96horas 7,74 mg/L Danio rerio
Altacor® Dupont 350g/kg (35% m/m)
Café, Cana de açúcar
60g/ha á 450g/há
CL(50) 96h 3,2 mg/l Raibow trout e
Bluegill sunfish
Ampligo® Syngenta 100g/L (10%m/v)
Algodão, milho e soja
Pulverização foliar
50ml/ha á 400ml/há
CL(50) 96 horas
Oncorhynchus mykiss
(truta arco-íris), 0,025 mg/l, 96h
Durivo® Syngenta
100g/L (10% m/v)
Soja, algodão, arroz, vegetais,
frutas
200ml/ha á
400ml/há ----
Pestanal® Sygma Aldrich
Padrão Analítico
99,6%
Cl (50) 96h 13,8mg/L
Oncorhynchus mykiss e
15,1mg/L Lepomis
macrochirus
Fonte: DUPONT, 2009, 2013a e 2013b; SYGMA-ALDRICH, 2016; SYNGENTA, 2014 e 2016. Tabela autoria própria.
Uma recente pesquisa comparou o CHLO com outros pesticidas do mesmo grupo químico (Cyantraniliprole e Flubendiamide) quanto à sua toxicidade aguda e crônica, revelando que CHLO foi mais tóxico dentro do seu grupo químico para
Daphnia magma conforme os dados apresentados no teste de 48h a CE50 9,4μg/L ,
efeitos na taxa de crescimento da população, também foram observados a partir da dose de 3,5μg/L (LAVTIZAR, et al. 2015).
Efeitos crônicos puderam ser vistos numa pesquisa realisada com o organismo
Chironomus riparius, onde a exposição ao CHLO prejudicou o crescimento,
desenvolvimento e sobrevivência do organismo. A pesquisa também estabeleu valores
larvas de C. riparius, o experimento foi realizado com o padrão puro de CHLO e usado
acetona a 0,01% em todos os testes (RODRIGUES, et al. 2015).
Peixes da espécie Channa punctatus expostos a diferentes concentrações de CHLO entre faixa de 0, 1 e 17 mg/L durante 96 h , resultou em uma CL50 96h de
14,424mg /L. A partir da investigação da toxicidade aguda acima, concluiu-se que o pesticida CHLO foi altamente tóxico aos peixes e tiveram um impacto sobre as
respostas comportamentais e respiratórias (NAGARAJU; RATHNAMMA, 2013).
Rathnamma e Nagaraju (2013) propuseram determinar a toxicidade aguda para Labeo rohita usando o produto comercial Coragen® (CHLO 18,5%), com
resultado obtido para a CL50 96h de 12,7mg/L. Concluiu-se que estudos mais
aprofundados sobre a fisiologia, alterações patológicas assim como bioconcentração e bioacumulação nos tecidos dos peixes precisam ser investigados. Em outro experimento realizado por Rathnamma; Nagaraju (2014) também utilizando o pesticida comercial Coragen® (CHLO 18,5%), os organismos foram expostos a uma dose de 1,1008mg/L
por 10 e 15 dias, respectivamente, revelaram um aumento significativo nos níveis de
catalase e aumento da atividade enzimática superóxido dismutase em tecidos
musculares, rim, brânquias e do fígado analisado.
Rodrigues et al. (2016), analisaram as respostas comportamentais da planária
de água doce a exposição ao CHLO e os resultados mostraram que breves exposições
suscitaram inibição da alimentação e atividade locomotora, destacando para a validade
dos parâmetros comportamentais como ferramentas complementares na avaliação dos
efeitos sub-letais de pesticidas neurotóxicos.
Os trabalhos apresentados acima estão representados na Tabela 5 a fim de
facilitar a visualização rápida dos trabalhos significativos de toxicidade envolvendo a
Tabela 5: Efeitos agudos e crônicos em organismos aquáticos com produtos que contém Chlorantraniliprole.
Fonte: Autoria própria. Legenda: CL50= Concentração letal, CENO = Concentração de
efeito não observado.
3.2 EFEITO DOS INTERFERENTES ENDÓCRINOS NOS SERES VIVOS
Um interferente endócrino (IE) pode ser definido como “uma substância que possui propriedades que podem conduzir a perturbações do sistema endócrino num
organismo intacto” (BIRKETT, et al.2003 apud GUISELLI; JARDIM, 2007).
E segundo Bila e Dezotti (2007), as substâncias classificadas como Interferentes endócrinos usadas ou produzidas para diversas finalidades, podem ser agrupadas em quatro classes: a) substâncias sintéticas utilizadas na agricultura e seus subprodutos, como pesticidas, herbicidas e fungicidas; b) substâncias sintéticas utilizadas nas
FONTE ORGANISMO TESTE
EFEITO
AGUDO EFEITO CRÔNICO
CHLORANTRA -NILIPROLE C18H14BrCl2N5O2
2015 Lavtizar
et al.
Daphnia magna CE50/ 48h 9,4μg/L
3,7 μg/L
21 dias Afetou a taxa de
crescimento populacional a 3,5μg/L
Padrão Puro 99,5% 2015 Rodrigues et al. Chironomus
riparius Cl50/ 48h 77,5μg/l
3,1μg/L
Baixo crescimento larval e emergência
Padrão Puro 99,5% 2014 Rathnamma; Nagaraju, Ctenopharyngod on Idella CL50/96h 11,008mg/L
1,1008mg/L por 10 e 15 dias A superóxido-dismutase e catalase,
níveis oscilaram em todos os tecidos
Coragen®18,5%
2013 Rathnamma;
Nagaraju
Labeo Hohita CL50/ 96h 12,7
mg/L - Coragen® 18,5%
2013 Rathnamma;
Nagaraju
Ctenopharingod on idella
CL50/ 96h 11,008
mg/L
Aumento no movimento opercular,
secretada muco em excesso em todo o
corpo. Coragen® 18,5% 2013 Nagaraju; Rathnamma Channa punctatus
CL50 /96h 14,424
mg/L - Coragen®18,5%
2013 Barbee
et al.
Procambarus clarkii
CL50/ 96h
951μg/L
CENO 480μg/L
Via ingestão de sementes tratadas com Dermacor por 37 dias. Não observou efeitos
adversos
indústrias e seus subprodutos, dioxinas, policlorados (PCBs), compostos orgânicos de estanho, retardante de chama bromados, parabenos, alquilfenóis e seus subprodutos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), ftalatos e bisfenol A; c) substâncias naturais, como fitoestrogênios, genisteína, coumesterol, flavonas metarresinol e os estrogênios naturais 17β-estradiol, estrona e estriol d) compostos farmacêuticos, como o
17α-etinilestradiol ou algumas drogas dietilbestrol, tamoxifeno (USEPA, 2001; GÜLTEKIN; INCE, 2007).
Diversas substâncias químicas com potencial de interferente do sistema endócrino de vertebrados e invertebrados têm sido detectadas em ambientes aquáticos do mundo todo inclusive no Brasil, em águas superficiais e em diferentes concentrações (REIS et al. 2006; SODRÉ et al. 2007a; MOREIRA et al. 2009).
Porém em ambientes brasileiros, os trabalhos com IE ainda são muito pouco encontrados. Sodré et al. (2007b) avaliaram alguns compostos emergentes em rios da região metropolitana de Campinas-SP, detectaram com maior frequência nas amostras, o di-nbutilftalato (78%), a cafeína (61%), o bisfenol-A (33%), o 17ß-estradiol (28%) e o
17α-etinilestradiol (23%). Nessa pesquisa, os autores concluíram que se torna necessário o desenvolvimento de tecnologias que removam os IE das águas destinadas ao abastecimento público, evitando-se danos fisiológicos em longo prazo.
Desta forma, a realização de análises que verifiquem sua expressão é de grande importância para o monitoramento de ambientes aquáticos como rios e reservatórios de abastecimento público. Pois esta avaliação pode indicar que estes locais possam estar recebendo o despejo destas substâncias e, consequentemente, disponibilizando-as para o ambiente, para a população, assim como para outras espécies (SUMPTER; JOBLING, 1995; MARIN; MATOZZO, 2004;CORDEIRO, 2009) e consequentemente, interagindo com seu sistema endócrino.
O sistema endócrino é o principal responsável pela comunicação química entre os órgãos e tecidos, o que ocorre por meio de mensageiros químicos denominados hormônios. Cada célula do tecido-alvo tem receptores hormonais em suas membranas ou em seus núcleos que são constituídos por proteínas que apresentam alta afinidade por um dado hormônio e tem dupla função, ou seja, reconhecer o hormônio e transformar o sinal hormonal em resposta biológica (HANSON et al. 2005).
moduladores e desreguladores endócrinos ou IE (KRAAK 1998, CORDEIRO, 2009; MARIN; MATOZZO, 2004). Segundo Dickerson et al (1998), existe uma diferença entre químicos moduladores e os interferentes endócrinos. Os moduladores causam alterações endócrinas reversíveis e os efeitos não são considerados adversos. Já os interferentes provocam respostas endócrinas irreversíveis no sistema biológico.
A ação dos químicos IE ocorre pelo bloqueio, mimetização e estimulação ou inibição dos hormônios naturais. Geralmente eles alteram o estado homeostático dos hormônios e prejudicam sua interação com os receptores interferindo no tipo de ligação do hormônio com o seu receptor ou alterando a sua síntese, estocagem, liberação, transporte, metabolismo e eliminação natural (HANSON et al 2005; REIS et. al 2006). Assim, as funções reprodutivas, o desenvolvimento, o comportamento, a imunidade e a sobrevivência de vários grupos animais podem ser comprometidos por essas substâncias (JOBLING; TYLOR, 2006).
Os efeitos dos IE sobre os organismos dependem da intensidade do estresse, do tempo de contato com o organismo, da frequência a que este organismo é exposto, da biologia, da fase de vida e da etapa do ciclo reprodutivo da espécie (KENDALL et. al. 1998). As características dos fatores abióticos, como as propriedades físico-químicas das substâncias IEs, bem como as condições ambientais em que elas se encontram, também influenciam na atuação desreguladora sobre o funcionamento endócrino (TILLITTI et. al. 1998).
Após um levantamento sobre os agrotóxicos utilizados na cultura de cana-de-açúcar na região da sub-bacia do Rio Corumbataí (Integrante da bacia do Rio Piracicaba), Armas et al. (2005) destacaram os herbicidas como a classe mais empregada, entre eles estão: o glifosato, atrazina, ametrina, 2,4-D, metribuzim, diuron e acetocloro representando 85% do volume total de produtos consumidos no período estudado. Outro estudo realizado entre 2004 e 2005 na mesma sub-bacia, os autores detectaram em amostras de água os herbicidas hexazinona, glifosato, clomazona e do grupo das triazinas (ametrina, atrazina e simazina), sendo a cultura de maior expressão a de cana-de-açúcar. Os níveis de detecção mais elevados foram das triazinas: ametrina 0,7-2,9 μg.L-1, atrazina 0,6-2,7 μg.L-1e simazina 0,3-0,6 μg.L-1. (ARMAS et. al 2007).
Muitos destes já considerados por diversas organizações como sendo IE.
os IEs como potenciais causadores da diminuição da biodiversidade aquática, associando os desreguladores endócrinos com a destruição e / ou fragmentação do habitat, o que pode conduzir ao isolamento da população, endogamia e redução da diversidade genética. Alterações histológicas não só em gônadas de machos e fêmeas, mas também em fígado e brânquias decorrentes da exposição de organismos a agrotóxicos também foram vistos por outros autores (NEŠKOVIC et al. 1996,
JIRAUNGKOORSKULA et al. 2002, ALTINOK; CAPKIN, 2007; ALBINATI, et al. 2009; ZAGO, et al. 2012; ARMILIATO et al. 2014; MARCON, et al. 2013).
Até o presente momento, sabe-se que a maioria das substâncias classificadas como IEs são do grupo dos pesticidas (GUISELLI; JARDIM, 2007), o que ressalta a importância de estudos com pesticidas emergentes como o CHLO. Na tabela 6, destaca-se alguns pesticidas capazes de atuar como IEs.
Tabela 6: Listas de alguns pesticidas classificados como interferentes endócrinos por várias organizações.
Pesticidas Organizações
UKEA USEP
A
OSPAR
In vivo In vitro JEA WWF
Atrazina X X X X X
Simazina X X X X X
Dicloros X
Endosulfan X X X X X
Trifluralina X X X
Dimeton-S-metil X
Dimetoato X X
Linuron X
Permetrina X X X
Lindano X X X X
Clordano X X X
Dieldrin X X X X X
Hexaclorobenzeno X X X X
Pentaclorofenol X X X X X
Em ambientes de água doce os peixes são bastante afetados por substâncias químicas desreguladoras (JOBLING; TYLER, 2006). Em outros grupos de organismos os efeitos dos desreguladores são mais difíceis de serem avaliados em decorrência da escassez de conhecimentos fisiológicos.
As alterações mais comuns encontradas devido à ação dos IEs em peixes incluem a diminuição da fertilidade e da produção de ovos pelas fêmeas; redução no tamanho das gônadas de peixes machos e fêmeas; feminização de machos e defeminização das fêmeas; ocorrência de indivíduos intersexos; aumento na concentração de vitelogenina (VTG) nos machos (lipoglicoproteína comum em fêmeas por ser precursora do vitelo); diminuição da imunidade; aumento na mortalidade de embriões e aumento de ocorrência de deformidades corporais e histopatologias, mais frequentemente nos rins, fígado e gônadas (JONES; REYNOLDS, 1997; ARCAND-HOY; BENSON, 1998; KIRBY et al. 2004; REIS, et al. 2006; HAN, et al. 2011).
A principal preocupação com os compostos químicos de IE é a capacidade de estas substâncias afetarem a reprodução das espécies e interferirem no desenvolvimento saudável da prole, afetando a reprodução ou produção de hormônios, podendo levar em longo prazo a extinção de espécies de ciclo de vida curto (MANAHAN, 2003; AMÉRICO, et.al. 2012).
Van Der Ven et al. (2003) discutem que os eventos moleculares desencadeados pelas atividades hormonais têm efeitos na morfologia de células, tecidos e órgãos de peixes. As alterações apresentam íntima associação com os desreguladores hormonais sobre o sistema biológico. As mudanças histológicas detectadas, por exemplo, nas gônadas de peixes podem ser um indicativo do comprometimento da saúde da espécie em determinada condição e consequentemente, uma predição da saúde da população desta mesma espécie em condições ambientais.
Assim, para melhor interpretação dos problemas ambientais sobre a biota, é necessária a associação de vários métodos e informações que forneçam respaldo para compreender o funcionamento dos seres vivos frente a uma nova condição ambiental (ROSA et. al. 2015).
gônadas e imuno-histoquímica, têm propiciado um avanço no entendimento da toxicidade reprodutiva em laboratório e em campo (PANTER, et al. 1998; SCHMID et
al. 2002; HAN, et al. 2011).
3.3 BIOMARCADORES HISTOLÓGICOS
Um biomarcador é definido como alterações biológicas (molecular, celular ou fisiológica) em resposta a mudanças ambientais, que podem estar relacionadas à exposição ou a efeitos tóxicos de químicos ambientais (PEAKALL, 1994).
A histologia é uma ferramenta muito útil para diagnosticar efeitos agudos e crônicos de agentes químicos em peixes (AKAISHI et al. 2004). Os biomarcadores histológicos permitem visualizar os efeitos da exposição a vários agentes, biológicos e químicos, sendo considerada importante ferramenta na avaliação de alterações patológicas em peixes em curto e médio prazo dependendo, portanto, da concentração de contaminante e do tempo de exposição, permitindo uma abordagem relativamente fácil de identificação de possíveis alterações em diversos tecidos e órgão de peixes principalmente brânquias, fígado, rim, gônadas e pele (JOHNSON et al. 1993; VAN DER OOST et al. 1996; BERNET, et al. 1999).
3.3.1 Gônadas Masculinas:
Os testículos do Danio rerio são órgãos pares localizados na cavidade celômica e sustentados dorsalmente pelo mesórquio. Apresentam uma porção central e contínua que se comunica com o ducto espermático, o qual se abre no exterior através da papila urogenital. A forma, o volume, a coloração e a irrigação sanguínea também variam nos diferentes estádios do ciclo reprodutivo.
Durante a espermatogênese, as células germinais primordiais (espermatogônias) sofrem mitoses, originando os espermatócitos, os quais se dividem meioticamente, originando as espermátides que, ao sofrerem espermiogênese, darão origem às células reprodutoras masculinas os espermatozóides (COSTA, 2004).
O testículo é revestido externamente por uma fina cápsula fibrosa de tecido conjuntivo que se estende para o interior, delimitando os túbulos seminíferos (RIBEIRO, 2005).
tecido conjuntivo frouxo de preenchimento, além das células de Leydig (também denominadas células intersticiais) e de vasos sanguíneos. O conjunto formado pelas células de Sertoli, Leydig e demais células da região intersticial corresponde às células somáticas que compõe o testículo (SCHULZ et al. 2010; RUPIK et al. 2011; HUSZNO; KLAG, 2012).
A espermatogênese dos peixes pode ser dividida em três etapas principais: a etapa proliferativa, caracterizada por rápidas divisões mitóticas sucessivas das espermatogônias; a etapa de divisões meióticas responsáveis pela formação dos espermatócitos e espermátides; e a etapa de diferenciação das espermátides em espermatozoides (NÓBREGA et al. 2009) (Figura 3). Estas células germinativas estão organizadas de forma cística, onde cada cisto, delimitado por extensões citoplasmáticas de células de Sertoli, é formado por um único tipo de célula germinativa.
Os cistos de espermatogônias são inicialmente formados por uma única espermatogônia que prolifera por divisão mitótica, sendo que as células filhas permanecem ligadas entre si por pontes citoplasmáticas responsáveis pela forma sincrônica do desenvolvimento destas células germinativas (ALMEIDA et al. 2008; NÓBREGA et al. 2009; SCHULZ et al. 2010).
Figura 3: Esquema com secções de testículo representando as três diferentes fases da espermatogênese em peixes (Fase Proliferativa, Fase das Divisões Meióticas e Fase da Diferenciação).
3.3.2 Gônadas Feminin
Nas fêmeas de Danio rerio os ovários, quanto à sua morfologia, são órgãos pares, saciformes e sustentados dorsalmente na cavidade celômica pelo mesovário. Os ovários direito e esquerdo unem-se na extremidade caudal para formar o ducto ovariano, que se comunica com a papila urogenital. A forma, o volume, a coloração e a irrigação sanguínea dos ovários variam, nos diferentes estádios do ciclo reprodutivo (COSTA, 2004).
Os folículos ovarianos compreendem o ovócito, as células foliculares e a membrana vitelina. A ovogênese, em teleósteos, inicia-se com a proliferação e diferenciação de ovogônias por meio do processo mitótico. Essas células germinativas primordiais podem apresentar-se em ninhos ou isoladamente (SCHULTZ et al. 2002). Caracterizam-se por apresentar citoplasma escasso, núcleo grande com nucléolo proeminente e originam ovócitos, pré-vitelogênicos e vitelogênicos. Os folículos ovarianos desenvolvem-se por processos meióticos até o completo desenvolvimento. Os folículos pós-ovulatórios são estruturas remanescentes nos ovários pós-ovulação, tendo a parede constituída por células foliculares e tecido conjuntivo (SCHULTZ et al. 2002).
Durante o processo de maturação do folículo ovariano, podem-se observar mudanças na sua morfologia tanto quanto na constituição química, que caracteriza as cinco estádios de maturação distintas no seu desenvolvimento (SCHULTZ et al. 2002) (Figura 4).
Espermatogonias Espermatócitos Espermátides Espermatozóides
ESPERMATOGÊNESE
Fase Proliferativa
Células primordial
Divisões Mitóticas
Fase das Divisões Meióticas Fase Diferenciada
Completa
I (Ovogônia) Células pequenas, em ninhos; o citoplasma é reduzido; o núcleo é grande com nucléolo único, basófilo e central.
II Células foliculares pavimentosas envolvem o ovócito e permanecem dessa forma durante todo o processo. O ovócito apresenta um tamanho maior, o citoplasma se torna mais volumoso, mas ainda reduzido em relação ao núcleo, que começa a sofrer fragmentação nucleolar.
III Surgem vesículas citoplasmáticas na periferia do ovócito (sem afinidade por HE) e a membrana vitelina (envolvendo o ovócito). O citoplasma é mais volumoso e menos basófilo. Os nucléolos se encontram periféricos ao núcleo.
IV Caracterizada pela presença de dois tipos de inclusões citoplasmáticas no ovócito: as vesículas citoplasmáticas e os grânulos de vitelo; a membrana vitelina sofre um espessamento, com estriações transversais evidentes.
Figura 4: Esquema com imagens de ovócitos representando o desenvolvimento ovocitário em peixes.
Fonte: Autoria Própria
Legenda: : Fase I - Ovogônias, Fase II – Ovócitos de reserva, Fase III – Ovócitos c grânulos lipídicos, Fase IV – Ovócitos com vitelogênese lipídica e proteica, Fase V – Ovócitos com vitelogênese completa.
3.3.3 Fígado
O fígado localiza-se na cavidade celomática com os demais órgãos, sendo formado basicamente por hepatócitos dispostos como uma dupla camada celular ao redor de sinusóides. Os hepatócitos são poliédricos, com bordos distintos, amplo citoplasma com diferentes graus de vacuolização. O fígado (Figura 5) é uma glândula digestiva composta por parênquima celular (hepatócitos) e por fibras que promovem sua sustentação (cordões hepáticos). A superfície hepática é revestida por uma membrana serosa e o tecido conectivo dessa cápsula penetra no parênquima hepático. Os hepatócitos são células uninucleadas com forma poligonal que possuem importantes funções metabólicas. Também é possível visualizar no fígado vascularização de grande calibre, sinusóides (vasos sanguíneos de pequeno calibre), ductos biliares, tecido pancreático e centro melanomacrofágico (TAKASHIMA;HIBIYA 1995).
DESENVOLVIMENTO OVOCITÁRIO
Células germinativas Jovens (Ninhos) Fase I
Cromatina-nucleolar
Ovócitos do estoque de reserva Fase II
Perinucleolar Ovócitos com grânulos
lipidicos Fase III
Formação da visícula vitelínica
Ovócitos com vitelogênese lipídica e protéica Fase IV
Vitelogênese
Ovócitos com vitelogênese completa Fase V
O núcleo único dos hepatócitos é arredondado e localiza-se geralmente central ou levemente periférico. Em casos em que a vacuolização é mais acentuada, o núcleo apresenta-se deslocado para a periferia.
Em fêmeas os hepatócitos apresentam-se mais basofílicos e os hepatócitos de fígado de machos mais eosinofílicos (VAN DER VEN, 2003).
A vesícula biliar é como uma estrutura oca, com epitélio de transição, enquanto os ductos biliares possuem epitélio simples cúbico. Os vasos sanguíneos do fígado são constituídos por epitélio simples pavimentoso (TAKASHIMA; HIBIYA 1995).
Figura 5- Corte transversal de fígado.
Fonte: YONKOS, 2000.
Legenda: - Fígado corte transversal, HE, (barra = 22.8 μm), Legenda: 1) hepatócitos; 2) ductos biliares; 3 e 4) vasos sinusóides; 5) tecido conectivo; 6) centro de melanomacrófagos; 7) veia porta.
3.4 VIAS DE EXPOSIÇÃO DE POLUENTES EM PEIXES.
incorporados, os poluentes podem ser acumulados nas células das brânquias, do fígado, do rim, do intestino e dos músculos.
Uma vez nos organismos por qualquer destas vias, os poluentes podem ser absorvidos e passar para o sangue, podem ser distribuídos pelo organismo todo, chegar a determinados órgãos onde são biotransformados, produzir efeitos tóxicos e posteriormente serem eliminados ou podem ser acumulados no organismo.
No fígado e no rim os poluentes são biotransformados enzimaticamente, para se tornarem hidrossolúveis e então serem excretados pela pele através do muco, pelo intestino através das fezes, pelo rim através da urina, ou pelas brânquias (HEATH, op. cit.).
O fígado é um órgão chave quando se considera a ação dos poluentes químicos sobre o peixe. É o primeiro órgão na biotransformação dos xenobióticos, assim outros xenobióticos se acumulam no fígado, de modo que suas células ficam expostas a um nível elevado de agentes químicos que podem estar presentes no meio ambiente ou em outros órgãos do peixe (HEATH, 1987).
Devido a sua função no metabolismo de xenobióticos e sua sensibilidade a poluentes, o fígado tem recebido atenção em estudos toxicológicos relacionados à contaminação de diferentes espécies de peixes por diversos agentes (HINTON et al. 1992). Na presença de poluentes, o fígado pode desenvolver alterações histológicas nos hepatócitos que podem ser usadas para o monitoramento de efeitos de contaminantes (HINTON; LAURÉN, 1990; HINTON et al. 1992; TAKASHIMA; HIBIYA, 1995; TEH et al. 1997)
Quanto à reprodução, normalmente apresenta ritmos endógenos é estimulada por sinais ambientais, sendo que a mesma sempre ocorre em condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento de larvas e alevinos. As alterações dos fatores ambientais são detectadas por receptores específicos, transmitidas ao cérebro e, depois, para o hipotálamo, alterando a sua produção e liberação de hormônios.
A parte reprodutiva é controlada por inúmeros fatores endócrinos ligados ao eixo hipotálamo-hipófise-gônadas que se comunicam com o ambiente por meio de órgão dos sentidos estimulando o hipotálamo que por sua vez transmite sinais a hipófise, transportando os hormônios Hormônio liberador de gonadotrofina - GnRH (EVANS; CLAIBOME, 2005; DA COSTA et al. 2012).
CLAIBORNE, 2005), tendo efeito local direto no desenvolvimento de células germinativas, mas agem também nos hormônios endócrinos para influenciar nos tipos de células e órgão envolvidos na diferenciação sexual, além disso são responsáveis pelo comportamento sexual e características sexuais secundárias (SWANSON et al. 2003).
Figura 6: Vias de exposição de xenobióticos em peixes.
Fonte: Autoria própria
Sendo assim esta pesquisa procurou responder as seguintes questões:
A concentração sugerida na literatura apresenta-se realmente segura para organismos aquáticos, especificamente para D.rerio?
Os organismos expostos por 14 e 21 dias a CHLO apresentaram um potencial de ser IE?
As alterações encontradas são semelhantes a obtidas por produtos IE?
O CHLO na concentração estudada e nos tempos de exposição apresentou potencial para atuar como IE?
4.
OBJ ETIVO GERAL
O objetivo geral deste projeto foi avaliar os efeitos ecotoxicológicos do pesticida Chlorantraniliprole sobre os tecidos de gônadas e fígado de Danio rerio e averiguar se esses biomarcadores indicam uma potencial atuação do referido produto como IE em concentração considerada segura pela literatura, para a proteção da vida aquática.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-Realizar testes de toxicidade crônica com concentração de 0,60µg/L de Chlorantraniliprole considerada segura, segundo literatura;
-Observar as possíveis alterações histológicas de gônadas e fígado de machos e fêmeas de D. rerio após exposições de 14 e de 21 dias ao Chlorantraniliprole.
5.
MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 ORGANISMO –TESTE Danio rerio 5.1.1 Características gerais da espécie
A escolha do organismo-teste Danio rerio (Figura 7) deveu-se a sua facilidade de cultivo, reprodução e adaptação às condições laboratoriais além de ser considerado organismo modelo na área da ecotoxicologia por ter sua biologia amplamente descrita. Trata-se de uma espécie recomendada em normas nacionais (ABNT 15088:2011 e ABNT 15499:2015) e internacionais (OECD, 2010). BERTOLETTI (2009) destaca que a referida espécie apresenta uma sensibilidade à agentes químicos semelhante, ou até maior, quando comparada à espécies de peixes nativas de porte semelhante, justificando-se o seu uso em estudos com substâncias puras.
Figura 7 - Imagens das diferentes fases do desenvolvimento de Danio rerio e de sua morfologia externa e anatomia interna
(A) (B) (C)
(D)
(E)
Fonte: (A, B e C) Acervo pessoal, (D e E) Adaptado de Santariello; Zon, 2012.
Danio rerio é um peixe da família Cyprinidae, Ordem Cypriniformes. É
conhecido popularmente como paulistinha, peixe zebra ou pela comunidade científica
como “zebrafish”. É um peixe tropical, originário dos rios da Índia, Bangladesh e Nepal, é comumente encontrado em águas rasas, paradas ou de baixa movimentação, com vegetação aquática submersa e lodo.
O D. rerio é uma espécie gregária, normalmente encontrada em cardumes de 5 a 20 indivíduos. Normalmente formam cardumes de sexos misturados, comportamento esse inato e hereditário. Embora sejam animais sociais, podem apresentar comportamento agonista, especialmente quando acasalam e durante o estabelecimento de hierarquias de dominância, que ocorrem dentro de cada sexo e entre eles (LAWRENCE, 2007).
O dimorfismo sexual é altamente visível. Os machos são alongados, delgados e levemente dourados, especialmente no abdome e nas nadadeiras peitoral e caudal, e apresentam lista abdominal completa. As fêmeas são robustas, ligeiramente maiores que os machos e prateada, normalmente apresentam o abdome muito inchado devido ao desenvolvimento dos ovos e a lista abdominal é incompleta (DOMINGUES; BERTOLETTI, 2006).
Vivem em águas que podem sofrer grandes variações de temperatura (16-38°C) e pH (5,9-8,5). Alimentam-se de uma ampla variedade de zooplâncton e insetos e, em menor proporção, de algas, detritos e outros materiais orgânicos. É um peixe de hábito tipicamente diurno, mostrando os maiores níveis de atividade durante as primeiras horas da manhã. Dormem frequentemente, embora não exclusivamente, durante a noite. Esse padrão de atividade influi nos processos fisiológicos, bioquímicos e comportamentais no animal, padrão esse que deve ser levado em consideração nos biotérios de criação (CONGEA, 2008).
Quanto à reprodução, uma das características mais importantes do zebrafish, como modelo animal, é sua grande fertilidade. O seu amadurecimento sexual ocorre rapidamente e a reprodução acontece em uma ampla gama de condições, garantindo a produção de milhares de larvas durante o seu curto período de vida. Em condições favoráveis, o zebrafish se reproduz continuamente durante a maturidade sexual (DAMMSKI et al. 2011).
