UNIVERSIDADE DE FRANCA
Estudo fitoquímico de Styrax camporum Pohl (Styracaceae) e avaliação das atividades
esquistossomicida, inibitória da enzima ciclooxigenase e sequestradora de radicais livres
FRANCA
2012
CAIO GUEDES BRAGUINE
Estudo fitoquímico de Styrax camporum Pohl (Styracaceae) e avaliação das atividades
esquistossomicida, inibitória da enzima ciclooxigenase e sequestradora de radicais livres
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Química biológica
Orientadora: Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti.
CAIO GUEDES BRAGUINE
Estudo fitoquímico de Styrax camporum Pohl (Styracaceae) e avaliação das atividades esquistossomicida, inibitória da
enzima ciclooxigenase e sequestradora de radicais livres
COMISSÃO JULGADORA DO PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS
Presidente: _______________________________________
Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti Instituição: Universidade de Franca
Titular 1:________________________________________
Profa. Dra. Janaína Fernanda Gonçalves Instituição: Faculdade São Luís
Titular 2: _________________________________________
Prof. Dr. Denise Crispim Tavares Instituição: Universidade de Franca
Franca, 23/05/2012
DEDICATÓRIA
Primeiramente dedico este trabalho à minha mãe Fátima, que sempre me apoiou e esteve comigo em todos os momentos bons e ruins, sempre com muita compreensão, paciência, amor e carinho.
Dedico também à minha orientadora, Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti, que sempre esteve ao meu lado, me dando oportunidades e ensinando-me sempre com muita paciência.
À minha irmã Patrícia, pelo amor e carinho.
À minha namorada Adriana, pelo companheirismo, paciência no término de um dos capítulos importantes de minha vida.
E por último, mas não menos importante, à Maria Antônia, filha de minha orientadora, que nasceu recentemente, com muita saúde, para iluminar e alegrar a todos nós.
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R 1 O H
(3) O H (4) H
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2
5 7
4 ´
3 ´
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Primeiramente à Deus, que sempre esteve ao meu lado, me iluminando mesmo quando não pude enxergar com clareza.
A minha orientadora Profa. Dra. Patrícia Mendonça Pauletti, pela orientação, confiança, “puxões de orelha” quando necessário, pela amizade e incentivo.
Aos professores e pesquisadores: Sérgio, Vladimir, Müller, Kátia, Wilson, Callefi, Nassar, Emerson, Denise, Lucas, Ana Helena, Rodrigo, Omar, Lizandra,a todos pelos ensinamentos passados, conversas, e ajuda no crescimento profissional e pessoal.
Àqueles companheiros, colegas ou ex-colegas de laboratório: Alex, Alexandre, Diego, Thiago, “Carois”, “Camilas”, Fukui (Japa), Bira, Ju, Rodriguinho, Maisa, Bruno, Marcela, Marilha (pelas infames piadas), Igor, Marcos, Karem, Fred, Aline, Ricci e a todos àqueles que não me recordei do nome, mas sabem que estão implícitos aqui.
Aos componentes da banca por darem a oportunidade de melhorar meu trabalho.
À FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) pela qual, seria praticamente impossível meu início, manutenção, término e aprendizado de todo período desde a iniciação científica até agora no mestrado (Processo no 2009/11499-0).
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R 1 O H
(3) O H (4) H
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2
5 7
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SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ... II LISTA DE FIGURAS ... III LISTA DE ESQUEMAS ... IV LISTA DE TABELAS ... V RESUMO... VI ABSTRACT ... VII
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ... 1
1.1 O gênero Styrax... 1
1.2 Styrax camporum Pohl ... 6
1.3 Inflamação e a ciclooxigenase ... 8
1.4 Atividade seqüestradora de radicais livres ... 11
1.5 Esquistossomose... 13
2 OBJETIVOS ... 17
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 18
3.1 Especificação dos materiais, instrumentos e técnicas utilizadas ... 18
3.2 Material Vegetal ... 19
3.3 Estudo fitoquímico ... 20
3.4 Ensaio espectrofotométrico de COX- humana recombinante ... 22
3.5 DPPH (1,1-difenil -2-picril-hidrazila) ... 23
3.6 Ensaio da Atividade Esquistossomicida ... 24
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 27
4.1 Fitoquímica ... 27
4.2 Identificação dos flavonóides isolados ... 32
4.3 Atividade inibitória da enzima ciclooxigenase ... .... 43
4.4 Atividade sequestradora de radicais livres ... .... 45
4.5 Atividade Esquistossomicida ... 48
5 CONCLUSÕES ... 51
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 52
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AA Ácido Araquidônico
AcOEt Acetato de Etila
CCDC Cromatografia em Camada Delgada Comparativa CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
COX Ciclooxigenase
DCM Diclorometano
DEPT Distortion Enhancement by Polarization Transfer
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO–d6 Dimetilsulfóxido deuterado DPPH 1,1-difenil -2-picril-hidrazila
EtOH Etanol
GPNUF Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais da UNIFRAN
IL-1 Interleucina 1
iNOS óxido sintase induzível
HÁc Ácido Acético
Hex. n-Hexano
LDL Lipoproteína de Baixa Densidade
LE Luis Evangelista
MeOH Metanol
n-BuOH Álcool n-butílico
ODS Octadecilsilano
PG Prostaglandina
RMN 1 H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN ¹³C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
tR Tempo de Retenção
TNF-α Fator de necrose tumoral
UV-Vis Ultravioleta Visível
RPMI Roswell Park Memorial Institute medium
IC50 Concentração Inibitória de 50%
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Substâncias isoladas de espécies de Styrax ---2 e 3
Figura 2:Esqueletos básicos de flavonóides---5
Figura 3: Styrax camporum Pohl---7
Figura 4: Reações catalisadas pela COX e inibidores da COX---10
Figura 5:Ensaio DPPH---12
Figura 6: Ciclo de vida deS. mansoni.---14
Figura 7:Casal de vermes adultos de S. mansoni.---14
Figura 8:Praziquantel e oxamniquina ---15
Figura 9:Estruturas químicas de substâncias isoladas de espécies vegetais com propriedades biológicas---16
Figura 10:Cromatograma do Extrato bruto hidroetanólico das folhas de S. camporum---28
Figura 11:Cromatograma da fração AcOEt de S. camporum---29
Figura 12:Cromatograma da fraçãon-BuOH de S. camporum---29
Figura 13:Cromatograma da fração hidrometanólica de S. camporum---30
Figura 14:Cromatograma analítico da subfração 18-20 (89 mg). ---30
Figura 15:Cromatograma analítico da subfração 18-20 (89 mg).---31
Figura 16: Estruturas químicas dos flavonóides isolados de S. camporum----32
Figura 17:Espectro de ultravioleta do (a) kaepferol (b) quercetina---34
Figura 18:Espectro de RMN 1H de 1(500 MHz, DMSO-d6)--- ---37
Figura 19:Espectro de RMN 13C de 1(125 MHz, DMSO-d6)---38
Figura 20:Experimento DEPT 135 de 1(DMSO-d6)---39
Figura 21: Espectro de RMN 1H de 2 (500 MHz, DMSO-d6)---40
Figura 22:Espectro de RMN 13C de 2(125 MHz, DMSO-d6)---41
Figura 23:Experimento DEPT 135 de 2(DMSO-d6)---42
Figura 24:Flavonóides com propriedades antiinflamatória e inibitória da COX ---44
Figura 25: Substâncias com atividade sequestradora de radicais livres---46
Figura 26: Flavonóides avaliados frente aos vermes adultos de S. mansoni--48
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Partição líquido-líquido do extrato bruto---20
Esquema 2: Estudo da fração AcOEt---21
Esquema 3: Estudo da fração 18-20---21
Esquema 4: Ensaio frente a enzima COX-1 e COX-2---22
Esquema 5: Ensaio com o radical DPPH---23
Esquema 6: Desenvolvimento do ensaio esquistossomicida---26
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados de RMN 1H (500 MHz) das substâncias 1 e 2---35
Tabela 2:Dados RMN 13C (125 MHz) das substâncias 1 e 2---36
Tabela 3: Atividade inibitória das enzimas COX-1 e COX-2---44
Tabela 4: Atividade seqüestradora de radicais DPPH---47
Tabela 5: Efeitos in vitro do extrato bruto e fraçõesde S. camporum e dos flavonóides isolados frente aos vermes adultos de S. mansoni---51
RESUMO
BRAGUINE, Caio Guedes. Estudo fitoquímico de Styrax camporumPohl (Styracaceae) e avaliação das atividades esquistossomicida, inibitória da enzima ciclooxigenase e sequestradora de radicais livres. 2012. 59 f.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca.
A espécie Styrax camporum Pohl, conhecida popularmente como
"estoraque do campo", "cuia de brejo" e "benjoeiro'' é utilizada na medicina popular no tratamento de doenças gastroduodenais.O presente trabalho teve como objetivos à identificação de substâncias naturais a partir do extrato das folhas de S. camporum e a avaliaçãodas atividades esquistossomicida, inibitória da enzima COX e sequestradora de radicais livres. O estudo fitoquímico da fração AcOEt bioativa, obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato, por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, resultou no isolamento de dois flavonóides,a quercetina (1) eo kaempferol(2), que estão sendo descritos pela primeira vez na espécie. As frações parciais obtidas na partição líquido-líquido inibiram a COX-1 e 2 na concentração de 10 µg/mL e apresentaram atividade antioxidante moderada.Os pares de vermes adultos incubados com as frações AcOEt, hexânica e n-BuOH,na concentração de 100 µg/mL, causaram diminuição na atividade motora e separação dos casais. Apenas a fração hexânica causou a morte dos parasitas (25 %) e extensiva alteração no tegumento dos vermes adultos. Considerando a atividade esquistossomicida dos flavonóides isolados neste trabalho e de S. pohlii, os vermes incubados com1 (100 µM) apresentaram diminuição moderada da atividade motora, sem alterações no tegumento. O flavonóide 2 apresentou valor de IC50 de 25,0 a 120 h em relação a separação dos casais de S. mansoni, respectivamente.
Entretanto, apenas o flavonóide 2 foi capaz de causar 25% de morte dos vermes a 100 µM a 120 h.
ABSTRACT
BRAGUINE, Caio Guedes. Phytochemistry study of Styrax camporumPohl (Styracaceae) and evaluation of schistosomicidal, ciclooxygenase inhibitory and radical scavenging activities. 2012. 59 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de Franca, Franca.
The species Styrax camporum Pohl, popularly known as "estoraque do campo", "cuia de brejo" and "benjoeiro'', is used in folk medicine to treat gastrointestinal diseases. This study aimed to identify natural compounds from the extract of S. camporum and evaluateschistosomicidal, COX inhibition, and radical scavenging activities. The phytochemical study of the bioactive EtOAc fraction, obtained from the crude extract liquid-liquid partition, by High Performance Liquid Chromatography, resulted in the isolation of two flavonoids, quercetin (1) and kaempferol (2), which were described for the first time in S.
camporum. The partial fractions obtained in the liquid-liquid partition inhibit COX-1 and 2 at a concentration of 10 µg/ml and showed moderate antioxidant activity. The pairs of adult worms incubated with the fractions AcOEt, n-BuOH and n-hexane at a concentration of 100 µg/mL, caused a decrease in motor activity and separation of couples. Only the n-hexane fraction caused death of the parasites (25 %) and extensive changes in the adult worms tegument.
Considering the antischistosomal activity of flavonoids isolated in this work, worms incubated with 1 (100 µM) had a moderate decreasein motor activity, without changes in the tegument. Flavonoid2 showed IC50 values of S.
mansonicouple separation of 25.0 µM at 120 h. However, only the flavonoid 2 was capable of causing death of 25% of the worms at 100 µM at 120 h.
Key words: Styrax camporum, Styracaceae, radical scavenging activity, DPPH, cyclooxygenase inhibition, schistosomicidal activity, flavonoids.
1.CONSIDERAÇÕES INICIAIS 1.1. O gênero Styrax
O gênero Styrax pertence à família Styracaceae e compreende cerca de 160 espécies (Cronquist, 1981; Fritsch et al., 2001). Este gênero é considerado o maior dentro da família, sendo constituído por 130 espécies, o que corresponde à 80% do número total de espécies da família Styracaceae. Este gênero é largamente distribuído, podendo ser encontrado no sudoeste da Ásia, na região mediterrânea e no continente americano (Fritsch et al., 2001).
O gênero é também bastante conhecido pela produção de um material resinoso chamado resina de benjoim, que é secretado quando objetos cortantes ferem a casca da árvore. Este material é rico em ácido benzóico, sendo assim, utilizado em indústrias de perfumaria e cosmético. Na medicina tradicional é empregado sob a forma de tintura como antisséptico tópico, expectorante por via oral e para moléstias respiratórias como inalante (Costa, 1996).
De acordo com Pauletti et al. (2006), o perfil químico do gênero é composto porsaponinas (1-4), triterpenos (5-6),lignanas (7-11) e compostos fenólicos (12-14) (Pauletti et al., 2006) (Figura 1, p. 2 e 3).
As lignanas benzofurânicas, comumente encontradas neste gênero, egonol (7) e homoegonol (8) (Figura 1, p. 2 e 3), inibiram o crescimento de Staphylococus aureus, Candida albicans e de Cladosporium cladosporioides (Pauletti et al., 2000). E, 7 e 8, foram isoladas também de Styrax camporum Pohl e apresentaram atividade citotóxica
cancerígenas (Hirano et al., 1994; Li et al., 2005). Em outro trabalho, 8inibiu a atividade hemolítica do sistema complemento com IC50 33 µM, sendo este resultado importante na terapia das doenças inflamatórias (Min et al., 2004a).
Outros estudos, com espécies deste gênero, evidenciaram saponinas com propriedades fungicida e hemolítica, triterpenos de esqueleto oleano, com atividade citotóxica em células tumorais, lignanas com fraca atividade antioxidante e atividade preventiva do envelhecimento da pele (Zehavi et al., 1986; Segal et al., 1966; Kim et al., 2004a e b; Wang et al., 2006; Min et al., 2004b; Kakie et al., 1994).
OR1
OR2
OH
O
O
O O
OH
OH OH OH OH
CH2OH
O OH
COOH
O
O
O
CH2OH
OH OH
OH
OR3
Jegosaponin A: R1= R2= Ac R3=H Jegosaponin B: R1= R2= H R3=Ac Jegosaponin C: R1= H R2= R3=Ac Jegosaponin D: R1= R2= H R3=H
R2
R3 R1
R1= H R2= OH R3= CH2OH R1= OH R2= coumaroil R3= COOH
Figura 1: Substâncias isoladas de espécies de Styrax.
1
3 4 2
5 Eritrodiol
6 Ácido 3-β-o-trans-p-coumaroil maslinico
OR2
OR3 OCH3
O H
O
7 -CH2- Egonol 8 CH3 CH3 Homoegonol
R2 R3
O O O
O O
O H
OCH3
O O
H OCH3
OH OCH3
OH
O H3CO
O H
OH
OH
OCH3
OH O
R1 R1 R2 12 ácido p-hidroxibenzóico OH H 13 ácido gálico OH OH
9 Styraxin
10 Álcool diidrodeidrodiconiferil
11 Lariceresinol
Os flavonóides (Figura 2, p. 5) são produtos naturais de ampla distribuição nos vegetais e também foram detectados em espécies de Styrax (Martens e Mithofer, 2005;
Pauletti et al., 2006). Eles protegem as plantas contra a radiação ultra-violeta (UV) (Mizutani et. al., 2008), atraem insetos para polinização (Pichersky e Gang, 2000) e participam das interações com os microorganismos do solo (Spaink,1995).
A maioria dos benefícios de saúde, relacionados a flavonóide são atribuidos às suas propriedades antioxidantes. São conhecidos comumente por apresentarem a capacidade de inibir a oxidação da LDL (Lipoproteína de Baixa Densidade), e também demonstram efeitos únicos de proteção cardíaca (Kondo et al., 1996; Mazur et al., 1999).
Dietas ricas em flavonóides mostram redução de dano pós-isquêmico do miocárdio em ratos. Estudos indicaram que em humanos com uma dieta com frutos ricos em flavonóides houve diminuição da mortalidade ocasionada por problemas na artéria coronária (infarto) em homens idosos, e também houve redução de 38% do risco de doenças coronárias em mulheres pós-menopausa(Kondo et al., 1996).
Diversas atividades biológicas são atribuídas a essa classe de polifenóis, tais como atividade antitumoral, antioxidante, antiviral e anti-inflamatória, dentre outras, (Middleton et al., 2000; Havsteen, 2002; Veitch e Grayer 2008; Cazarolli et al., 2008). A diversidade estrutural dos flavonóides pode ser atribuída ao nível de oxidação e às variações no esqueleto carbônico básico, promovidas por reações de alquilação, glicosilação ou oligomerização (Tahara, 2007).
Os flavonóides podem ser encontrados como agliconas ou sob a forma de glicosídeos e/ou derivados metilados e/ou acilados (Harvsteen, 2002; Veitch e Grayer, 2008). As modificações no anel central dessas substâncias levam à diferenciação em subclasses distintas, tais como: chalconas,flavanonas, flavanonóis, flavonas, flavonóis, isoflavonas, flavan-3-ols e antocianidinas(Veitch e Grayer 2008; Boots et al., 2008) (Figura2, p. 5).
Em relação à atividade antiinflamatória, os flavonóides atuam modulando células envolvidas com a inflamação (por exemplo, inibindo o recrutamento de leucócitos), inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNF-α e IL-1), modulando a atividade das enzimas da via do ácido araquidônico, tais como fosfolipase A2, ciclooxigenase e lipo-oxigenase, além de modularem a enzima formadora de óxido nítrico, a óxido nítrico sintase induzida (iNOS) (López-Posadaset al., 2008; Middleton et al., 2000; Havsteen, 2002; Biesalski, 2007).
Figura 2: Esqueletos básicos de flavonoides.
OH
O
O
O
O
O
O
O OH
O
O
OH
O
O
O OH
O
Chalcona Flavanona
Flavanonol Flavona Flavonol Isoflavona
Flavan-3-ol Antocianidina
1.2. Styrax camporum Pohl
A espécie Styrax camporum Pohl (Figura 3, p. 7), conhecida como "estoraque do campo", "cuia de brejo" e "benjoeiro''. A árvore adulta pode atingir uma altura média de 6- 10 m e diâmetro do tronco de 30-40 cm. No Brasil, ocorre nos cerrados de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso do Sul e Paraná na floresta semidecídua da bacia do Paraná.
Esta espécie é amplamente utilizada na medicina popular no tratamento de doenças gastroduodenais, e teve seu potencial antiulcerativo e toxicidade avaliados(Lorenzi, 2000).
Estudos realizados utilizando a administração oral de extrato seco dos galhos (70%
etanol) de S. camporum em ratos durante 30 dias, diminuiu o tamanho da úlcera induzida por ácido acético e o volume da secreção ácida, e aumentou o número de fibras colágenas, assim foi proposto que a fração AcOEt era responsável pela atividade antiúlcera. Este estudo, realizado por Bacchi e colaboradores, confirmou o uso do extrato hidroalcóolico desta espécie na medicina popular, no tratamento de doenças gastroduodenais (Bacchi e Sertié, 1994, Bacchi et al., 1995).
Em trabalho realizado pelo nosso grupo de pesquisa, o extrato seco etanólico (70%) dos galhos não apresentou efeito mutagênico ou citotóxico, mas sim, tendência antimutagênica quando avaliado em células de sangue periférico de camundongos Swiss por meio do teste de micronúcleo (Corrêa et al., 2009).
Figura 3: Styrax camporum Pohl.
[Fonte: http://www.kew.org/science/tropamerica/neotropikey/families/Styracaceae.htm].
1.3. Inflamação e a ciclooxigenase
A inflamação é uma resposta imunológica inata protetora e desencadeada pela liberação de mediadores químicos originados nos tecidos lesados e nas células migratórias contra o dano tecidual causado por trauma físico, substâncias químicas nocivas ou agentes microbiológicos. Isto representa o esforço do organismo no sentido de inativar ou destruir microrganismos invasores, remover substâncias irritantes e iniciar o estágio de reparação tecidual, quando a cura se completa, normalmente o processo inflamatório desaparece. Entretanto, por vezes é originada de um agente inóculo, como o pólen, ou por uma resposta autoimune, como na asma ou artrite reumatóide (Harvey &
Champe, 1998).
A Ciclooxigenase (COX), também denominada prostaglandina H sintase (PGHS), é uma enzima chave neste processo, e catalisa a reação de conversão do ácido araquidônico (AA) em prostaglandinas (PGs), lipídeos bioativos que estão envolvidos em vários processos patofisiológicos (Smith et al., 2000). Apresenta dois sítios catalíticos: o sítio ciclooxigenase e o sítio peroxidase, o primeiro converte o AA no hidroperóxido prostaglandina G2 (PGG2) que por sua vez é reduzido, pelo sítio peroxidase intermediário instável, o álcool PGH2 (Figura 4, p. 10) (Tam et al., 1995). Os fármacos aspirina e iburpofeno são antiinflamatórios que inibem a COX.
Duas isoformas homólogas desta enzima foram identificadas, COX-1 e COX-2, as quais diferem na expressão, função e estrutura (Appleby et al., 1994). A COX-1 é constitutivamente expressa na maioria dos tecidos envolvidos na regulação das funções fisiológicas, agindo como citoprotetora gástrica e mantenedorada homeostase renal e plaquetária, o que evidencia a importância de inibidores de COX-1 como agentes cardioprotetores. Diante de quadros inflamatórios, a atividade desta isoforma não parece ser alterada ou apresenta um aumento discreto de 2 a 4 vezes na sua expressão. Em
contraste, a COX-2 encontra-se em menores quantidades em determinados tecidos como cérebro, intestinos, rins, testículos, glândula tireóide e pâncreas, porém, sua expressão é aumentada na inflamação em cerca de 20 vezes ou mais, em resposta ao estímulo pró- inflamatório como: citocinas, fatores de crescimento, agentes promotores de tumores e endotoxinas bacterianas, sugerindo sua relevância no tratamento do câncer de mama e coloretal dos processos inflamatórios e das Doenças de Alzheimer e Parkinson (Gavarito et al., 2002; Smith et al., 1996; Hoffman, 2000; Marnett e DuBois, 2002).
COO-
Fosfolipídio contendo araquidonato Lisofosfolipídio fosfolipase A2
Araquidonato, 20:4 5,8,11,14
Ciclooxigenase 2 O2
OOH
COO
PGG2
Ciclooxigenase atividade peroxidase
O
O
OH
COO O
O
PGH2
Outras prostaglandinas Tromboxanos
Aspirina Ibuprofeno
O
OH O
O
aspirina
O HO
ibuprofeno
Figura 4: Reações catalisadas pela COX e inibidores da COX.
Fonte:Principles of Biochemistry, Lehninger.
1.4. Atividade sequestradora de radicais livres
Os radicais livres do nosso organismo estão envolvidos com o processo de oxidação, que se relaciona à perda de um ou mais elétrons para outra substância e o procedimento inverso pode ser considerado como redução (Larson, 1997). A transferência de elétrons é um dos processos químicos mais fundamentais para a sobrevivência das células. O efeito colateral dessa dependência é a produção de radicais livres e outras espécies reativas de oxigênio (ERO) que podem causar dano oxidativo.
Radicais livres são átomos ou moléculas produzidos continuamente durante os processos metabólicos e atuam como mediadores para a transferência de elétrons em várias reações bioquímicas, desempenhando funções relevantes ao metabolismo (Bae et al., 1999). As principais fontes de radicais livres são as organelas citoplasmáticas (mitocôndias, ribossomos, lisossomos, etc.) que metabolizam oxigênio, nitrogênio e cloro, gerando grande quantidade de metabólitos (Shami et al.,2004).
ROS é um termo bastante amplo que abrange não somente radicais de oxigênio como radical hidroxila (●OH), óxido nítrico (NO●) e radical superóxido (O2●-
), mas também derivados de oxigênio que não são radicais, como peróxido de hidrogênio (H2O2), ácido hipocloroso (HOCl), ozônio (O3) e oxigênio singlete (1O2)2(Berra et al., 2006).
Estes radicais possuem diferentes papéis no organismo e encontram-se envolvidos na produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes (Shami et al., 2004).
Entretanto, seu excesso apresenta efeitos deletérios, tais como danos ao DNA, proteínas e organelas celulares, como mitocôndrias e membranas, provocando alterações na
A molécula de DPPH (Figura 5, p. 12) é caracterizada como um radical livre estável em virtude da deslocalização do elétron desemparelhado por toda a estrutura química.
Esta deslocalização confere a esta molécula uma coloração violeta, caracterizada por uma banda de absorção em etanol em cerca de 520 nm (Molyneux, 2004). Este ensaio se baseia na medida da capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH, reduzindo-o a hidrazina. Quando uma determinada substância que age como doador de átomos de hidrogênio é adicionada a uma solução de DPPH, a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de violeta a amarelo pálido (Figura 5, p. 12). Esta habilidade foi primeiramente avaliada espectroscopicamente por ressonância de elétron spin (RES), uma vez que a intensidade do sinal do radical DPPH é inversamente relacionada com a concentração do antioxidante testado e o tempo de reação (Chen et al., 2000). Entretanto, o método de controle mais utilizado é o decaimento da absorbância no comprimento de onda observado entre 515 a 528 nm, produzido pela adição do antioxidante a uma solução alcoólica do radical DPPH. Este método é considerado, do ponto de vista metodológico, um dos mais fáceis, precisos e reprodutivos na avaliação da atividade antioxidante de sucos de frutas, extratos vegetais e substâncias puras, tais como flavonóides e terpenóides (Szabo et al., 2007).
DPPH λ 517nm (lilás) (DPPH)H (amarelo)
Figura 5: Ensaio DPPH.
N N
NO2
O2N
NO2
N NH
NO2 O2N
NO2
antioxidante
R-H
1.5. Esquistossomose
As esquistossomíases, denominadas também esquistossomoses ou bilharzioses, são doenças produzidas por trematódeos do gênero Schistossoma, dentre os quais possuem variações de espécies de acordo com cada região (Rey, 2008).
De acordo com a OMS (Organização Mundial de Saúde), estima-se no mundo, que o número de pessoas infectadas é entre 150 a 200 milhões sendo que mais de 600 milhões de pessoas vivem em áreas de risco de infecção em áreas tropicais e subtropicais do mundo (Utzingeret al., 2003). No Brasil, estima-se 6 milhões de brasileiros contaminados por S. mansoni, vulgarmente conhecido também como barriga d`água, xistose ou “doença dos caramujos”, onde a gravidade da doença também é dependente geralmente da carga parasitária (Rey, 2008). Tal quadro constitui sério problema de saúde pública, sendo a esquistossomose a segunda maior endemia parasitária do mundo depois da malária (Engelset al., 2002).
A definição “doença dos caramujos” não é por acaso, ela explicita o hospedeiro intermediário ou vetor que ocorre aqui no Brasil cujo gênero é Biomphalaria (Rey, 2008).
Portanto, pelo elevado número de pessoas infectadas, deve ser visto como um estímulo imperativo para que o governo e a comunidade científica dos países em desenvolvimento, como o Brasil, possam buscar novas medidas e fármacos para complementar a quimioterapia existente (Burlandy-Soares et al., 2003).
A doença se inicia pelas fezes contaminadas (de vertebrados) (Figura 6, p.
14)com ovos do S. mansoni, que entram em contato com a água corrente ou parada,
hospedeiro (vertebrado), transformam-se em esquistossômulo e depois evoluem para vermes adultos (Figura 7, p. 14) (Rey, 2008).
Os fármacos utilizados atualmente contra os vermes adultos de S. mansoni são praziquantel e oxamniquina, sendo explicitados na (Figura8, p. 15)(da Silva et al., 1981).
Figura 6: Ciclo de vida deS. mansoni. [Fonte: www.cve.saude.sp.gov.br]
Figura 7: Casal devermes adultos de S. mansoni. [Fonte: www.portalsaofrancisco.com.br]
Figura8: Praziquantel e oxamniquina.
Dentro deste panorama, o Grupo de Pesquisa em Produtos Naturais UNIFRAN (GPNUF), vem investindo esforços em projetos de pesquisa financiados pela FAPESP e voltados para a avaliação da atividade esquistossomicida, inibitória da enzima ciclooxigenase e sequestradora de radicais livres de substâncias de origem natural (Figura 9, p. 16) que resultaram em vários artigos científicos publicados, aceitos e submetidos (Braguine et al., 2009; Magalhães et al., 2009; Magalhães et al., 2010;
Bertanha et al., 2010; Bertanha et al., 2012). Desta forma, considerando estes resultados promissores, faz-se necessário o prosseguimento dos trabalhos, sendo imprescindíveis estudos adicionais de avaliação destas atividades com outras substâncias bioativas, de outras espécies vegetais.
N
N O
O
N H HO
O
2N
HN
Praziquantel Oxamniquina
O O H3CO
HO
OCH3
OH
O
R2O OR1
O OH OR3
O
1
8 CH3 H H H 9 H H H H 10 H CH3 CH3 H 11 H CH3 H H R4O
R1 R2 R3 R4 OH
OH H3CO
O O
OH HO
6 7
5 R1 R2
2 OH H 3 OH OH 4 H H
R1
HO R2
OH
O O OH
HO OH
O O
OH
OH
OR2
OR3 OCH3
OR1
O
R1 R2 R3 7 H -CH2- 7a CH3CO -CH2- 8 H CH3 CH3 8a CH3CO CH3 CH3 26 6-O-(β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopyranosil CH3 CH3 27 β-D-glicopiranosil CH3 CH3 28 6-O-(β-D-glicopiranosil)-β-D-glicopiranosil -CH2-
Figura 9:Estruturas químicas de substâncias isoladas de espécies vegetais com propriedades biológicas.
15 Curcumina
16 Ácido protocatecuico 17 Ácido galico
18 Ácido p-hidroxibenzóico 19 Ácido 5-O-caffeoil chiquimico
20 Ácido desaspidinol 21 Ácido filicinico
Aspidina Ácido flavaspidico Metileno-bis-aspidinol Desaspidina
22 23 24 25
Egonol
Egonol acetilado
Homoegonol gentiobiosideo Homoegonol glicosídeo Egonol glicosídeo
Homoegonol
Homoegonol acetilado
2. OBJETIVOS
São objetivos do presente trabalho:
i. Obtenção do extrato bruto das folhas de S. camporum em etanol-água (7:3, v/v).
ii. Avaliação in vitro das atividades esquistossomicida, inibitória da enzima COX e sequestradora de radicais livres do extrato bruto das partes aéreas de S. camporum e frações parciais.
iii. Isolamento das substâncias majoritárias presentes na fração bioativa.
iv. Determinação e/ou identificação estrutural das substâncias puras isoladas por métodos espectroscópicos.
v. Avaliação biológica in vitro das substâncias isoladas das frações bioativas frente à atividade esquistossomicida.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Especificação dos materiais, instrumentos e técnicas utilizadas Parte química
Nas análises por CCDC foram utilizadas placas preparadas com sílica gel 60 G (Merck) em suspensão com água destilada na proporção 1:2,5 (m/v). A suspensão foi colocada sobre placas de vidro no espalhador com espessuras de 0,25 mm. As placas foram deixadas em temperatura ambiente por 24 horas e depois foram levadas para a estufa a 100°C por 60 minutos.
O revelador usado para as análises de CCDC foi uma solução de vanilina seguida de aquecimento. A solução de vanilina foi preparada pesando-se 0,3 g de vanilina e dissolvendo-se em 30 mL de uma solução de água (450 mL), ácido sulfúrico (400 mL) e metanol (450 mL). Também foi utilizada lâmpada de UV-Vis da marca spectroline.
As colunas cromatográficas (CC) foram preparadas com Sephadex LH-20 da marca Amersham Biosciences.
Os solventes orgânicos utilizados como eluentes nas análises foram de grau PA ou CLAE e de acordo com a polaridade das substâncias. Antes da sua utilização os solventes CLAE foram filtrados em membrana de Nylon 66 da Supleco. A água ultrapura foi obtida do Direct-Q-UV Millipore.
As concentrações das frações foram feitas em rotaevaporador Büchi sob pressão reduzida.
As análises por CLAE foram realizadas em cromatografo de sistema binário SHIMADZU Prominence LC-6AD equipado com um injetor manual, com loop de 20 µL e 500 µL, um “degasser” DGU-20A5 acoplado a um detector UV-Vis modelo SPD-20A ou UV-DAD modelo SPDM-20A e com aquisição de dados através de um microcomputador.
As separações das substâncias foram realizadas em colunas cromatográficas da marca
SHIMADZU Shim-pack ODS (diâmetro de partícula 5 µm, diâmetro do poro 100 Å, 250 x 4,60 mm e 250 x 20 mm) colunas equipadas com uma pré-coluna do mesmo material.
Os espectros de RMN da marca Brucker, foram registrados com solução das substâncias preparada em DMSO-d6da marca Aldrich.
Parte Biológica
No ensaio do DPPH foram empregados DPPH da marca Sigma-Aldrich, metanol HPLC, placas de 96 poços de 2000 e 300 µL e leitor de Elisa da marca Tecan.
No ensaio da atividade inibitória da enzima ciclooxigenase foram empregados o N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD), COX-1 e COX-2,Tris HCl, hematina, DMSO e ácido araquidônico da marca Sigma-Aldrich. Foram utilizados também metanol HPLC, placas de 96 poços de 2000 e 300 µL e leitor de Elisa da marca Tecan.
No ensaio esquistossomicida foram empregadas cepas LE de S. mansoni, meio RPMI Invitrogen, HEPES (Gibco), soro bovino fetal (Invitrogen), penicilina e estreptomicina (Invitrogen), câmara de segurança biológica BioFlux II 120 A, estufa de dióxido de carbono (Sanyo, COM-17AC) operando a 37° C com 5% de CO2, microscópio de luz invertida (Optech, XDS-1), placa de cultura de 24 poços (TPP) e DMSO (Merck).
3.2. Material Vegetal
As folhas de Styrax camporum foram coletadas no Cerrado brasileiro em uma área localizada no estado de São Paulo, na cidade de Luís Antônio, em Outubro de 2008. O material foi identificado pelo Profa. Dra. V. M. M. Gimenez e pelo Prof.Dr. M. Groppo. A
3.3. Estudo fitoquímico
As folhas de S. camporum (770 g) foram extraídas com EtOH-H2O (70:30, v/v) o que forneceu 85 g de extrato bruto. Posteriormente, 20 g do extrato bruto das folhas foram dissolvidos em CH3OH-H2O (2:8, v/v) e submetidos a processo de partição líquido-líquido com hexano, AcOEt e n-BuOH (Esquema 1, p. 20). Deste procedimento foram obtidas as frações:hexânica (0,19 g), AcOEt (1,30 g), n-BuOH (4,60 g) e hidrometanólica (2,85 g).
Esquema 1- Partição do extrato Bruto.
A fração AcOEt (2,4 g) foi submetida a uma coluna de Sephadex LH-20 eluída em CH3OH. Deste procedimento foram obtidas 27 subfrações que foram analisadas por CCDC e fase móveis: CHCl3-CH3OH-H2O (43:37:20, v/v/v) e CHCl3-CH3OH + 3 gota de ácido acético (2,5:0,5, v/v). Após a análise das cromatoplacas as frações foram unidas por similaridade conforme Esquema 2 (p. 21).
Extrato Hidroetanólico
20 g Bioensaio
Fr hexânica 0,19 g Bioensaio
Fase Hidrometanólica
Fr AcOEt 1,30 g Bioensaio
Fase Hidrometanólica
Fr n-BuOH 4,60 g Bioensaio
Fr Hidrometanólica 2,85 g Bioensaio 1) Dissolveu-se em 500mL CH3OH:H20 (1:4) 2) Hexano (3x 300mL)
3) AcOEt (3x 300mL)
4) n-BuOH (3x 300mL)
Esquema 2- Estudo da fração AcOEt.
A subfração 18-20 (89 mg) devido a seu perfil promissor na cromatoplaca (Esquema 3, p. 36) foi avaliada por CLAE-UV-Vis epurificada por CLAE-preparativa, utilizando-se como fase móvel CH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 1,0 mL/min. e λ 312 nm. Desta subfração foram isolados doisflavonóides.
Esquema 3- Estudo da fração 18-20.
SubFr (1-3) 54,8mg
P-AcOEt 2,4g
SubFr (4-6) 554mg
SubFr (7-9) 138,5mg
SubFr (10-14)
7mg
SubFr (15-16)
33mg
SubFr (17) 19,7mg
SubFr (18-20)
89mg
SubFr (22-24)
3,6mg
SubFr (21) 21,3mg
SubFr (25) 3,2mg
SubFr (26-27) 7mg
Sephadex LH-20, MeOH
SubFr 1 3,6mg
Fr 18-20
SubFr 2 8,1mg
SubFr 3 3,9mg
SubFr4 4,7mg
SubFr 5 4,5mg
SubFr 6 15mg
SubFr 7 3,9mg
1 2
CLAE-preparativo
3.4. Ensaio espectrofotométrico de COX humana recombinante
Atividade enzimática de COX-1 e COX-2 foi avaliada empregando ensaio cromogênico baseado na oxidação do N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) durante a redução de PGG2 a PGH2 (Esquema 4, p. 22). A mistura do ensaio (280 µL) continha 100 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 µM hematina, 0,31 µg de COX-1 ou 1,09 µg de COX-2, 100 µM das substâncias ou 10 µg/mL dos extratos e frações que foram preparadas em DMSO e metanol. O controle continha30 µL de metanol no lugar da amostra a ser avaliada. A mistura foi pré-incubada a 22°C por 15 min antes do início da reação enzimática. A reação foi iniciada pela adição de 30 µL de uma solução de 0,374 mM de AA e 1,87 mM TMPD no tampão do ensaio (sem enzima ou hematina). A atividade enzimática foi estimada pela velocidade inicial de oxidação do TMPD nos primeiros 36 s da reação que foi acompanhada pelo aumento da absorbância a 610 nm. A oxidação não enzimática de baixa velocidade observada na ausência de COX-2 ou COX-1 foi subtraída antes do cálculo da porcentagem de inibição que foi calculada pela fórmula: [(Acontrole- Aamostra ou padrão)/ Acontrole] * 100, análises realizadas pelo Leitor Elisa.
Esquema 4: Ensaio frente a enzima COX-1 e COX-2.
100 mM de Tris HCl, 1 µM hematina 0,31 µg COX-1 ou 1,09 µg COX-2 100 µM das substâncias e 10 µg/mL
dos extratos
pré-incubada a 22°C
30 µL de 0,374 mM de AA 1,87 mM TMPD no tampão do
ensaio
Atividade enzimática:
Leitura a 610 nm
3.5. DPPH (1,1-difenil -2-picril-hidrazila)
O ácido gálico foi utilizado como padrão. 1 mg dos extratos brutos e padrão foram dissolvidos em 1000 µL de CH3OH. Então, numa placa de 96 poços com capacidade para 2,0 mL, foram preparadas as soluções das amostras a serem testadas nas concentrações 0,2; 0,1; 0,03; 0,02; 0,01; 0,008 e 0,005 mg/mL. Logo após o preparo das diluições e com o auxílio de uma micropipeta multicanais, uma alíquota de 100 µL das diversas soluções, foi transferida para a placa de 96 poços transparente em triplicata. Em seguida foram adicionados 200 µL da solução de DPPH (101,4 µM em CH3OH) e a placa foi mantida no escuro por 30 minutos. Após este tempo, foram realizadas as leituras no leitor de microplacas a λ 517 nm. Assim, as concentrações finais das amostras foram 66,7; 33,3;
10,0; 6,67; 3,33; 2,67; 1,67 µg/mL. 300 µL de CH3OH foram empregados como branco:
300 µL de CH3OH e como controle: 100 µL de CH3OH e 200 µL da solução de DPPH (Esquema 5, p. 23). Os dados foram processados aplicando a fórmula: [(Acontrole- Aamostra ou padrão)/ Acontrole] * 100. Os valores de IC50 foram obtidos no programa GraphPad Prism 4.
Ácido gálico (padrão) e
1 mg substâncias puras e extratos
Dissolu
1000 μL de CH3OH
Capacidade de 2 mL Transferência das amostras
100 µL
3x
Preparo das diferentes concentrações
3.6. Ensaio da Atividade Esquistossomicida
Manutenção do ciclo de vida de S. mansoni
O ciclo biológico de S. mansoni, linhagem LE, foi mantido através da passagem seriada em moluscos Biomphalaria glabrata, hospedeiro invertebrado, e em camundongos Balb/C como hospedeiro vertebrado no Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP sob supervisão do Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues.
Os ovos de S. mansoni presentes nas fezes de camundongos das linhagens Swiss ou Balb/C, previamente infectados com o parasita, foram recolhidos pelo método de Hoffman (Hoffman, 1934) e expostos por aproximadamente 1 hora sob luz para a liberação dos miracídios. Estes, foram utilizados para infectar o hospedeiro intermediário (caramujo da espécie B. glabrata) que, após 38 a 43 dias, liberaram a forma infectante (cercárias) do parasita. Posteriormente, as cercárias foram inoculadas nos camundongos via subcutânea e após aproximadamente 56 dias os vermes adultos foram recuperados do sistema porta-hepático por perfusão (Smithers e Terry, 1965). Após a coleta, os parasitas foram mantidos em meio RPMI, sendo em seguida utilizados nos experimentos.
Realização do ensaio esquistossomicida
O ensaio foi realizado no laboratório Laboratório de Pesquisa em Parasitologia – UNIFRAN sob coordenação da Profa. Dra. Lizandra G. Magalhães. Para a realização do ensaio foi preparado o meio com 45 mL de RPMI 1640 (Invitrogen) tamponado com HEPES 20 µM (pH 7,5) e suplementado com 10% de soro bovino fetal e 500 µL dos antibióticos penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL).
Preparo do controle positivo
Como controle positivo foi utilizado o praziquantel, medicamento empregado no tratamento da esquistossomose. Este foi solubilizado em DMSO a concentração de 12 mM.
Preparo das amostras
No preparo das amostras foram pesados 2 mg do extrato etanólico, frações e das substâncias isoladas, sendo, em seguida, solubilizadas em DMSO obtendo-se 100 µg/mL para extratos e frações e cinco ou quatro concentrações diferentes para substâncias puras 12,5 µM, 25 µM, 50 µM e 100 µM. Em seguida, as soluções foram esterilizadas em filtro de 0,45 µm.
Ensaio in vitro da atividade esquistossomicida
Casais de vermes adultos foram recuperados de camundongos Balb/C, por perfusão do sistema porta-hepático, em condições assépticas. Os vermes adultos foram lavados em RPMI-1640 e transferidos para placas de 24 poços com 2 mL de meio RPMIsendo, em seguida, adicionadas as amostras em análise aplicando cada concentração em 4 poços. Cada poço continha um casal de parasitas. Em seguida, a placa foi incubada em atmosfera umidificante a 37° C na presença de 5 % de CO2 por 120 horas, sendo monitorado a cada 24 horas com o auxílio de um microscópio invertido.
Foram avaliadas condições gerais do parasita como pareamento, taxa de mortalidade, atividade motora e alteração no tegumento com o auxílio de microscópio de luz invertida.
Esquema 6: Desenvolvimento do ensaio esquistossomicida.
Incubação a 37° C com 5 % CO2 por
120 horas
Monitoração a cada 24 horas
Preparo da amostra
+
(proporção)
de DMSO
(proporção)
mg das amostras Homogeneização
da amostra
2 mL de meio 1 casal de vermes por poço Placa de 24 poços
Placa com meio
Controle positivo Praziquantel 10 µM
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Fitoquímica
Existem diversos métodos para a análise e identificação de metabólitos secundários conhecidos produzidos em plantas. A análise de misturas complexas é usualmente feita por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC), por comparação com os valores de fator de retenção (Rf) de substâncias conhecidas em diferentes sistemas eluentes e pela sua reatividade frente a diferentes reagentes cromogênicos (Fumagali et al., 2008; Van Beek e Van Gessel, 1988).
Para análise quantitativa e também qualitativa, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplada a detector de UV-Vis, principalmente com o detector de arranjo de diodos (DAD) é a técnica mais utilizada (Fumagari et al., 2008; Theodorides et al., 1998). Os trabalhos mais recentes estão empregando a CLAE acoplada a espectrometria de massas na análise qualitativa e quantitativa (Fumagari et al., 2008).
O extrato bruto das partes aéreas foi primeiramente analisado por CLAE-UV-Vis (Figura 10, p. 28), o cromatograma obtido evidenciou a presença de diversas bandas cromatográficas distribuídas por todo o cromatograma e de pelo menos 3 picos mais intensos que de acordo com o detector empregado não significa que estes sejam majoritários em termos de p/p.
Devido a complexidade do extrato bruto, este foi submetido a uma partição líquido- líquido, onde foram obtidas as frações: hexânica, AcOEt, n-BuOH e hidrometanólica. As
cromatograma com maior resolução, a fração AcOEt bioativa foi selecionada e submetida a uma coluna de Sephadex LH-20 para desta forma obtermos subfrações mais simplificadas.
A subfração 18-20, oriunda da partição AcOEt, foi analisada por CLAE-UV-Viscom fase móvelCH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 1,0 mL/min. e λ 312 nm, e apresentou um perfil cromatográfico promissor (Figura 14, p. 30), isto é, uma boa resolução cromatográfica. Assim, esta subfração foi então purificada por CLAE- preparativa na mesma condição analítica (Figura 15, p. 31).
Figura 10: Cromatograma do Extrato bruto hidroetanólico das folhas de S. camporum.
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 5 10 15
mAU
314nm,4nm (1.00)
17.675 18.144 21.994 23.361 24.864 25.980 27.508 28.109 31.808 33.783
Figura 11: Cromatograma da fração AcOEt de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
Figura 12:Cromatograma da fraçãon-BuOH de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 100 200 300
mAU
314nm,4nm (1.00)
20.195 21.928 23.302 24.840 25.292 26.357 26.894 27.09427.369 27.729 28.09628.291 28.636 28.928 29.334 30.058 31.754 32.542
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 10 20 30 40 50
mAU
314nm,4nm (1.00)
21.993
Figura 13:Cromatograma da fração hidrometanólica de S. camporum
Coluna ODS, λ 314 nm, volume de injeção: 20 µL, fluxo: 1,0 mL/min. e condição: H2O (+0,1% HAc): CH3OH, gradiente linear, (5% →100%) em 30 minutos, 5 minutos 100%
CH3OH, 15 minutos de equilíbrio, 2 minutos para retornar à condição inicial.
Figura 14:Cromatograma analítico da subfração 18-20 (89 mg).
Fase móvel CH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 1,0 mL/min.
e λ 312 nm.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 5 10
mAU
314nm,4nm (1.00)
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min
0 25 50 75 100
mV
SPD-20A Ch1:312nm
3.216 5.771 11.977 19.892 21.811 42.541 46.604
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
mV(x100)
SPD-20A Ch1:312nm
7.560 8.297 8.873 10.358 14.202 21.467
Figura 15:Cromatograma preparativo da subfração 18-20 (89 mg).
Fase móvel CH3OH-H2O-HÁc (68:31,9:0,1, v/v/v), coluna de sílica ODS, fluxo 9,0 mL/min.
e λ 312 nm.
1 2
4.2. Identificação dos flavonóides isolados
A identificação de flavonóis inicia-se pela análise dos espectros de Ultravioleta, que podem ser adquiridos online pelo uso do detector de Arranjo de Diodos acoplado a CLAE (CLAE-DAD). Em seguida, após isolamento, a RMN de 1H, seguida pelo exame do espectro de13C e pela comparação paralela com os dados de RMN de 13C de flavonóis compilados e publicados por Agrawaal em 1989 permite a caracterização completa destas substâncias.
O
O OH
HO
OH
R1
OH
(3) OH (4) H
R1
2
5 7
4´
3´
Figura 16: Estruturas químicas dos flavonóides isolados de S. camporum.
O espectro de ultravioleta de um flavonóide é normalmente determinado em etanol ou em metanol e consiste tipicamente em dois picos de absorção máxima entre 240-285 nm (banda II, devido à absorção do anel A) e 300-550 nm (banda I, devido ao anel B). A posição precisa e as intensidades relativas destes máximos dão uma valiosa informação quanto à natureza do flavonóide e ao seu padrão de oxigenação. O aumento da oxigenação do anel-B dos flavonóis causa um desvio batocromico da banda I por cada grupo oxigenado adicionado. Este efeito pode ser observado no espectro de UV de 1 e 2 que possuem λmax em 370 e 366 nm (Figura 17, p. 34), respectivamente, onde 1 apresenta uma hidroxila a mais no anel B.A banda II pode aparecer com um ou dois
1 OH - Quercetina 2 H - Kaempferol A
B
C
picos, designados de IIa ou IIb, sendo o IIa, o de maior λ, e dependente do padrão de oxigenação do anel B. Por exemplo, os flavonóis 3′ e 4′-oxigenados aparecem com dois grupos de absorção, ou um máximo com um ombro no pico do lado de maior λ, entre 250 e 275 nm, enquanto que os 4′-oxigenados têm apenas um pico (Da Cunha, 2005). Este efeito pode ser observado no espectro de UV de 1 e 2 que possuem λmax em 255 e 264 nm.
A presença desta classe de metabólitos secundários pode ser confirmada também por RMN 1H, de modo geral, são evidenciados pelos sinais em região aromática entre δ 6,00 a 8,00. A integração dos sinais é proporcional ao número de hidrogênios que estas representam e as constantes de acoplamento orto (6,5 - 9,0 Hz) ou meta (1,5 - 2,5 Hz) são de suma importância para estabelecer o padrão de substituição dos anéis aromáticos.
Na seqüência, o espectro de RMN de 13C é importante para a identificação estrutural principalmente pela análise da presença ou ausência de carbonila, que dependendo do tipo estrutural em questão pode apresentar variações significativas de δ. No caso dos flavonóis, o deslocamento químico ocorre entre 171-186 ppm (Agrawaal, 1989).
As atribuições dos sinais de RMN 1H e 13C de1 e 2 encontram-se descritas nas Tabelas 1 e 2 (p. 35 e 36).
Dados de RMN 1H de 1 (Figura 18, p. 37,Tabela 1, p. 35) indicaram a presença de seis sinais, que se encontravam em região com maior deslocamento químico e indicaram a presença de anéis aromáticos. O sinal em δ 7,53 (dd, J= 8,4 e 1,8, 1H) foi atribuído ao H-6′ e os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto e meta com o H-5′ (δ 6,87, d, J= 8,4, 1H) e H-2′ (δ 7,67, d, J= 1,8, 1H) revelando um
identificar a presença de um grupo hidroxila em C-5, o qual participa de uma ligação de hidrogênio intramolecular.
Os dados de RMN 13C (Figura19, p. 38, Tabela2, p. 36) evidenciaram a presença de 15 carbonos sendo um deles uma carbonila em (δ 176,6). Estes dados, quando analisados com os dados de DEPT 135 (Figura 20, p. 39, Tabela 2, p. 36) confirmaram a presença de dez carbonos não hidrogenados e cinco carbonos metínicos. Estes valores de deslocamentos químicos quando comparados com dados de análogos publicados na literatura, sugestionaram que a estrutura básica de 1 seria de um flavonol, neste caso a quercetina (Agrawaal, 1989).
O espectro de RMN 1H de 2 (Figura 21, p. 40. Tabela 1, p. 35) indicou a presença de cinco sinais, que se encontravam em região com maior deslocamento químico e indicaram a presença de anéis aromáticos. O sinal em δ 8,03 (d, J= 8,8, 2H) foi atribuído ao H-2′ e H-6′ os valores das constantes de acoplamento indicaram acoplamentos em posição orto com o H-3′ e H-5′ (δ 6,92, d, J= 8,8, 2H) revelando um anel aromático disubstituído. Além dos sinais em δ 6,18 (d, J= 1,8, 1H) e δ6,42 (d, J= 1,8, 1H) evidenciaram a presença de outro anel aromático tetrasubstituído, neste espectro foi possível o cálculo da constante. Aliado, ao singleto largo em δ 12,48 indicando novamente a presença de um grupo hidroxila em C-5, que como em 1, participa de uma ligação de hidrogênio intramolecular em 2.
Os dados de RMN 13C (Figura22, p. 41, Tabela2, p. 36) evidenciaram a presença de 13 carbonos sendo um deles uma carbonila em δ 176,7. Além de apresentar os sinais em 116,3 e 130,3 mais intensos, o que pode indicar a presença de carbonos duplicados, isto é, equivalentes. Os dados do experimento DEPT 135 (Figura 23, p. 42) permitiram inferir que nove carbonos eram não hidrogenados e quatro eram metínicos. Estes dados, quando analisados com os dados de deslocamentos químicos de análogos publicados na
literatura, sugestionaram que a estrutura básica de 2seria do kaempferol (Agrawaal, 1989).
Figura 17: Espectro de ultravioleta do (a) Kaempferol (2) e (b) Quercetina(1).
Tabela 1: Dados de RMN 1H (500 MHz) das substâncias 1 e 2a.
1H 1
δ, m, J (Hz)
2 δ, m, J (Hz)
6 6,17 sl 6,18 d (1,8)
8 6,39 sl 6,42 d (1,8)
2' 7,67 d (1,8) 8,03 d (8,8)
3' - 6,92 d (8,8)
5' 6,87 d (8,4) 6,92 d (8,8) 6' 7,53 dd (8,4 e 1,8) 8,03 d (8,8)
5-OH 12,49 s 12,48 s
aDMSO-d6
200 300 400 500 nm
0 25 50
mAU
366
264 497
200 300 400 500 nm
0 1000 2000
mAU
203 370
255
(a ) ( b)
