Incubação a 37° C com 5 % CO2 por
120 horas
Monitoração a cada 24 horas
Preparo da amostra
+
(proporção)
de DMSO
(proporção)
mg das amostras Homogeneização
da amostra
2 mL de meio 1 casal de vermes por poço Placa de 24 poços
Placa com meio
Controle positivo Praziquantel 10 µM
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Fitoquímica
Existem diversos métodos para a análise e identificação de metabólitos secundários conhecidos produzidos em plantas. A análise de misturas complexas é usualmente feita por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), por comparação com os valores de fator de retenção (Rf) de substâncias conhecidas em diferentes sistemas eluentes e pela sua reatividade frente a diferentes reagentes cromogênicos (Fumagali et al., 2008; Van Beek e Van Gessel, 1988).
Para análise quantitativa e também qualitativa, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplada a detector de UV-Vis, principalmente com o detector de arranjo de diodos (DAD) é a técnica mais utilizada (Fumagari et al., 2008; Theodorides et al., 1998). Os trabalhos mais recentes estão empregando a CLAE acoplada a espectrometria de massas na análise qualitativa e quantitativa (Fumagari et al., 2008).
O extrato bruto das partes aéreas foi primeiramente analisado por CLAE-UV-Vis (Figura 10, p. 28), o cromatograma obtido evidenciou a presença de diversas bandas cromatográficas distribuídas por todo o cromatograma e de pelo menos 3 picos mais intensos que de acordo com o detector empregado não significa que estes sejam majoritários em termos de p/p.
Devido a complexidade do extrato bruto, este foi submetido a uma partição líquido-líquido, onde foram obtidas as frações: hexânica, AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica. As
cromatograma com maior resolução, a fração AcOEt bioativa foi selecionada e submetida a uma coluna de Sephadex LH-20 para desta forma obtermos subfrações mais simplificadas.
A subfração 18-20, oriunda da partição AcOEt, foi analisada por CLAE-UV-Viscom fase móvelCH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 1,0 mL/min. e λ 312 nm, e apresentou um perfil cromatográfico promissor (Figura 14, p. 30), isto é, uma boa resolução cromatográfica. Assim, esta subfração foi então purificada por CLAE-preparativa na mesma condição analítica (Figura 15, p. 31).
Figura 10: Cromatograma do Extrato bruto hidroetanólico das folhas de S. camporum.
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 5 10 15
mAU
314nm,4nm (1.00)
17.675 18.144 21.994 23.361 24.864 25.980 27.508 28.109 31.808 33.783
Figura 11: Cromatograma da fração AcOEt de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
Figura 12:Cromatograma da fraçãon-BuOH de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 100 200 300
mAU
314nm,4nm (1.00)
20.195 21.928 23.302 24.840 25.292 26.357 26.894 27.09427.369 27.729 28.09628.291 28.636 28.928 29.334 30.058 31.754 32.542
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 10 20 30 40 50
mAU
314nm,4nm (1.00)
21.993
Figura 13:Cromatograma da fração hidrometanólica de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
Figura 14:Cromatograma analítico da subfração 18-20 (89 mg).
Fase móvel CH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 1,0 mL/min.
e λ 312 nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 5 10
mAU
314nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min
0 25 50 75 100
mV
SPD-20A Ch1:312nm
3.216 5.771 11.977 19.892 21.811 42.541 46.604
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
mV(x100)
SPD-20A Ch1:312nm
7.560 8.297 8.873 10.358 14.202 21.467
Figura 15:Cromatograma preparativo da subfração 18-20 (89 mg).
Fase móvel CH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 9,0 mL/min.
e λ 312 nm.
1 2
4.2. Identificação dos flavonóides isolados
A identificação de flavonóis inicia-se pela análise dos espectros de Ultravioleta, que podem ser adquiridos online pelo uso do detector de Arranjo de Diodos acoplado a CLAE (CLAE-DAD). Em seguida, após isolamento, a RMN de 1H, seguida pelo exame do espectro de13C e pela comparação paralela com os dados de RMN de 13C de flavonóis compilados e publicados por Agrawaal em 1989 permite a caracterização completa destas substâncias.
Figura 16: Estruturas químicas dos flavonóides isolados de S. camporum.
O espectro de ultravioleta de um flavonóide é normalmente determinado em etanol ou em metanol e consiste tipicamente em dois picos de absorção máxima entre 240-285 nm (banda II, devido à absorção do anel A) e 300-550 nm (banda I, devido ao anel B). A posição precisa e as intensidades relativas destes máximos dão uma valiosa informação quanto à natureza do flavonóide e ao seu padrão de oxigenação. O aumento da oxigenação do anel-B dos flavonóis causa um desvio batocromico da banda I por cada grupo oxigenado adicionado. Este efeito pode ser observado no espectro de UV de 1 e 2 que possuem λmax em 370 e 366 nm (Figura 17, p. 34), respectivamente, onde 1
picos, designados de IIa ou IIb, sendo o IIa, o de maior λ, e dependente do padrão de oxigenação do anel B. Por exemplo, os flavonóis 3′ e 4′-oxigenados aparecem com dois grupos de absorção, ou um máximo com um ombro no pico do lado de maior λ, entre 250 e 275 nm, enquanto que os 4′-oxigenados têm apenas um pico (Da Cunha, 2005). Este efeito pode ser observado no espectro de UV de 1 e 2 que possuem λmax em 255 e 264 nm.
A presença desta classe de metabólitos secundários pode ser confirmada também por RMN 1H, de modo geral, são evidenciados pelos sinais em região aromática entre δ 6,00 a 8,00. A integração dos sinais é proporcional ao número de hidrogênios que estas representam e as constantes de acoplamento orto (6,5 - 9,0 Hz) ou meta (1,5 - 2,5 Hz) são de suma importância para estabelecer o padrão de substituição dos anéis aromáticos.
Na seqüência, o espectro de RMN de 13C é importante para a identificação estrutural principalmente pela análise da presença ou ausência de carbonila, que dependendo do tipo estrutural em questão pode apresentar variações significativas de δ. No caso dos flavonóis, o deslocamento químico ocorre entre 171-186 ppm (Agrawaal, 1989).
As atribuições dos sinais de RMN 1H e 13C de1 e 2 encontram-se descritas nas Tabelas 1 e 2 (p. 35 e 36).
Dados de RMN 1H de 1 (Figura 18, p. 37,Tabela 1, p. 35) indicaram a presença de seis sinais, que se encontravam em região com maior deslocamento químico e indicaram a presença de anéis aromáticos. O sinal em δ 7,53 (dd, J= 8,4 e 1,8, 1H) foi atribuído ao H-6′ e os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto e meta com o H-5′ (δ 6,87, d, J= 8,4, 1H) e H-2′ (δ 7,67, d, J= 1,8, 1H) revelando um
identificar a presença de um grupo hidroxila em C-5, o qual participa de uma ligação de hidrogênio intramolecular.
Os dados de RMN 13C (Figura19, p. 38, Tabela2, p. 36) evidenciaram a presença de 15 carbonos sendo um deles uma carbonila em (δ 176,6). Estes dados, quando analisados com os dados de DEPT 135 (Figura 20, p. 39, Tabela 2, p. 36) confirmaram a presença de dez carbonos não hidrogenados e cinco carbonos metínicos. Estes valores de deslocamentos químicos quando comparados com dados de análogos publicados na literatura, sugestionaram que a estrutura básica de 1 seria de um flavonol, neste caso a quercetina (Agrawaal, 1989).
O espectro de RMN 1H de 2 (Figura 21, p. 40. Tabela 1, p. 35) indicou a presença de cinco sinais, que se encontravam em região com maior deslocamento químico e indicaram a presença de anéis aromáticos. O sinal em δ 8,03 (d, J= 8,8, 2H) foi atribuído ao H-2′ e H-6′ os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto com o H-3′ e H-5′ (δ 6,92, d, J= 8,8, 2H) revelando um anel aromático disubstituído. Além dos sinais em δ 6,18 (d, J= 1,8, 1H) e δ6,42 (d, J= 1,8, 1H) evidenciaram a presença de outro anel aromático tetrasubstituído, neste espectro foi possível o cálculo da constante. Aliado, ao singleto largo em δ 12,48 indicando novamente a presença de um grupo hidroxila em C-5, que como em 1, participa de uma ligação de hidrogênio intramolecular em 2.
Os dados de RMN 13C (Figura22, p. 41, Tabela2, p. 36) evidenciaram a presença de 13 carbonos sendo um deles uma carbonila em δ 176,7. Além de apresentar os sinais em 116,3 e 130,3 mais intensos, o que pode indicar a presença de carbonos duplicados, isto é, equivalentes. Os dados do experimento DEPT 135 (Figura 23, p. 42) permitiram inferir que nove carbonos eram não hidrogenados e quatro eram metínicos. Estes dados, quando analisados com os dados de deslocamentos químicos de análogos publicados na
literatura, sugestionaram que a estrutura básica de 2seria do kaempferol (Agrawaal, 1989).
Figura 17: Espectro de ultravioleta do (a) Kaempferol (2) e (b) Quercetina(1).
Tabela 1: Dados de RMN 1H (500 MHz) das substâncias 1 e 2a.
Tabela 2: Dados RMN 13C (125 MHz) das substâncias 1 e 2.
Carbono 1
δ
1*,a δ
2 δ
2*,b δ
C-2 147,6(C) 148,0 147,6(C) 146,8 C-3 136,5(C) 137,2 136,5(C) 135,6 C-4 176,6(C) 177,3 176,7(C) 175,9 C-5 161,5(C) 162,5 161,5 (C) 169,7 C-6 99,0(CH) 99,2 99,1(CH) 98,2 C-7 164,7(C) 165,3 164,8(C) 163,9 C-8 94,2(CH) 94,4 94,3(CH) 93,5 C-9 157,0(C) 158,2 157,0(C) 156,2 C-10 103,8(C) 104,5 103,8 (C) 103,1 C-1' 122,8(C) 124,1 122,5 (C) 121,7 C-2' 115,9(CH) 115,9 130,3 (CH) 129,5 C-3' 145,9(C) 148,7 116,3 (CH) 115,4 C-4' 148,5(C) 146,2 160,0 (C) 159,2 C-5' 116,4(CH) 116,2 116,3 (CH) 115,4 C-6' 120,8(CH) 121,6 130,3 (CH) 129,5
Dados apresentados em δ, DMSO-d6
Multiplicidades atribuídas com base em experimentos do DEPT-135
* Dados da Literatura a em MeOD e b em DMSO-d6
7.6689 7.5405 7.5266 7.5236
6.8854 6.8684 6.3978 6.1767
Figura 19: Espectro de RMN 13C de 1(125 MHz, DMSO-d6).
Figura 21: Espectro de RMN 1H de 2(500 MHz, DMSO-d6).
0.999
1.013
2.102
2.058
1.02112.4808 8.0475 8.0298 6.9287 6.9110 6.4305 6.4274 6.1818 6.1782 3.3685 2.5019 2.4988 8.0475 8.0298 6.9287 6.9110 6.4305 6.4274 6.1818 6.1782
Figura 23: Experimento DEPT 135 de 2(DMSO-d6).
4.3. Atividade inibitória da enzima ciclooxigenase.
Dentre os metabólitos secundários com propriedades inibitórias da COX e também antiinflamatória pode-se destacar os flavonóides. Esta classe de substâncias é bem explorada, há inclusive estudos de relação estrutura atividade (Figura 24, p. 44). A quercetina apresentou atividade significativa devido à presença do padrão catecol no anel B e da hidroxila no anel C.
Entretanto, na luteolina, a falta da hidroxila do anel C,no C-3,não acarreta alteração significativa na atividade inibitória. Contudo, nos outros flavonóides explicitados abaixo, como no caso do kaempferol, foi observado que a falta da hidroxila no anel B,em C-3ʹ, tornou a atividade parcial, enquanto na taxifolina a falta da insaturação entre os C-2 e C-3 ocasionou ausência da atividade antiinflamatória de acordo com artigo de revisão de (Coutinho et al. 2009).
Os extratos e frações de S. camporum inibiram a COX-1 e 2 na concentração de 10 µg/mL (Tabela 3, p. 44). Estes valores podem ser considerados promissores quando comparados com valores obtidos em trabalhos publicados (Bhujade et al., 2012). Os resultados obtidos sugerem atividade inibitória frente as COXs, que são alvos terapêuticos validados para o descobrimento de novos fármacos antiinflamatórios. Deste modo, a fração AcOEt, foi fracionada e resultou no isolamento de 1 e 2 que já foram avaliados frente a inibição das ciclooxigenases e poderiam ser considerados os responsáveis pela atividade apresentada pela fração AcOEt (Coutinho et al.,
Figura 24: Flavonóides com propriedade antiinflamatória e inibitória da COX.
Tabela 3: Atividade inibitória das enzimas COX-1 e COX-2.
aconcentração avaliada: 10 µg/mL;
bconcentração avaliada: 100 µM;
c x ± s
4.4. Atividade sequestradora de radicais livres
A indústria e os pesquisadores têm aumentado consideravelmente seus interesses em plantas que possam funcionar, principalmente, como suplementos alimentares ou como alimentos funcionais, entre outras aplicações. Deste modo, os antioxidantes presentes na dieta são importantes componentes que protegem o corpo humano frente aos radicais livres, como as espécies de oxigênio reativas (Irene et al., 2008).
Dentro deste contexto, a atividade sequestradora de radicais livres não deve ser considerada como sinônimo de atividade antioxidante, porem é um fato que os mais poderosos antioxidantes naturais, como o ácido rosmarínico, tocoferol, carnosol e ácido ascórbico (Figura 25, p. 46) são também fortes sequestradores de radicais livres. Uma boa atividade neste ensaio é um bom indicativo da presença de possíveis antioxidantes (Dapkevicius et al.,2002).
Como exemplo de substâncias naturais com atividade antioxidante, tem-se os flavonóides, que estão explicitadas na Figura 25 (p. 46). Em estudo realizado com esta classe de metabólitos, observou-se que estes apresentam capacidade de sequestrar radicais livrese que a presença do grupo catecol no anel B melhora ainda mais a capacidade sequestradora de radicais livres destas substâncias (Cotelle et al., 1996).
O extrato bruto e frações AcOEt e n-BuOH apresentaram atividade antioxidante moderada quando comparados com o padrão ácido gálico (IC50=
destacar que da fração AcOEt foram isolados os flavonóides quercetina e kaempeferol que são consagrados na literatura por seqüestrarem o radical livre estável DPPH.
.
Figura25: Substâncias com atividade sequestradora de radicais livres.
O
Tabela 4: Atividade sequestradora de radicais DPPH
* IC50 (concentração efetiva na qual 50% dos radicais DPPH são seqüestrados, µg/mL)
Amostras DPPH
IC50 (µg/mL)* Ex. EtOH 13,0 Fr. hexânica > 66,7
Fr. AcOEt 29,8 Fr. n-BuOH 13,7 Ac. gálico < 1.6
4.5. Atividade esquistossomicida
Figura 26: Flavonóides avaliados frente aos vermes adultos de S. mansoni.
O ensaio esquistossomicida está descrito na Tabela 6 (p. 51), os pares de vermes adultos incubados com o extrato hidroetanólico de S. camporum e com as frações AcOEt, hexânica e n-BuOH a concentração de 100 µg/mL causaram diminuição na atividade motora e separação dos casais. Apenas o extrato bruto e a fração hexânica causaram a morte dos parasitas (25%) e extensiva alteração no tegumento dos vermes adultos de S. mansoni.
Considerando a atividade esquistossomicida das substâncias isoladas neste trabalho (Tabela 5, p. 51. Figura 26, p. 48), os vermes incubados com o flavonóide 1 (100 µM) apresentaram diminuição moderada da atividade motora, sem alterações no tegumento. Por outro lado, a substância2(100 µM) não causou alteração no tegumento e nem redução da atividade motora. A substância2 foi capaz de separar os vermes adultos em machos e fêmeas (100%) sendo isto um caráter importante porque a separação evita a conjugação, a ovoposição e posterior aumento da quantidade dos mesmos; a separação ocorreu a 24 h. Os flavonóides isolados foram também testados nas concentrações de 10, 25, 50, 100 e 200 µM, deste modo foi possível obter o
cálculo do valor de IC50 da separação dos casais de S. mansoni. A substância2 apresentou valor de IC50 de 25,0 µM a 120 h em relação a separação dos casais de S. mansoni. Entretanto, apenas o flavonóide 2 foi capaz de causar 25% de morte dos vermes a 100 µM a 120 h. A aparência e atividade motora dos vermes no grupo DMSO 1% foram idênticas ao grupo controle negativo.
Nestes grupos, morte, separação e diminuição na atividade motora ou alteração extensiva no tegumento não foram observadas. PZQ (10 µM) foi utilizado como controle positivo, e causou morte nos parasitas e alteração no tegumento sem separação dos casais. A DL50 para o PZQ foi determinada como 0,54 ± 0,02 µM.
Os flavonóides 1e 2 são análogos estruturais: ambos possuem uma porção flavonol e diferem em termos da presença de duas hidroxilas em C-3’ e C-4’ em 1. Assim, com base nos dados obtidos, pode-se concluir que a presença de uma hidroxila adicional culminou em apenas uma diminuição moderada da atividade motora, sem nenhuma influência na separação e morte dos casais. No caso da substância 2, que contém apenas uma hidroxila em C-4’, esta foi capaz de separar os vermes adultos e causar a morte em 25% dos vermes.
O mecanismo pelo qual estes derivados, principalmente, 2, exercem seu efeito esquistossomicida in vitro não é claro. Entretanto, a quercetina (1) foi identificada como um inibidor seletivo da enzima S. mansoni NAD+ (SmNACE), que está localizada no tegumento do parasita adulto (superfície externa).
antiparasitárias, os flavonóis possuem atividade antimalárica (Kaur et al., 2009). E, 1 exibiu efeito pronunciado frente as cepas de Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina (NF-54) e inibiram a proteína P. falciparum enoil-ACP-redutase (FabI) (Gupta et al., 2010).
Tabela 5. Efeitos in vitro do extrato bruto e fraçõesde S. camporum e dos flavonóides isoladosfrente aos vermes adultos de S. mansoni.
aRPMI 1640
bConcentração testada 10 µM
c Concentração testada 100 µg/mL
dConcentração testada 100 µM
Grupo Período de
5 CONCLUSÕES
A partir do estudo fitoquímico das folhas de S. camporum foi possível isolar da fração AcOEt bioativa duas substâncias.
Os flavonóides, quercetina e kaempferol, foram identificados por RMN
1H,13C e DEPT, e estão sendo descritos pela primeira vez na espécie.
As frações parciais obtidas na partição líquido-líquido inibiram a COX-1 e 2 na concentração de 10 µg/mL e apresentaram atividade antioxidante moderada, menos a fração hexânica que foi inativa.
Os pares de vermes adultos incubados com as frações AcOEt, hexânica e n-BuOH, na concentração de 100 µg/mL, causaram diminuição na atividade motora e separação dos casais. Apenas a fração hexânica causou a morte dos parasitas (14,3 %) e extensiva alteração no tegumento dos vermes adultos.
Os vermes incubados com 1 (100 µM) apresentaram diminuição moderada da atividade motora, sem alterações no tegumento. O flavonóide 2 apresentou valor de IC50 de 25,0 a 120 h em relação a separação dos casais de S. mansoni, respectivamente. Entretanto, apenas o flavonóide 2 foi capaz de causar 25% de morte dos vermes a 100 µM a 120 h.
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