Determinação da citotoxicidde e atividade antiproliferativa dos óleos essenciais

A citotoxicidade dos óleos essenciais mais ativos foi avaliada através dos efeitos sobre células humanas normais (HaCAt - queratinócito) e células humanas tumorais (U251 - glioma); (MCF-7 - mama); (NCI-ADR/RES - ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); (786-0 - rim); (NCI-H460 - pulmão, tipo não pequenas células); (HT29 - cólon); (K562 - leucemia), utilizando-se o ensaio da sulforrodamina B (SBR) (MONKS et al, 1991). As linhagens de células humanas foram cedidas gentilmente pelo NCI e mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco®) suplementado com 5 % de soro fetal bovino (SFB) (Gibco®), e incubadas a 37 °C em atmosfera úmida com 5 % de CO2. Os ensaios foram conduzidos na Divisão de Farmacologia do CPQBA sob a supervisão da Dra. Ana Lucia Tasca Goiz Ruiz.

Foram inoculados 100 µL/compartimento, em placas de 96 compartimentos (Nunc®), de uma suspensão com densidade de inoculação entre 3 x 104 e 6,5 x 104 cel/mL em meio RPMI/SFB acrescido de 50 µg/mL de gentamicina (Schering Plus®_{). Após 24 h de incubação a} 37 °C, em atmosfera úmida com 5 % de CO2 foram adicionados 100 µL/compartimento do óleo essencial selecionado (diluído em DMSO) em quatro concentrações distintas. Como controle positivo foi utilizado Doxorrubicina, nas mesmas concentrações das amostras em teste.

incubadas por 1 h a 4 °C. A seguir, o material contido nas placas foi lavado com água destilada para remoção de resíduos. Depois de secas à temperatura ambiente, as mesmas foram coradas com solução de SRB 0,4 % (p/v), dissolvido em ácido acético 1 % e mantidas por 60 min a 4 °C. Em seguida, as placas foram lavadas 4x com ácido acético 1 % e secas à temperatura ambiente. Finalmente, o corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com Trizma Base (Sigma®), 10 µM e pH 10,5. A leitura da absorbância foi realizada em 540 nm em leitor de microplacas.

Foram gerados gráficos de porcentagem de crescimento em função da concentração da amostra testada, para cada uma das linhagens. Foram calculadas as concentrações efetivas: GI50 - Growth Inhibition, concentração necessária para interromper em 50 % o crescimento celular; TGI - Total Growth Inhibition, concentração necessária para que ocorra 0 % de crescimento celular e LC50 - Lethal Concentration, concentração necessária para que ocorra 50 % de morte celular, por regressão não linear, tipo sigmoidal, utilizando-se o software Origin, versão 8.0.

Avaliar a capacidade dos óleos e combinações na inibição da formação do

Biofilme

óleos essencias para:

109 cepas de S. aureus isolados de úberes de vacas e novilhas + ATCC

Quatro óleos escolhidos para

testes subsequentes.

Análise química

Testes Farmacológicos (Cél. tumorais e Cél normais)

Combinação dos quatro óleos entre si (11 misturas)

Método:

Realizado na Divisão de Farmacologia do CPQBA, sob a supervisão da Dra Ana Lúcia

Ruiz Método: Realizado na Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica do CPQBA, sob supervisão no Dr. Adilson

Avaliação das blendas contra 38 cepas contendo representantes de cada grupo genético de S. aureus

aleatoriamente.

Determinar a melhor condição para a formação

do biofilme (teste em 12 cepas) Método: Teste em 5 meios de cultura diferentes. Método: Combinação dos óleos essenciais em proporções iguais

Método – Microdiluição (MIC)

A melhor combinação contendo apenas 2 óleos foi escolhida para o preparo da microemulsão V. zizanioides/T.riparia

A microemulsão foi testada contra 4 cepas em 4 meios de cultura diferentes.

A melhor combinação contendo 3 óleos foi escolhida para o preparo da microemulsão

V. zizanioides/T. riparia/E. muticus

A microemulsão foi testada contra 12 cepas em 4 meios de cultura

diferentes.

Método – Microdiluição (MIC)

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Atividade anti-S. aureus dos óleos essenciais estudados

Os resultados referentes à atividade anti-S. aureus dos óleos essenciais estudados estão apresentados na Tabela 3 e indicam a porcentagem de micro-organismos inibidos em cada uma das concentrações testadas (0,015 a 1,0 mg. mL-1). De acordo com a classificação proposta por Duarte et al. (2005), todos os óleos essenciais estudados apresentaram potencial anti-S. aureus. As espécies C. citratus, E. muticus, T. riparia, V. zizanioides, Melissa officinalis (2363 e 2364) e Pilocarpus microphyllus caracterizaram-se como as mais promissoras. Entretanto, os óleos de M. officinalis não foram selecionados considerando que a espécie não é nativa do Brasil, sendo necessária a importação de sementes para sua produção e o óleo volátil não ser encontrado comercialmente. Por sua vez, o óleo volátil de P. microphyllus também não foi incluído nos testes subsequentes considerando o fato de que 16,3 % das cepas não foram inibidas por este óleo em nenhuma das concentrações testadas.

As quatro espécies selecionadas inibiram 100 % das cepas dentro do gradiente de concentração testado. A espécie C. citratus inibiu 91 % das cepas nas concentrações de 0,125 a 0,250 mg. mL-1_{, a espécie de E. muticus inibiu 82 %, T. riparia 71 % e V. zizanioides 57 % das} cepas nas mesmas concentrações. As espécies C. citratus e E. muticus foram as únicas que inibiram

100 % das cepas em concentrações <1,0 mg. mL-1. Os rendimentos dos óleos essenciais (C. citratus, E. muticus, T. riparia e V. zizanioides) foram respectivamente: 1,13; 1,11; 1,8 e 0,55

(% de massa seca).

Os resultados encontrados no presente trabalho corroboram com outros achados da literatura. A espécie C. citratus tem apresentado ação inibitória sobre uma grande variedade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (EKPENYONG, et al., 2015). Alguns estudos mostram que a presença de compostos como: citral, geraniol, eugenol e mentol estão entre os principais responsáveis pelas ações bioativas do óleo (LAMBERT, et al., 2001; MARTINS et al., 2004; EKPENYONG, et al., 2015).

Alguns outros estudos também revelam o potencial antimicrobiano da espécie E. muticus. Hess, et al. (2007) estudaram a ação antimicrobiana da espécie sobre Bacillus cereus MIP 96016, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25923 e E. coli ATCC 25922. Eles observaram que os óleos essenciais e os extratos brutos etanólicos foram ativos contra todas as cepas, com exceção da E. coli ATCC 25922. Observaram também que as atividades antimicrobianas variaram de acordo com o período de coleta das plantas.

cepas de S. aureus inibidas em cada concentração de óleo (mg. mL-1), n=110 cepas.

Concentração de óleo testada (mg. mL-1₎

Espécie vegetal N.I. 1,0 0,5 0,250 0,125 0,06 0,03 0,015

1 Aloysia gratissima 31,8 58,1 9,09 1 0 0 0 0 2 Aloysia triphylla 56,3 12,7 24,5 4,5 1,8 0 0 0 3 Alpinia zerumbet 2,7 35,4 31,8 27,2 2,7 0 0 0 4 Artemisia annua 37,2 37,2 20,9 4,5 0 0 0 0 5 Baccharis dracunculifolia 2,7 21,8 30 34,5 10,9 0 0 0 6 Baccharis trimera 7,2 50,9 21,8 16,3 3,6 0 0 0 7 Calea pinnatifida 13,6 51,8 27,2 6,3 1 0 0 0 8 Cinnamomum zeilanicum 30 42,7 22,7 3,6 1 0 0 0 9 Cordia verbenácea 94,5 5,4 0 1 0 0 0 0 10 Cyperus articulatus 26,3 45,4 27,2 0 1 0 0 0 11 Melissa officinalis. 1,8 12,7 11,8 30 25,4 18,1 0 0 12 Cymbopogon citratus 0 0 6 39 52 3 0 0 13 Cymbopogon martini 60,9 29 10 0 0 0 0 0 14 Cymbopogon winterianus 8,1 14 58 20 0 0 0 0 15 Elyonurus muticus 0 0 7 29 53 10 0 0 16 Eugenia caryophyllata 28 45 23 4 0 0 0 0 17 Eugenia sp. 35,4 53 10 1 0 0 0 0 18 Laurus nobili 87,2 12 1 0 0 0 0 0 19 Lippia alba 74,5 25 0 0 0 0 0 0 20 Lippia sidoides 22,7 61 16 0 0 0 0 0 21 Mentha piperita 98,9 1,1 0 0 0 0 0 0 22 Mikania glomerata 78 18 4 0 0 0 0 0 23 Ocimum basilicum 99 1 0 0 0 0 0 0 24 Ocimum gratissimum 14,5 51 28 6 0 0 0 0 25 Ocimun tenuiflorum 38 46 15 1 0 0 0 0 26 Ocimum carnosum 96 4 0 0 0 0 0 0 27 Origanum sp. 29 63 8 0 0 0 0 0 28 Zingiber officinale 19 62 15 4 1 0 0 0 29 Origanum vulgare 92,7 7 0 0 0 0 0 0 30 Melissa officinalis 16,3 27 11 9 20 15 0 0 31 Piper abutiloides 73,6 25 2 0 0 0 0 0 32 Piper aduncum 63,6 30 5 1 0 0 0 0 33 Piper marginatum 91,8 6 2 0 0 0 0 0 34 Porophyllum ruderale 90,9 8 1 0 0 0 0 0 35 Rosmarinus officinalis 89 10 1 0 0 0 0 0 36 Ruta graveolens 99 1 0 0 0 0 0 0

37 Solidago chilensis Meyen 78 16 4 0 2 0 0 0

38 Thymus vulgaris 61,8 24 12 1 2 0 0 0

39 Vetiveria zizanioides 0 12 24 39 18 7 0 0

40 Tetradenia riparia 0 2 20 38 33 7 0 0

41 Pilocarpus microphyllus 16,3 31 29 15 6 2 0 0

42 Pilocarpus pennatifolius 72,7 13 9 5 0 0 0 0

medicinais. O óleo essencial de T. riparia exibe propriedades repelente, inseticida, acaricida, antimalárica e antimicrobiana, e é uma mistura complexa de monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos (OLIVEIRA, et al., 2015). A segunda, Vetiveria zizanioides (L.) Nash tem suas raízes usadas como estimulantes, diurético, antiespasmódico, controle de febres, inflamações e irritabilidade do estômago. O óleo de vetiver tem extensas aplicações na indústria de cosméticos, perfumaria e aromaterapia e também possui propriedades antimicrobianas e antifúngicas na indústria farmacêutica (BHUIYAN et al., 2008).

Um ponto importante a ser considerado nos resultados do presente trabalho, é que as pequenas variações genéticas e fenotípicas presentes entre os isolados microbianos foram capazes de interferir na susceptibilidade destas às amostras de óleos testadas. Este resultado justifica estudos que contenham o maior número de cepas possíveis, visto que as respostas microbianas variam e podem impedir a correta identificação dos compostos com maior potencial bioativo.