Métodos convencionais, tais como o método cultural, que requer perito na detecção e identificação de fungos aflatoxicogênicos não podem efetuar a distinção entre indivíduos produtores e não produtores de aflatoxinas. A classificação taxonômica pode ser simplificada pelo uso de um meio de cultura seletivo, mas o tempo requerido ainda é grande (Davies et al., 1987). Devido a toxicidade e carcinogenicidade das aflatoxinas, existe uma demanda por métodos de detecção que sejam relativamente rápidos, fáceis e altamente específicos. A PCR proporciona a amplificação in vitro de seqüências alvo de DNA e oferece várias vantagens sobre os métodos tradicionais de detecção e identificação de microorganismos:
1. O organismo, a priori, não necessita ser cultivado para a detecção por PCR.
2. É uma técnica fina e sensível, sendo teoricamente capaz de detectar moléculas de DNA alvo em uma mistura complexa sem o uso de sondas radioativas.
3. É rápida e versátil.
Um método adequado para fungos produtores de aflatoxinas deve ser capaz de diferenciar isolados produtores e não produtores e discriminar espécies filogeneticamente próximas. Para fins de PCR, podem ser utilizados métodos rápidos e simplificados de extração de DNA, pois a técnica exige quantidades mínimas do mesmo e não necessariamente, com alto grau de pureza.
A amplificação por PCR dos genes da via biossintética relacionados à produção de aflatoxinas (Figura 6), por serem genes de cópia única, é de dificil amplificação. Porém, são genes que estão bem caracterizados, o que possibilita a seleção de um certo número desses genes para cobrir toda a via, PCR multiplex, na qual se emprega diferentes pares de primers visando alvos específicos, na mesma reação de amplificação. Neste caso, além dos genes selecionados da via biossintética outros de outras regiões gênicas serão investigados e posteriormente utilizados. Seqüências únicas, específicas para fungos produtores de micotoxinas são a base para o desenvolvimento de um sistema de detecção viável utilizando a PCR tendo por seqüências alvo, os genes da via biossintética pksA, nor-1, uvm8, aflR, aad, ver-1, ord-1, ord-2, omtA (Yu, et al., 1995). Ainda Yu et al. (1995) demonstraram que ao menos 9 genes envolvidos na via biossintética da aflatoxina estão localizados dentro de um fragmento de 60 kb de DNA. Para caracterizar regiões da inserção do DNA em diferentes clones de cosmídios e bacteriófago lambda, a ordem dos genes da via biossintética de aflatoxina dentro da região de 60 kb do DNA foi determinada como sendo pksA; nor-1;
uvm8; aflR; aad; ver-2; ver-1; ord-1; ord-2; omtA em Aspergillus parasiticus e nor-1; aflR; ver-1; ord-1; ord-2 e omtA, para A. flavus. A ordem está relacionada às fases enzimáticas requeridas para a biossíntese da aflatoxina.
Yu et al. (2000) descreveram um cluster de genes da via biossintética em A. flavus e A. parasiticus, que impulsionou a clonagem e caracterização de um gene regulador e 16 genes estruturais envolvidos na biossíntese da aflatoxina incluindo o gene ordA, o qual tem sido identificado como envolvido na formação de 4 aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2). Estendendo o seqüenciamento em ambas as direções do fragmento de 60kb, tendo nas extremidades do cluster o gene pksA de um lado e o omtA do outro lado. Dentro dos 25 kb do DNA genômico seqüenciado a partir do gene omtA, nessa região, foram identificadas os genes vbs, ordA, cypX e moxY. As seqüências entre esses genes, cypX e moxY, mostraram uma sub-região não codante de 5 kb de DNA, seguida de um cluster de genes provalvemente envolvido no metabolismo do açúcar. Análise com Northern blot e RT-PCR demostraram que os genes cypX e moxY são expressos concorrentemente com genes envolvidos na biossíntese da aflatoxina.
A biossíntese da aflatoxina é induzida por açúcar simples (Buchanan & Stahl, 1984). A indução é associada com a ativação da transcrição dos genes da via, pksA, nor-1, ver-1 e omtA e o da via regulatória aflR (Chang et al., 1993 & Woloshuk et al., 1994). Flaherty & Payne (1997), concluíram que aflR é de fato o gene regulador da via metabólica da aflatoxina, mas que a ativação da via depende de fatores não conhecidos dependentes do metabolismo do fungo. Em condições normais, aflR é o único regulador da biossíntese da aflatoxina. Várias pesquisas mostraram que a fonte de carbono pode ser um dos determinantes mais importante na biossíntese da aflatoxina e apesar disso, pouco se sabe sobre os mecanismos da regulação de carboidratos (Payne e Brown, 1998). Sabe-se, entretanto, que o desenvolvimento do fungo e a biossíntese da aflatoxina dividem um mesmo circuito regulatório. E, apesar da via ser regulada pelo gene aflR, há vários outros fatores que condicionam a produção de aflatoxina pelo fungo.
Yu et al. (1998), investigaram a ação do gene ordA de Aspergillus parasiticus e do seu homólogo ord1 de A. flavus, genes esses envolvidos na conversão de O- metilesterigmatocistin (OMST) para aflatoxina B1 e que para tal, requer a atividade de oxidoredutase do citocromo P-450. Isolado de A. parasiticus acumulador de OMST, complementado com o gene ordA, restaurou a habilidade do isolado de produzir aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. O mesmo gene, colocado sob o controle do promotor GAL1 em
ord1, não foi capaz de realizar essa mesma conversão no sistema de levedura. Prosseguindo, constataram que o gene ord1 tem três mutações pontuais, resultando na troca de três aminoácidos: histidina 400 para leucina 400; alanina 143 para serina 143 e isoleucina 528 para tirosina 528. Da análise dos sítios mutados, verificou-se que a troca de histidina 400 para leucina 400 resultou em perda da atividade de monooxigenase e que alanina 143 alterou a conversão catalítica, já isoleucina 528 não foi associada a atividade enzimática. Segundo os autores, o envolvimento do gene ordA na síntese das aflatoxinas G1 e G2 em A. parasiticus, sugere que enzimas requeridas na formação dessas aflatoxinas não estão presentes em A.
flavus. Eles concluíram que esses resíduos são críticos para a atividade catalítica do citocromo
P-450, estando ordA associado a um novo citocromo P-450 da família gênica chamada CYP64.
Criseo et al. (2001), objetivando diferenciar isolados de Aspergillus produtores dos não produtores de aflatoxinas, utilizaram três métodos convencionais – três tipos diferentes de meio de cultura, ideais para produção de aflatoxina, crescendo todos os isolados estudados em cada um dos meios e posterior extração da aflatoxina, seguido de análise do produto por cromatografia de camada delgada – e PCR multiplex que os autores denominaram de PCR quadruplex, por utilizarem 4 tipos de primers: um para o gene da via regulatória da aflatoxina (aflR) e três para para genes estruturais da via biossintética da aflatoxina, omt-A, ver-1 e nor-1.
Tal método obteve como resultados a presença de um padrão completo de bandas para um isolado não produtor de aflatoxina e fez com que os autores concluíssem que esse não é um marcador suficiente para separar isolados produtores de aflatoxinas dos não produtores. Os autores verificaram que a aparente falta da produção de aflatoxina necessita não apenas estar relacionada a um modelo incompleto de banda em um PCR quadruplex. E completam afirmando que diferentes tipos de mutações (substituições de algumas bases) podem ter inativado a via biossintética da aflatoxina.
Klick et al. (1995), investigando espécies de Aspergillus produtoras e não produtoras de aflatoxinas, e utilizando-se de sonda com genes aflR e omt-1 obtiveram os seguintes resultados: todos A. flavus, A. parasiticus e A. sojae examinados, hibridizaram com ambos os genes e nenhum isolado de A. oryzae hibridizou com a sonda aflR. A. tamarii não hibridizou com nenhum dos genes. Os resultados sugerem que alguns isolados dessa seção não produzem aflatoxina porque lhes faltam ao menos um dos genes necessários a biossíntese e que isolados não produtores de A. flavus, A. parasiticus e A. sojae poderiam faltar um gene
que não foi examinado nesse trabalho, uma vez que os isolados das três espécies hibridizaram com ambos os genes investigados.
Shapira et al. (1996) utilizando-se da PCR com primers para dois genes da via biossintética (ver-1, omt-1) e um da via regulatória para aflatoxina (apa-2), testados para DNA de Aspergillus spp, Penicillium spp e Fusarium spp, separaram indivíduos produtores de aflatoxina de indivíduos não produtores, e concluíram que genes envolvidos na via biossintética podem formar as bases para um sistema de detecção acurado, sensível e específico para isolados aflatoxicogênicos, em grãos e alimentos.
Farben (1997), trabalhando com isolados de A. flavus em figo e PCR com primers dos genes nor-1, ver-1 e omtA, concluíram que os genes da via biosintética podem formar as bases para detecção de indivíduos aflatoxicogênicos, pois obtiveram resultados positivos somente para indivíduos produtores de aflatoxina.
Chen et al. (2002) utilizando-se da técnica de PCR para detecção de genes da via biossintética da aflatoxina (nor-1, ver-1, omt-1 e a proteína reguladora apa-2), investigaram dezenove isolados do grupo de A. flavus, incluindo A. flavus, A. parasiticus, A. oryzae, A.
sojae e um A. niger. Quinze isolados mostraram possuir os 4 fragmentos de DNA alvo. Todos
os sete isolados aflatoxicogênicos possuíam os 4 fragmentos de DNA e cinco isolados menos de 4 fragmentos, com características de não produtor de aflatoxina. Na continuidade dessa investigação, grãos de amendoim foram artificialmente contaminados com A. parasiticus e A.
niger, incubados por 7 dias e o DNA extraído de um pedaço do cotilédone. Quando aplicado o
teste PCR multiplex usando os 4 pares de primers dos genes investigados, os fragmentos de DNA alvo foram detectados nos grãos infectados com A. parasiticus e nenhum dos genes analisados foi detectado nos grãos não inoculados ou nos grãos infectados com A. niger.
Problemas de co-amplificação de genes homólogos em isolados não aflatoxigênicos, e a não especificidade de primers para a via biossintética da aflatoxina são os problemas correntes na tentativa de separar indivíduos produtores dos não produtores. É possível no entanto, que se possa tornar a detecção de indivíduos aflatoxicogênicos mais consistente, com a inclusão de primers específicos para populações brasileiras de A. flavus produtores de aflatoxinas, de culturas e regiões geográficas diferentes, ao utilizar um conjunto de primers desenhados a partir de seqüências específicas de regiões candidatas (rDNA
nuclear, mitocondrial e gene da β-tubulina), marcadores RAPD-SCAR e primers específicos
para a via biossintética das aflatoxinas.
iam amplificações do mRNA com primers universais de regiões candidatas, que posteriormente seriam utilizados na busca de alvos específicos para o desenho de primers a serem utilizados na detecção de fungos viáveis na amostra investigada (Vaitilingom et al., 1998). A vantagem do RT-PCR é que seria detectado o mRNA alvo que estará sendo produzido, seriam detectados, portanto, alvos viáveis do fungo. E em se tratando de um fungo produtor de micotoxina, este poderia ser detectado em sua plena atividade micotoxicogênica (Edwards et al., 2002).
Figura 6: Via biossintética para sterigmatocistin e aflatoxina B1 do fungo Aspergillus flavus. A via biossintética está fora do perímetro, com os genes envolvidos na codificação das enzimas sobre as caixas e dentro das caixas, as setas indicam a direção da transcrição do gene. As setas que saem das caixas indicam a posição de cada enzima na via. Pks A, policetídeo sintase; nor 1, nor A, norsolorinic ácido redutase; fas1, fas2, ácido graxo sintase; aflR, fator de transcrição; afl J, desconhecido; adh A, álcool dehidrogenase; ver 1A , aflS, O-metiltransferase; avn A, versiconal hemiacetil acetato redutase; ver B, desaturase; ord 1, ord 2, omt A, O-metiltransferases; vbs, oxidase/dehidrogenase; avf 1 (afl B afl W), esterases. Adaptado de Woloshuk & Prieto (1998), por Edwards et al. (2002)