UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
ALINE FRANCIELLE DA SILVA DOS SANTOS
“ATIVIDADE DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE S. aureus ASSOCIADAS À MASTITE BOVINA: INIBIÇÃO DO BIOFILME E OCORRÊNCIA DE
HORMESIS”
CAMPINAS 2016
ALINE FRANCIELLE DA SILVA DOS SANTOS
“ATIVIDADE DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CEPAS DE S. aureus ASSOCIADAS À MASTITE BOVINA: INIBIÇÃO DO BIOFILME E
OCORRÊNCIA DE HORMESIS”
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos resquisitos para a obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. MARTA CRISTINA TEIXEIRA DUARTE
Este exemplar corresponde à versão final da tese defendida pela aluna Aline Francielle da Silva dos Santos, e orientada pela Profa Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte
CAMPINAS 2016
__________________________________________
Dr.ª MARTA CRISTINA TEIXEIRA DUARTE (CPQBA/UNICAMP) TITULAR
____________________________________________________ Dr.ª ADRIANE E. A. DE MORAES (FCA/UNICAMP)
TITULAR
____________________________________________________ Dr.ª CLÁUDIA CARDOSO NETTO (FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ)
TITULAR
____________________________________________________ Dr.ª GABRIELA ALVES DE MACEDO (FEA/UNICAMP)
TITULAR
____________________________________________________ Dr. UELINTON MANOEL PINTO (UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO)
TITULAR
____________________________________________________ Dr.ª LUCIANA MORITA KATIKI (INSTITUTO DE ZOOTECNIA, SEDE)
SUPLENTE
____________________________________________________
Dr. RODNEY ALEXANDRE FERREIRA RODRIGUES (CPQBA/UNICAMP) SUPLENTE
____________________________________________________ Dr.ª VERA LUCIA GARCIA REHDER (CPQBA/UNICAMP)
SUPLENTE
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
À Deus,
À minha família,
Aos meus amigos,
Aos meus mestres,
dedico.
A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou
sobre aquilo que todo mundo vê”
(Arthur Schopenhauer)
“Alguns homens vêem as coisas como são, e dizem ‘Por quê? ’ Eu sonho com as
coisas que nunca foram e digo ‘Por que não?'”
(Geroge Bernard Shaw)
“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar,
divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”.
(Isaac Newton)
sabedoria e coragem para enfrentar o percurso e por ter colocado pessoas tão especiais ao meu redor!
À minha orientadora Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte pela oportunidade e por todo aprendizado adquirido. Por sempre me tratar com muito respeito, confiança e carinho. Por ser, além de uma grande profissional, uma pessoa humana e amiga, muito querida para mim! Ao meu esposo Fábio, por todo o seu incentivo, ajuda e compreensão.
Aos meus pais Manoel e Luzia, a minha irmã Camila e meu cunhado Leandro, e a minha linda sobrinha Sarah... pela presença e apoio!
Aos técnicos do laboratório da Divisão de Microbiologia do CPQBA Camila e Márcio, pelos ensinamentos, apoio e constante ajuda. Por terem sido pessoas fundamentais para a concretização deste estudo.
À Dra. Glyn Figueira, Dra. Ana Ruiz, Dr. Alexandre Ponezi, Dra. Renata Duarte, Dr. Rodney A. F. Rodrigues e Dr. Adilson Sartoratto por compartilhar comigo parte dos seus conhecimentos, por colaborarem durante a execução deste estudo e por inspirar-me, através dos seus exemplos, a amar a pesquisa e a sempre buscar a excelência em tudo o que fizer.
À querida professora Dra. Adriane E. Antunes de Moraes pela oportunidade de participar do Programa de Estágio Docente (PED) nas disciplinas de Higiene e Microbiologia de Alimentos I e II, no curso de Nutrição da Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA) da Unicamp nos anos de 2014 e 2015. Um período de muito aprendizado, de constante crescimento pessoal e profissional.
Aos professores da banca de qualificação Dra. Luciana Morita Katiki e Dra. Adriane E. Antunes de Moraes, pelas preciosas contribuições e dicas.
À todas as pessoas que conheci na Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) e no CPQBA: colegas, professores e funcionários.
Às estagiárias da Divisão de Microbiologia do CPQBA/Unicamp, Raquel, Beatriz e Priscila pela ajuda e colaboração.
Às minhas amigas Valéria, Renata, Angela Flores, Flávia, Angela Lopes, Ana Paula, Alessandra, Carol, Camila Possari, Laura, Vivi, Thamires e ao meu amigo Gustavo. Obrigada pela companhia e carinho. A amizade de todos vocês tornou a caminhada ainda mais prazenteira e especial!
Ao Cosme, à Andrea e aos demais funcionários da secretaria da pós-graduação da FEA/Unicamp, pela prestatividade e colaboração. Foram fundamentais na finalização desta tese.
Às queridas Dra. Cláudia R. Pozzi, Dra. Juliana P. Arcaro e (agora) Dra. Lívia Castelani do Instituto de Zootecnia / Nova Odessa-SP, pela colaboração e incentivo.
À Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Unicamp.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas - CPQBA/Unicamp, e suas respectivas Divisões: Microbiologia, Agrotecnologia, Química Orgânica e Farmacêutica, Química de Produtos Naturais, Recursos Microbianos, Bioprocessos, Química Analítica e Farmacologia e Toxicologia.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de doutorado.
À Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte, Profa. Dra. Adriane Elisabete Antunes de Moraes, a Profa. Dra. Cláudia Cardoso Netto, a Prof. Dra. Gabriela Alves Macedo e Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto membros titulares da Comissão Julgadora da Tese e ao Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues, Profa. Dra. Vera Lucia Rehder e Prof. Dra. Luciana Morita Katiki membros suplentes da Comissão pela disponibilidade e presença, antecipo-lhes meus sinceros agradecimentos.
À TODOS (sem exceção) que, durante esta trajetória, me acompanharam, me incentivaram, me orientaram, se doaram ou apenas existiram ao meu redor. Todos exerceram sua influência grande ou pequena e enriqueceram a minha vida e as minhas experiências. Meu muito obrigada!
infecciosas. Além de ser um sério problema na clínica médica humana e animal, bem como em alimentos, a espécie ocupa posição de destaque como agente infeccioso da mastite bovina. O surgimento de cepas resistentes aos tratamentos convencionais tem tornado o problema ainda mais preocupante. Nesta perspectiva, estudos envolvendo a busca por novos antimicrobianos a partir de fontes naturais têm demonstrado o potencial de espécies vegetais como uma das ações mais promissoras. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar a atividade de óleos essenciais obtidos a partir de 42 espécies medicinais e aromáticas pertencentes à Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas – CPMA, do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – CPQBA/Unicamp sobre 109 cepas de S. aureus associados à mastite bovina. As amostras microbiológicas foram isoladas de glândulas mamárias de animais em lactação a partir de um estudo conduzido no Instituto de Zootecnia de Nova Odessa - SP. Para a determinação da Concentração Mínima Inibitória (MIC) dos óleos essenciais foi empregado o método da microdiluição, através do qual foram avaliadas concentrações entre 0,015 e 1 mg. mL-1. Os óleos essenciais de melhor potencial anti-S. aureus foram os obtidos das espécies Cymbopogon citratus, Elyonurus muticus, Tetradenia riparia e Vetiveria zizanioides, que em seguida foram combinados entre si e testados contra 38 das cepas de S. aureus, escolhidas a partir de critérios pré-determinados. A ação dos melhores óleos e suas combinações também foi avaliada sobre a formação de biofilme e a atividade anti-proliferativa sobre células tumorais e normais. Os óleos mais ativos foram ainda analisados quimicamente através da cromatografia gasosa acoplada a espectofotômetro de massas-CG-EM. Dentre as combinações testadas, observou-se que aquelas contendo três óleos foram as mais ativas contra as cepas estudadas, com MIC entre 0,03 a 0,06 mg. mL-1. Nos testes de atividade anti-proliferativa todos os óleos exerceram ação inibitória sobre as células, entretanto o óleo de Elyonurus muticus desempenhou a melhor ação inibitória sobre as diferentes linhagens. Nos testes com biofilme, notou-se que os quatro óleos e suas respectivas combinações exerceram forte ação anti-aderência na faixa de concentração testada (0,06 - 1,0 mg. mL-1). Os resultados também evidenciaram a ocorrência do fenômeno hormesis em todos os ensaios com biofilme. As concentrações sub-MIC dos óleos essenciais e combinações foram capazes de estimular em mais que o dobro a formação do biofilme em relação ao seu controle.
Staphylococcus aureus species are very important in the context of infectious diseases and food industry. Cause serious problems in human and animal medicine, including bovine mastitis. The emergence of strains resistant to conventional treatments has made the problem even more disturbing. In this perspective, studies involving the search for new antibiotics from natural sources are very important. Thus, this study aimed to investigate the activity of essential oils obtained from 42 medicinal and aromatic species of the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA, the Multidisciplinary Center of Chemical, Biological and Agricultural Research - CPQBA / Unicamp on 109 S. aureus strains associated with bovine mastitis. Microbiological samples were isolated from mammary glands of lactating animals from a study conducted in the Animal Science Institute of Nova Odessa - SP. To determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of essential oils was employed microdilution method and measured between 0.015 and 1 mg. mL-1. Essential oils with best potential anti-S. aureus were obtained from species Cymbopogon citratus, Elyonurus muticus, Tetradenia riparia and Vetiveria zizanioides, which were then combined and tested against 38 strains of S. aureus, chosen from pre-determined criteria. The action of the best oils and their combinations was evaluated for biofilm formation and the antiproliferative activity on tumor and normal cells. The most active oils were also chemically analyzed by gas chromatography coupled to spectrophotometer mass-GC-MS. Of the combinations tested, it was observed that those containing three oils were more active with MIC of 0.03 to 0.06 mg. mL-1. In the antiproliferative activity test all oils exerted inhibitory effect on the cells, though the oil Elyonurus muticus played the best inhibitory effect on different strains. In tests with biofilm it was noted that the four oils and their combinations exerted strong anti-adhesion activity in the concentration range tested (0.06 to 1.0 mg. mL-1). The results showed the occurrence of hormesis phenomenon in all tests with biofilms. The sub-MIC concentrations of essential oils and combinations were able to stimulate more than twice biofilm formation relative to control.
Figura 1: Curva hormética representando as diferentes respostas fisiológicas diante da progressiva diluição de um composto. A) Concentração fatal; B) Sobrevivência com diminuição da atividade; C) Crescimento aproximado ao controle; D) Fase de crescimento acelerado (acima do controle); E) Crescimento aproximado ao controle (modificado de:
CALABRESE & BALDWIN, 1999) ...40
Figura 2: Obtenção dos óleos essenciais em sistema do tipo Clevenger...43
Figura 3: Eletroforese Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) perfis de S. aureus digeridos por SmaI isolado a partir de glândulas mamárias de novilhas e vacas. M: marcador molecular-DNA-PFGE λ 50000 pb; A1, A2, B, C, A3, A4, A5: perfil de PFGE. (CASTELANI, el al., 2013) ...44
Figura 4: Microplaca para avaliação do biofilme formado (cepa 104). As letras indicam os orifícios preenchidos com cada meio de cultura. (A) BHIe; (B) TSBe; (C) BHIp; (D) TSBp e (E) Controle dos Diluentes Tween®+DMSO...50
Figura 5: Fluxograma das atividades desenvolvidas...54
Figura 6: Atividade antiproliferativa da Doxorrubicina...61
Figura 7: Atividade antiproliferativa do OE de E. muticus...61
Figura 8: Atividade antiproliferativa do OE de C. citratus...62
Figura 9: Atividade antiproliferativa do OE de T. riparia...62
Figura 10: Atividade antiproliferativa do OE de V. zizanioides...63
Figura 11: Ação antiproliferativa da mistura física dos óleos de T. riparia e V. zizanioides ....63
Figura 12: Atividade anti-S. aureus (cepa 90) dos óleos voláteis em cada meio de cultura. A ausência da coloração vermelha indica inibição da atividade metabólica microbiana. 1) Muller Hinton (CLSI, 2005); 2) Brain Heart Infusion (BHI) enriquecido com 1 % glicose e 2 % NaCl; 3) BHI enriquecido com 10 % plasma humano e 4) Trypticase Soy Broth (TSB) enriquecido com 10 % plasma humano...71
Figura 13: Mecanismo sugestivo sobre a interferência do meio de cultura sobre a atividade antimicrobiana de óleos essenciais. A) Os constituintes do meio (CM) bloqueiam o acesso dos OEs sobre as células (efeitos físicos), B) Alteram as condições ótimas para a ação dos OEs (efeito químico) e C) Agem sobre as células modulando seu desempenho (síntese de toxinas / mecanismo compensatório em situações de injúria) (efeito biológico)...73
Figura 14: Determinação da MIC sobre a cepa de S. ureus 90: A) Microemulsão B) Mistura sem a técnica...74
Figura 17: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 104) ...78
Figura 18: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 40) ...79
Figura 19: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 78) ...80
Figura 20: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 28) ... 81
Figura 21: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 32)...82
Figura 22: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 100)...83
Figura 23: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 7)...84
Figura 24: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 123)...85
Figura 25: Efeito dos OEs sobre a formação de biofilme de S. aureus (Cepa 90)...86
Figura 26: Efeito dos óleos essenciais brutos sobre a formação de biofilme de S. aureus (ATCC 6538) ...87
Figura 27: Ilustração esquemática geral que expressa o efeito das concentrações (mg, mL-1) de óleos essenciais sobre a resposta estudada (aderência de S. aureus) ...92
Tabela 1: Plantas medicinais pertencentes à “Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas” - CPMA do CPQBA/UNICAMP estudadas...46 Tabela 2: Composição química de cada mistura, proporção equitativa...47 Tabela 3: Concentração Inibitória Mínima (MIC). Valores equivalem à porcentagem de cepas inibidas em cada concentração de óleo (mg. mL-1), n=110 cepas...56 Tabela 4: Análise química da composição dos óleos escolhidos. Resultados expressos em % relativa à composição total da amostra...58 Tabela 5: Concentração de amostra (µg/mL) responsável por inibir 100% do crescimento celular (Total Growth Inhibition – TGI) ... 60 Tabela 6: MIC (mg. mL-1) dos óleos essenciais brutos e das respectivas combinações sobre cepas de S. aureus do perfil genético A1...66 Tabela 7: MIC (mg. mL-1) dos óleos essenciais brutos e das respectivas combinações sobre cepas de S. aureus do perfil genético A2...67 Tabela 8: MIC (mg. mL-1) dos óleos essenciais brutos e das respectivas combinações sobre cepas de S. aureus do perfil genético A3, A4, A5, B, C e ATCC...68 Tabela 9: Frequência relativa % (F.R.) de cepas de S. aureus inibidas em cada concentração de óleo bruto, n=38...69 Tabela 10: Frequência relativa % (F.R.) de cepas de S. aureus inibidas em cada combinação de óleos, n=38...69 Tabela 11: Concentração Inibitória Mínima (MIC) (mg. mL-1) da mistura de óleos voláteis em cada meio de cultura:1) Muller Hinton, 2) BHIe (enriquecido com 1 % de glicose e 2 % NaCl),
3) BHI + 10 % plasma humano, e 4) TSB + 10 % plasma humano para inibição de S. aureus...70
Tabela 12: Resultados comparativos das duas técnicas de mistura de óleos essenciais em dois meios de cultura diferentes...74 Tabela 13: Produção de biofilme pelas cepas de S. aureus...75 Tabela 14: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 112 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...76 Tabela 15: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 75 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...77
Tabela 17: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 40 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...79 Tabela 18: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 78 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...80 Tabela 19: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 28 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...81 Tabela 20: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 32 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...82 Tabela 21: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 100 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...83 Tabela 22: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 7 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...84 Tabela 23: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 123 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...85 Tabela 24: Porcentagem de biofilme formado pela cepa de S. aureus 90 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...86 Tabela 25: Porcentagem de biofilme formado pela cepa ATCC 6538 em relação ao seu controle. Valores acima de 100% indicam concentração da amostra com atividade pró-aderência...87 Tabela 26: Concentração (mg. mL-1) mínima necessária para inibição de até 50% da aderência de S. aureus...88
AFB1 Aflatoxina B1
CCS Contagem de Células Somáticas
CG Cromatografia a Gás
CLAE Cromatografia Liquida de Alta Eficiência CPMA Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas
CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CTT Cloreto de Trifenil-Tetrazólio
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico EM Espectrometria de Massas GI Inibição do Crescimento
HR High Resolution
LC Lethal Concentration (Concentração Letal) MIC (CIM) Concentração Inibitória Mínima
MSSA Meticilina-sensíveis
OE Óleo essencial
WHO (OMS) World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
PMN Polimorfonucleares
RI Índice de Retenção
SDB Sabouraud Dextrose
SFB Soro Fetal Bovino
TGI Total Growth Inhibition (Inibição Total do Crescimento)
QS Quorum Sensing
2. OBJETIVOS ... 20
2.1. Objetivo Geral ... 20
2.2. Objetivos Específicos ... 20
3. REVISÃO DE LITERATURA ... 21
3.1. Mastite bovina ... 21
3.1.1. Mastite por S. aureus ... 23
3.1.2. Resistência antimicrobiana do S. aureus ... 24
3.2. A importância das plantas como agentes antimicrobianos ... 27
3.2.1. Atividade de óleos essenciais sobre os micro-organismos ... 28
3.2.2. Óleos essenciais selecionados a partir do screening inicial ... 31
3.2.2.1. Cymbopogon citratus ... 31
3.2.2.2. Elyonurus muticus ... 32
3.2.2.3. Tetradenia riparia ... 33
3.2.2.4. Vetiveria zinanioides ... 33
3.3. Atividade antiproliferativa dos óleos essenciais ... 33
3.4. Ocorrência de sinergismo e antagonismo entre diferentes óleos essenciais... 34
3.5. Fatores interferentes na ação antimicrobiana dos óleos essenciais ... 35
3.6. Efeitos moduladores dos óleos essenciais ... 36
3.7. Hormesis ... 39
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 42
4.1. Material ... 42
4.1.1. Espécies medicinais ... 42
4.1.2. Manutenção e cultivo das espécies da CPMA (Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas do CPQBA-UNICAMP) ... 42
4.1.3. Obtenção dos óleos essenciais ... 43
4.1.4. Micro-organismos. ... 43
4.1.5. Manutenção de S. aureus ... 44
4.1.6. Manutenção e cultivo das espécies da CPMA (Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas do CPQBA-UNICAMP) ... 44
4.1.7. Meios de Cultura ... 44
4.1.8. Antibióticos. ... 45
4.2. Métodos ... 47
4.2.4. Efeitos dos óleos essenciais e misturas sobre o biofilme de S. aureus ... 48
4.2.4.1. Produção de biofilme por S. aureus ... 48
4.2.4.2. Efeitos dos óleos essenciais e misturas sobre a aderência de S. aureus ... 50
4.2.5. Efeito do meio de cultura sobre a MIC da mistura dos óleos essenciais de V. zizanioides e T. riparia ... 51
4.2.6. Efeito da mistura física e da microemulsão preparada a partir da mistura de melhor atividade sobre a MIC. ... 51
4.2.7. Identificação dos constituintes químicos dos óleos essenciais de melhor atividade por cromatografia gasosa acoplaca a espectrômetro de Massas-CG-EM. ... 52
4.2.8. Determinação da citotoxicidde e atividade antiproliferativa dos óleos essenciais . 52 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 55
5.1. Atividade anti-S. aureus dos óleos essenciais estudados ... 55
5.2. Determinação dos constituintes químicos dos OEs selecionados por CG-EM ... 57
5.3. Análise toxicológica dos OEs selecionados ... 59
5.4. Avaliação da atividade antimicrobiana das combinações dos óleos de melhor atividade ... 64
5.5. Avaliação da atividade antimicrobiana da combinação dos óleos essenciais de T. riparia e V. zizanioides em diferentes meios de cultura ... 70
5.6. Avaliação da atividade antimicrobiana da combinação dos óleos essenciais de E. muticus, T. riparia e V. zizanioides preparadas mediante duas diferentes técnicas: mistura física dos óleos e microemulsão ... 73
5.7. Avaliação da atividade anti-aderência dos óleos brutos ... 75
6. CONCLUSÕES ... 93
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 94
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, a resistência de micro-organismos patogênicos aos tratamentos convencionais é um dos mais sérios problemas da saúde pública. De acordo com o relatório emitido pela Organização Mundial da Saúde (OMS, 2014) a resistência antimicrobiana de bactérias, parasitas, vírus e fungos tem ameaçado a prevenção e o tratamento eficaz de um número cada vez maior de infecções e que “sem uma ação urgente e conjunta estamos caminhando para uma era pós-antibiótica, onde infecções comuns e ferimentos leves podem voltar a matar”.
Entretanto, mesmo não desejada, a resistência microbiana é perfeitamente esperada. O histórico biológico dos micro-organismos tem revelado que sua alta plasticidade genômica é capaz de proporcionar-lhes um perfil adaptativo e flexível capaz de contornar praticamente qualquer condição adversa (RODRÍGUEZ-BETRAN et al., 2013). Assim, é fundamental que novas e constantes pesquisas sejam desenvolvidas a fim de que outras substâncias, incluindo as naturais, sejam descobertas e assim possam contribuir para contornar esta incontestável realidade biológica.
Inúmeros trabalhos evidenciam que produtos naturais representam a principal fonte de diversidade química durante a condução de novas descobertas no ramo farmacêutico (FIRN; JONES, 2003; MISHRA; TIWARI, 2011). Compostos naturais como os óleos essenciais (óleos voláteis) e extratos vegetais têm sido potencialmente capazes de inibir o crescimento de micro-organismos indesejados e patogênicos, bem como de micro-micro-organismos resistentes (BUTLER E BUSS, 2006). Os inúmeros compostos voláteis (incluindo os óleos essenciais) sintetizados e emitidos pelas plantas possuem a finalidade de defesa ou de atração de polinizadores e são, portanto, considerados como fontes em potencial de substâncias biologicamente ativas, principalmente contra micro-organismos, como bactérias, fungos filamentosos, leveduras e vírus (BUTLER E BUSS, 2006).
Estudos conduzidos no CPQBA/UNICAMP comprovam a atividade antimicrobiana de extratos e óleos essenciais de plantas pertencentes à Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas do CPQBA - CPMA frente a diferentes espécies e grupos de patógenos humanos e animais, incluindo bactérias Staphylococcus aureus.
Esta espécie (S. aureus) tem sido considerada de grande importância para a saúde humana e animal, responsável por um grande número de doenças e complicações nosocomiais. Também tem adquirido mecanismos de adaptação que possibilitam sua sobrevivência em
diversos tipos de ambientes além de conferirem resistência aos antibióticos (HOBBY et al., 2012). O espectro da doença inclui infecções cutâneas, pneumonia, endocardite, artrite séptica e osteomielite, além das intoxicações alimentares (LOWY, 1998; TSENG & STEWART, 2005).
Bactérias do gênero Staphylococcus também ocupam um papel de destaque na etiologia das infecções intramamárias do gado leiteiro. As espécies S. aureus, Escherichia coli e Streptococcus uberis estão entre os mais importantes patógenos associados à mastite bovina (PETON & LE LOIR, 2014), enquanto S. aureus tem sido mencionado como o principal patógeno das infecções clínicas e, o mais frequente, das infecções subclínicas. A combinação de fatores de virulência, a tendência destas infecções cronificarem-se e a aquisição de resistência aos antibióticos convencionais tem tornado o tratamento clínico bastante limitado (WATTS, 1988; BOOTH & HARDING, 1986; BRAMLEY et al., 1996; BRITO et al., 1999; SMITH-PALMER, 2004; BARDIAU et al., 2014).
Dentro desta perspectiva, o estudo do potencial antimicrobiano de novas moléculas, incluindo óleos e extratos vegetais tem se tornado cada vez mais importante, especialmente para o desenvolvimento de novos medicamentos. O fato dos óleos essenciais serem misturas complexas torna-os ainda mais versáteis como antimicrobianos, pois vários alvos na célula microbiana podem ser atingidos ao mesmo tempo e assim a aquisição da resistência e a adaptação microbiana tornam-se mais difíceis (DAFERERA, et al 2003).
Assim, todos os estudos abrangendo os compostos naturais e suas propriedades bioativas são de grande importância. A descoberta de novos e mais eficientes agentes antimicrobianos sobre S. aureus pode trazer consigo benefícios para diferentes áreas, incluindo a de alimentos, indústria farmacêutica e clínica médica (SMITH-PALMER, 2004).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Determinar a atividade de óleos essenciais provenientes de 42 plantas medicinais e aromáticas da CPMA frente a 109 cepas de S. aureus isolados de bovinos em lactação.
2.2. Objetivos Específicos
Estudar a atividade anti-S. aureus dos óleos essenciais, através da determinação da concentração mínima inibitória (MIC);
Avaliar a atividade anti-S. aureus de combinações dos óleos essenciais de melhor atividade, sobre células planctônicas e sobre o biofilme;
Analisar quimicamente os óleos essenciais de melhor atividade;
Avaliar a atividade antiproliferativa dos óleos de melhor atividade sobre células humanas das seguintes linhagens: (Tumorais): 2 = U251 (glioma); m = MCF-7 (mama); a = NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 = 786-0 (rim); 4 = NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); h = HT29 (colon); k = K562 (leucemia). (Normais): Linhagem não-tumoral humana: q = HaCat (queratinócito).
Avaliar a ação das combinações de melhor atividade dos óleos essenciais, preparados na forma de microemulsão, sobre células planctônicas e sobre o biofilme.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Mastite bovina
Considerando a crescente importância dada às infecções e ao desenvolvimento progressivo da resistência microbiana a drogas, muitos estudos têm buscado nos produtos naturais uma nova perspectiva para os tratamentos de doenças, incluindo a mastite bovina (GIBBONS, 2004). Caracterizada como um processo inflamatório da glândula mamária, esta afeta de forma significativa a pecuária leiteira nacional e internacional; acarretando efeitos negativos sobre a quantidade e a qualidade do leite (SHIM; SHANKS; MORIN, 2004; WILSON et al., 2004; CHAGUNDA et al., 2006; CAO et al., 2007). Embora a resposta inflamatória possa ser decorrente a uma injúria causada por agentes físicos, químicos ou biológicos, a mastite de origem infecciosa é mais prevalente (COSTA et al., 2000).
É consenso de todos os envolvidos que a mastite se apresenta como uma das mais complexas e dispendiosas doenças da indústria leiteira (PETON & LE LOIR, 2014). Sua alta prevalência, dificuldade de tratamento e complicações posteriores geram enormes prejuízos sobre a produção, saúde do gado e do consumidor. Seu efeito é notado principalmente pela redução na produção de leite e nas alterações na composição do leite, apresentando-se também como um risco potencial à saúde pública (MELCHIOR et al., 2006).
A mastite pode se manifestar na forma clínica, quando existem sinais evidentes da inflamação, como edema, dor, rubor e calor, e na forma subclínica, quando não existe alteração visível do leite ou úbere (BRADLEY, 2002). A mastite subclínica é caracterizada por um processo inflamatório moderado resultante do desequilíbrio entre a patogenicidade do agente infeccioso e os mecanismos celulares de defesa do animal, os quais contribuem consequentemente para o aumento variável da contagem de células somáticas (CCS) no leite (MECDONALD, 1979).
A mastite subclínica é uma grande preocupação para os produtores de leite devido à sua alta prevalência e característica assintomática. Animais com mastite subclínica são o principal reservatório do micro-organismo e o principal transmissor da doença no rebanho (BRADLEY et al., 2007; PETON & LE LOIR, 2014). O principal agente neste cenário é o S. aureus e mesmo quando são implementadas medidas de controle contra a mastite novas infecções subclínicas continuam ocorrendo, impossibilitando a erradicação da doença (ROBERSON et al., 1994).
Considerando a forma de transmissão, a mastite pode ser contagiosa ou ambiental. A primeira é caracterizada pela alta incidência de casos subclínicos, geralmente crônicos, com alta contagem de células somáticas (CCS) (COSTA, 2008). Os agentes etiológicos multiplicam-se no interior da glândula mamária, canal do teto ou sobre a pele e são transmitidos de uma vaca infectada para outra sadia, principalmente durante a ordenha. Seja através dos equipamentos da máquina de ordenha (teteiras), seja através das mãos dos manipuladores (ROBERSON et al., 1994; PETON & LE LOIR, 2014). Já a mastite ambiental é causada por agentes que vivem no habitat do animal, em locais que apresentam esterco, barro ou matéria orgânica (FREITAS et al., 2005).
Dos agentes contagiosos, os gêneros mais prevalentes são Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium e Mycoplasma (YAMAMURA et al., 2007). Os principais patógenos de origem ambiental são bactérias gram-negativas como a E. coli (presente nas fezes), Klebsiella (presente nos vegetais e derivados da madeira, tais como pó-de-serra) e Enterobacter, além das espécies de Streptococcus uberis e S. dysgalactiae (BRESSAN, 2000; BRASIL, 2012). S. aureus e S. agalactiae são classificadas como patógenos contagiosos de rápida propagação no rebanho, resultando em um grande número de quartos mamários infectados (SOMMERHÄUSER et al., 2003).
Diversas medidas de controle precisam ser adotadas para que haja um controle efetivo da mastite no rebanho. É importante que se estabeleça uma “linha de ordenha” dos animais de acordo com seu estado-sanitário, que os ordenhadores sejam treinados quanto às práticas higiênico-sanitárias, que procedam a desinfecção da superfície dos tetos com a realização do pré e pós-dipping (imersão completa dos tetos em solução desinfetante) e desinfecção das teteiras após a ordenha. Logo após o pós-dipping, o animal deve sair da sala e receber alimentação e água de boa qualidade. Essa prática faz com que o animal permaneça de pé durante o período em que o esfíncter do teto ainda não esteja completamente fechado (DIAS, 2007). Alguns autores também fazem referênciaao fornecimento de dietas balanceadas para a vaca, na intenção de aumentar a resistência imunológica do animal. Além disso, deve-se instituir o tratamento de vacas secas, o tratamento de vacas em lactação e o de novilhas no pré-parto (SILVA, 2003; DIAS, 2007).
Considerando todo o impacto negativo que a mastite pode causar sobre a pecuária leiteira, ela pode ser considerada, sem dúvida, um dos principais entraves para o desenvolvimento de um sistema produtivo sustentável. Assim, a atenção à prevenção e ao tratamento da mastite bovina são uma das principais medidas para garantir o crescimento e a viabilidade do setor.
3.1.1. Mastite por S. aureus
Embora S. aureus faça parte da microbiota normal de animais e dos seres humanos, a espécie pode induzir um largo painel de infecções variando entre doenças superficiais de pele até infecções profundas e septicemia. Praticamente qualquer espécie dos animais de sangue quente, pode ser portadora saudável ou ser infectada pela bactéria (PETON & LE LOIR, 2014). S. aureus destacam-se como micro-organismos causadores de mastites contagiosas de maior importância, maior ocorrência nos rebanhos mundiais e de tratamento mais difícil devido à elevada resistência aos antimicrobianos. As infecções intramamárias causadas pelo S. aureus geralmente resultam em mastites subclínicas e podem progredir para manifestações clínicas, ao incluir sinais sistêmicos, particularmente nas novilhas e no período pós-parto (RADOSTITS et al., 2002).
Além disso, a mastite por S. aureus pode ser considerada um potencial risco para a saúde pública uma vez que metade das cepas de S. aureus isoladas possuem genes para produção de enterotoxinas. Estas toxinas quando excretadas pela bactéria podem permanecer estáveis nos produtos lácteos finais levando a um potencial risco de intoxicação estafilocócica para o consumidor final (CARDOSO; CARMO; SILVA, 2000; FAGUNDES & OLIVEIRA, 2004; PETON & LE LOIR, 2014).
Considerando as características do gênero, os estafilococos são microrganismos mesófilos, com temperatura de desenvolvimento de 7 a 48º C, com ótima de 37º C e pH na faixa de 4,0 a 10,0. Como característica morfológica e bioquímica pode-se destacar: cocos Gram-positivos, não formadores de esporos, imóveis, anaeróbios facultativos, apresentando metabolismo fermentativo com produção de ácido e não de gás, não fotossintético, catalase-positivos (BUCHANAN & GIBBONS, 1974).
A sequência de eventos no processo infeccioso da mastite por S. aureus tem sido descrita na literatura como um conjunto de etapas que incluem: a contaminação da ponta do teto, o acesso e multiplicação das bactérias ao lúmen da glândula mamária, adesão e invasão das células mamárias epiteliais (CME), colonização e multiplicação nos tecidos do hospedeiro. É observado que um pequeno número de UFC (menos do que 100) disseminadas ao longo do canal do teto já é o suficiente para induzir uma mastite mesmo em uma glândula mamária saudável. Assim, é sugerido consequentemente que o canal do teto seja uma das principais estruturas físicas de proteção do úbere (PETON & LE LOIR, 2014).
Os patógenos do gênero Staphylococcus podem resistir à fagocitose, penetrarem e se instalarem profundamente nos tecidos da glândula mamária, formando microabcessos.
Também são capazes de sobreviverem no interior dos fagócitos e células mamárias epiteliais (CME) e assim dificultarem a ação dos antibióticos comumente utilizados no tratamento da mastite (PETON & LE LOIR, 2014). Tem sido demonstrado que tanto as CME como os macrófagos isolados no leite das glândulas infectadas contêm células de S. aureus, e na maior parte dos casos estas bactérias são cultiváveis, indicando que elas podem sobreviver no interior das células após a invasão (HEBERT et al., 2000).
3.1.2. Resistência antimicrobiana do S. aureus
É amplamente mencionado que a resistência bacteriana causa impacto negativo em diversos setores da sociedade, levam ao aumento das taxas de mortalidade, de morbidade e dos custos com tratamentos. Neste cenário, é cada vez mais claro que a má utilização dos antibióticos, seja de forma excessiva ou incorreta, na medicina humana, veterinária e na agricultura tem contribuído para o surgimento global de bactérias patogênicas de alta resistência (PASTOR-SÁNCHEZ, R., 2006; RODRÍGUEZ-BELTRAN et al., 2013).
Já se sabe que a resistência aos antibióticos pode ocorrer através de várias formas, incluindo a alteração do seu sítio de ação, alterações na permeabilidade celular e de efluxo e transferência horizontal de genes de resistência (RODRÍGUEZ-ROJAS, et al., 2013). Observa-se que a resistência bacteriana pode Observa-ser transferida por mecanismos diversos, podendo estabelecer-se entre micro-organismos de uma mesma população ou de diferentes populações, como da microbiota animal para humana e vice-versa (BACCARO et al., 2002).
Neste sentido, há um crescente interesse público e científico relacionado à administração terapêutica e subterapêutica de antimicrobianos em animais de produção (WHITE e McDERMOTT, 2001; CAO et al., 2007). Sabe-se que, além do problema da resistência, o uso generalizado de antibióticos na criação de animais relaciona-se intimamente com a presença dos seus resíduos na cadeia alimentar (GUTERBOCK et al., 1993; WHITE e MCDERMOTT, 2001; TOLLEFSON e FLYNN, 2002, SHRYOCK & RICHWINE, 2010).
Embora a eficácia clínica de um antimicrobiano seja de quantificação muito difícil, devido as grandes variações na resposta individual e do rebanho, tipo de micro-organismo envolvido, localização dos sítios infectados, grau de resposta do tecido mamário, duração da infecção além de outros fatores (REBHUM, 2000), estudos mostram aumento crescente no padrão de resistência no tratamento da mastite bovina, principalmente para S. aureus (LANGONI et al., 1991; BRITO & BRITO, 1996). Estes patógenos podem se alojar dentro de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e permanecerem ali como bactérias dormentes, sendo
assim, menos susceptíveis a antibióticos como penicilinas e cefalosporinas (MELCHIOR, 2006).
A dificuldade de erradicação do S. aureus do rebanho leiteiro também pode estar associada à infecção por clones altamente transmissíveis e resistentes aos antibacterianos. Alguns dos fatores de virulência importantes neste aspecto são: a proteína A e a formação de biofilme (WALDVOGEL et al., 1995; AGUILAR et al., 2001). A proteína A é encontrada na parede celular do S. aureus e atua como fator de virulência interferindo na opsonização e na fagocitose dos micro-organismos pelos leucócitos polimorfonucleares, ativando o complemento e estimulando reações imunológicas. Já as cepas produtoras de biofilme apresentam uma capacidade de aderência e colonização da superfície epitelial da glândula mamária significativamente aumentada quando comparada às variantes não produtoras (AGUILAR et al., 2001).
A formação do biofilme é um processo organizado em duas etapas e pode ser simplificado da seguinte maneira: na primeira as células microbianas aderem a uma superfície biótica ou abiótica (fixação inicial reversível), na segunda as células produzem a matriz extracelular (contendo polissacarídeos, proteínas e DNA) e se ligam firmemente à superfície, fase conhecida como biofilme maduro. As células presentes no biofilme são fenotipicamente e fisiologicamente diferentes das células livres (planctônicas) e uma das suas propriedades típicas, como já mencionado, é a sua maior resistência aos agentes antimicrobianos (COENYE & NELIS, 2010). Nos estudos sobre biofilme, as questões como: adesão, motilidade celular, quorum sensing (QS), produção de polissacarídeos, hidrodinâmica e morte celular estão entre os mais importantes temas (FAGERLIND et al., 2012).
O biofilme confere às bactérias um microambiente no qual permanecem em estado de dormência metabólica protegidas do sistema imune do indivíduo e da exposição aos antibióticos (AGUILAR et al., 2001; HOBBY, 2012). Estudos “in vitro” realizados por Amorena et al. (1999) demonstraram que as bactérias nos biofilmes se tornaram mais resistentes aos efeitos dos agentes antimicrobianos quando comparadas com as células livres das mesmas estirpes. Os mecanismos responsáveis pela resistência dos micro-organimos nos biofilmes aos agentes antimicrobianos incluem: seu crescimento lento, demora na penetração de agentes antimicrobianos através da sua matriz extracelular polimérica e mudanças fisiológicas (TAPIA & YEE, 2006; MELO, 2008).
A importância dos biofilmes se estende por vários setores, na clínica médica aproximadamente 65 a 80% de todas as infecções humanas estão relacionadas com o surgimento do biofilme. Ele tem sido considerado como uma importante causa na falha dos
tratamentos com antimicrobianos e o principal responsável pela persistência das infecções crônicas (COENYE & NELIS, 2010; HOFFMAN, et al., 2005), também são responsáveis por causarem contaminação nas superfícies de cateteres e equipamentos das indústrias de alimentos (DONLAN & COSTERTON, 2002; DANESE, 2002; SZCZEPANSKI & LIPSKI, 2014).
S. aureus e Staphylococcus epidermidis frequentemente causam infecções associadas ao biofilme em seres humanos, ocasionando diversos prejuízos para o sistema de saúde principalmente devido à resistência da infecção aos tratamentos convencionais e a frequente necessidade de remoção de tecidos ou dispositivos médicos afetados (BOLES & HORSWILL, 2011), incluindo cateteres válvulas cardíacas, marca-passos e articulações artificiais (SMITH, 2005).
Santos (2003) constatou a presença de Staphylococcus spp. em 134 amostras de leite provenientes de vacas com mastite clínica e subclínica. Dentre as cepas, 38 cepas apresentaram resistência à oxacilina no teste de difusão em disco, em 40,54 % a resistência foi confirmada pela concentração mínima inibitória e em 33,78 % foi detectado o gene, mais de 70 % das cepas de S. aureus e S. epidermidis mostraram-se resistentes à penicilina. Costa, (2008) estudando a diversidade populacional de 352 amostras de S. aureus obtidas de 35 rebanhos leiteiros do sul de Minas Gerais encontrou em testes de antibiograma 54 padrões de resistência, sendo os maiores índices de resistência foram para a penicilina, ampicilina, polimixina B, tetraciclina e lincomicina.
O surgimento de cepas com múltipla resistência nas últimas décadas está relacionado com a pressão seletiva exercida por antimicrobianos (FAGUNDES & OLIVEIRA, 2004). O uso inadequado de antibióticos tem propiciado o desenvolvimento de cepas multi-resistentes, fatores que tem comprometido a eficiência do tratamento da mastite bovina (BARBERIO et al., 2002).
Estudos epidemiológicos revelam que após o tratamento com agentes antimicrobianos as taxas de cura no rebanho podem variar de 0 % a 80 %, e parecem depender de fatores como micro-organismo envolvido, a idade, paridade, estágio de lactação e a contagem de células somáticas (CCS). Enquanto que as taxas de cura de infecções causadas por Streptococcus dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis e E. coli podem variar entre 33 % e 100 %, as infecções por S. aureus, em particular, são refratárias ao tratamento (MELCHIOR et al. 2006). Algumas características do S. aureus como a produção de barreira exopolissacarídica e sua localização frequente em micro abscessos, podem limitar a ação das drogas (CONTRERAS et al., 2000).
3.2. A importância das plantas como agentes antimicrobianos
Medidas preventivas para o controle da transmissão de S. aureus em propriedades leiteiras são largamente praticadas, entretanto a infecção por este patógeno é ainda muito comum, caracterizada muitas vezes por pequena resposta a terapia com agentes antimicrobianos. Nos últimos anos o surgimento de estafilococos multiresistentes constitui um problema relevante no controle de infecções e terapêutica, particularmente na medicina veterinária (RÜDINGER, 2005). O problema da resistência tem se tornado mais grave devido às dificuldades para a descoberta e o lançamento de novos antimicrobianos no mercado (PHELPS, 1989).
Assim, o aumento de falhas nos tratamentos com antimicrobianos convencionais e a busca por alternativas eficientes e seguras tem estimulado a busca por novas moléculas bioativas a partir de produtos naturais, incluindo os óleos voláteis e os extratos de plantas (TAYLOR; 1993; BURT, 2004). Considerando a sua gama incomparável de diversidade química, os produtos naturais provêem ilimitadas oportunidades de uso (KLANČNIK, et al. 2010).
As substâncias orgânicas originadas de fontes naturais são utilizadas há muito tempo no tratamento de enfermidades. Plantas, fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, sendo que a maioria dos fármacos em uso clínico é de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos naturais (BARREIRO e BOLZANI, 2009).
Sendo assim, as plantas representam uma fonte de produtos naturais biologicamente ativos com uma ampla gama de diversidade quanto à estrutura e às propriedades físicoquímicas e biológicas (GUERRA & NODARI, 2001). Ricas em propriedades terapêuticas são de grande relevância na medicina em todo o mundo, principalmente nos países em desenvolvimento onde as drogas são importadas, de alto custo e na maioria das vezes inacessíveis a grande parte da população (SANTANA et. al., 2008).
Os óleos essenciais estão incluídos neste contexto e possuem destacado potencial antimicrobiano, além de serem naturais e biodegradáveis, apresentarem baixa toxicidade para mamíferos e terem a capacidade de atuar sobre várias moléculas-alvo ao mesmo tempo (BURT, 2004; CALO, et al. 2015). Seu uso bem como sua caracterização química, vem ganhando destaque em processamento de alimentos e aplicações farmacêuticas (SOKMEN et al., 1999; REYNOLDS, 1998), sendo de grande interesse como soluções alternativas para o tratamento de doenças infecciosas (REYNOLDS, 1998).
As investigações tem incluido diferentes óleos essenciais contra uma ampla gama de bactérias (Gram-negativas e Gram-positivas), incluindo as espécies resistentes a antibióticos, espécies de fungos e leveduras (JIMANEZ-ARELLANES et al., 2003.; HAMMER; CARSON; RILEY, 1998; HAMMER; CARSON; RILEY, 1999;. NELSON, 1997).
No Brasil, o estudo sobre plantas aromáticas é bastante extenso e o número de plantas conhecidas para a produção de óleos essenciais abrange desde plantas rasteiras, como a hortelã, até plantas de porte arbóreo, como é o caso do eucalipto (VITTI & BRITO, 2003).
Em relação a estudos envolvendo plantas medicinais e mastite bovina, recentemente Fratini e colaboradores (2014) estudaram o potencial antimicrobiano de dez óleos essenciais comerciais, entre eles os obtidos a partir de Cinnamomum zeylanicum, Citrus bergamia, Eucalyptus globulus, Origanum majorana, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis, Thymus vulgaris, sobre as bactérias S. aureus, E. coli, entre outras responsáveis pela mastite em animais. Os pesquisadores observaram que os melhores resultados foram obtidos a partir dos óleos essenciais de S. montana, T. vulgaris e O. vulgare.
É importante ressaltar que, embora muitas pesquisas apresentem expectativas promissoras sobre ação de compostos isolados de plantas e sua influência na eliminação de micro-organismos patogênicos (TEPE et al., 2005), o entendimento dos processos relacionados ao surgimento da resistência, o estudo de novos agentes antimicrobianos potentes e sua posterior aplicação terapêutica representam diferentes níveis na pesquisa e dependem de estudos contínuos e interligados (MACIEL et al., 2002; SILVEIRA et. al, 2006).
3.2.1. Atividade de óleos essenciais sobre micro-organismos
Os óleos essenciais são compostos voláteis naturais, caracterizados por um forte odor, produzidos por plantas aromáticas como metabólitos secundários e contém de 20 a 60 componentes em diferentes concentrações. Eles estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal, incluindo a de defesa (SIQUI et al., 2000). O grupo principal de compostos é constituído de terpenos e terpenóides (geraniol, sabineno, timol, carvacrol e outros) e os outros constituintes de peso molecular mais baixo são compostos aromáticos e alifáticos (álcoois, aldeídos, fenóis e outros). Os óleos essenciais são conhecidos pela fragrância e propriedades fungicidas, antivirais, bactericidas e medicinais e podem ser utilizados como antimicrobianos, analgésicos, sedativos e anti-inflamatórios (BAKKALI et al., 2008).
Entretanto, a eficiência antimicrobiana dos óleos essenciais de uma mesma espécie de planta é frequentemente afetada pelas condições climáticas durante o crescimento e colheita, a época da colheita, características genotípicas da espécie e localização geográfica onde as plantas são cultivadas (MILITELLO et al., 2011). A produção dos metabólitos secundários, incluindo os óleos essenciais, representa uma resposta da planta às condições ambientais e genéticas a que está exposta (GOBBO NETO; LOPES, 2007). A produção dos metabólitos secundários, sob o controle simultâneo de dois padrões de resposta: um de maior dimensão e mais lento provocado pelas variações climáticas sazonais, e outro de menor alteração, porém mais rápido influenciado pelas flutuações climáticas diárias (LUZ; EHLERT; INNECCO, 2009).
Um dos principais ramos de estudos com óleos essenciais abrange suas propriedades antifúngicas e antibacterianas (BHAVANANI; BALLOW, 1992), acredita-se que a causticidade e toxicidade dos mesmos é o que justifica sua ação sobre os micro-organismos (WERNER, 2002). Por serem naturalmente lipofílicos os OEs permeiam e desestabilizam facilmente a parede e membrana celular, interagindo com polissacarídeos, ácidos graxos e fosfolípideos. Fazem as membranas bacterianas mais permeáveis, de modo que a perda de íons e de conteúdos celulares levem a célula a morte. Outros importantes mecanismos de ação incluem, a desnaturação de proteínas citoplasmáticas e a inativação de enzimas (RAUT & KARUPPAYIL, 2014). Alguns componentes específicos encontrados em óleos essenciais têm sido identificados como agentes antimicrobianos, como carvacrol, timol, eugenol, terpineno, linalol e carvona (BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004; HUSSAIN et al., 2008; PASCUAL et al., 2001).
Pesquisadores têm extraído óleos essenciais de diversas plantas tais como: O. vulgare (orégano), T. vulgaris (tomilho), C. zeylanicum (caneleira), Lippia alba, Ocimum basilicum (manjericão) e Salvia offiicinalis (sálvia), os quais mostraram atividade antimicrobiana frente a vários microrganismos, incluindo por exemplo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, S. aureus, E. coli, Fusarium verticillioides, B. subtilis, Salmonella typhimurium, e outros (PASCUAL et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006; BUSATTA et al, 2007; SANTURIO et al., 2007; HUSSAIN et al., 2008; MUNÕZ et al, 2009; SILVA et al., 2009; SOUZA et al., 2011; DAMBOLENA et al., 2010).
Craveiro et al. (1981), constatou excelentes resultados para E. coli e S. aureus, utilizando óleo essencial de cravo-da-índia (Eugenia caryophyllata). Os autores atribuíram as excelentes propriedades bactericidas, ao eugenol, componente majoritário encontrado em
80-90% no óleo essencial dessa planta. Segundo ele, o eugenol provoca a deterioração e lise celular, além da inibição na produção de amilase e proteases pela célula. Atualmente, o eugenol tem sido largamente estudado como conservante de alimentos.
Simões e colaboradores (2002) analisaram o efeito do óleo de Melaleuca alternifolia sobre a infecção estafilocócica in vitro e in vivo. Os autores observaram diferenças estatisticamente significantes (p<0,05) entre os grupos testes e concluíram que o óleo essencial de M. alternifolia tem propriedades antimicrobianas in vitro sobre cepas de estafilococos resistentes e in vitro/in vivo sobre o estafilococo sensível às penicilinas.
Burt (2004) trabalhou com o óleo essencial de orégano. Ele observou que os princípios ativos (timol e o carvacrol) provocam distorção na estrutura física da célula microbiana, causando expansão e consequente desestabilidade na membrana, modificando sua permeabilidade, desnaturando enzimas essenciais e alterando a força próton motora, por meio de variações no pH e potencial elétrico.
Ferronatto e colaboradores (2007) estudaram a atividade antimicrobiana de óleos essenciais produzidos por Baccharis dracunculifolia e B. uncinella (Asteraceae) e observaram que ambos os óleos avaliados apresentam atividade antimicrobiana sobre S. aureus, E. coli e Pseudomonas aeruginosa.
Alguns pesquisadores têm verificado que o óleo de manjericão (O. basilicum) apresenta atividade antimicrobiana frente à S. aureus, Bacillus subtilis, E. coli e Aspergillus niger, e sua atividade antimicrobiana foi associada em parte à presença de elevadas quantidades do componente linalol (HUSSAIN et al., 2008).
Aquino e colaboradores (2010) ao avaliarem a atividade antimicrobiana de dois diferentes óleos essenciais frente a bactérias isoladas da carne bovina observaram que o óleo essencial de L. alba demonstrou atividade antimicrobiana sobre todas as cepas de S. aureus testadas. O óleo essencial apresentou ação bacteriostática e ao mesmo tempo bactericida nas concentrações de 0,39 μg/mL, 0,78 μg/ mL e 1,56 μg/mL (valores iguais para a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (CBM)), sendo a maioria das cepas inativadas na concentração de 1,56 μg/mL. A atividade antimicrobiana do óleo de L. alba é em parte atribuída a presença de limoneno, pois este tem demonstrado eficiência como inibidor do crescimento microbiano dos micro-organismos S. aureus, S. epidermidis e E. coli (BAKKALI et al., 2008).
Domingues e colaboradores (2011) estudaram a atividade biocida do óleo essencial de Cardamomo (Elettaria cardamomum), sobre Bacillus cereus ATCC 11779 e ATCC 14579. Os autores observaram que o óleo essencial apresentou efeito bacteriostático na maioria das
concentrações testadas para as duas cepas avaliadas. A concentração inibitória mínima (MIC) foi de 31 μl/mL para B. cereus ATCC 11778 e 15 μl/mL para B. cereus ATCC 14579. Os resultados obtidos sugeriram que o óleo essencial pode figurar como alternativa para o controle do crescimento de diferentes cepas de B. cereus na indústria de alimentos, surgindo como barreira adicional à sobrevivência microbiana nos produtos alimentícios.
Qiu e colaboradores (2011) observaram que o óleo de Perilla frutescens (L.) Britton reduziu a produção de alfa-toxina, a presença de enterotoxinas A e B e a toxina do choque tóxico 1 (TSST-1) em S. aureus meticilina-sensíveis (MSSA) e S. aureus meticilina-resistentes (MRSA). Os autores concluíram que o óleo de perilla tem ação bactericida e que poderia ser aplicado em sistemas de alimentos como conservante alimentar, tanto para inibir o crescimento de S. aureus como para reprimir a produção de exotoxinas.
Embora não exista uma padronização quanto ao nível de inibição aceitável para produtos naturais quando comparados com antibióticos padrões, Duarte et al. (2005) baseados na proposição de Aligianis et al. (2001), propuseram a seguinte classificação para materiais vegetais: elevada inibição - MIC de até 0,5 mg. mL-1; moderada inibição – MIC entre 0,6 e 1,0 mg. mL-1 e baixa inibição - MIC acima de 1,0 mg. mL-1.
3.2.2. Óleos essenciais selecionados a partir do screening inicial
3.2.2.1. Cymbopogon citratus
A espécie Cymbopogon citratus (DC.), conhecida popularmente no Brasil como capim-santo, capim-limão, capim-cidrão, erva-cidreira e capim-cidró tem sido referida como tendo propriedades anti-hipertensiva, antiasmática, antitérmica, antisséptica, antiparasitária, antirreumática, miorrelaxante e antiespasmódica. O óleo volátil de C. citratus apresenta diversas classes de metabólitos secundários com uma ampla variedade de atividades biológicas, incluindo a antimicrobiana (DUARTE et al., 2005; SANTOS et al., 2009; SHAH et al., 2011).
A espécie C. citratus tem apresentado ação inibitória sobre uma grande variedade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo E. coli, Proteus vulgaris, e Klebsiella pneumonia, Aspergillus spp, Haemophilus influenza, P. aeruginosa, S. aureus e Streptococcus pyogenes. Além das espécies de Candida albicans, B. subtilis, Neisseria gonorreia, Salmonella enterica, S. typhi e Shigella sonnei (EKPENYONG, et al., 2015).
3.2.2.2. Elyonurus muticus
O gênero Elyonurus Humb. et. Bompl ex. Willd (Gramineae) é comum nas regiões tropicais e subtropicais da América do Sul, África e Austrália. A espécie tem sido empregada como planta medicinal e aromática na Argentina, na Bolívia e no Uruguai. No Brasil, a planta é nativa do Pantanal, popularmente conhecido como "capim-carona".
A maioria dos estudos com E. muticus trata principalmente dos seus aspectos negativos relacionados às pastagens. De acordo com Santos e colaboradores (2005), as pastagens nativas do Pantanal, incluindo o capim-carona, têm contribuído negativamente para a pecuária da região. É observado que os bovinos preferem pastar em áreas com predominância de espécies de porte baixo, de maior valor nutritivo, diferente das características encontradas no capim-carona: uma erva que atinge até um metro de altura e apresenta compostos secundários capazes de inibir o seu consumo pelos bovinos ou transmitir o seu sabor amargo para o leite dos animais. Assim, regiões com capim-carona são periodicamente queimadas pelos agricultores, os quais consideram esta planta um problema para a criação de gado (SANTOS et al., 2005).
Segundo VILLARES (1966), o fogo sempre foi um instrumento importante na exploração de pastagens nativas. No entanto o uso da queima possui implicações antagônicas, trazendo consigo vantagens e desvantagens. Conforme PUPO (1979) e CROWDER e CHHEDA (1983) as principais vantagens são: controle da invasão de plantas indesejáveis (principalmente arbustos), remoção da vegetação velha e fibrosa que é rejeitada pelos animais, prevenção de incêndios pela remoção da vegetação seca e velha, destruição de ectoparasitas (carrapatos e mosca do berne), além de melhorar a movimentação dos animais e sua distribuição nas pastagens. Dentre as principais desvantagens incluem-se a remoção da parte aérea das plantas, com esgotamento das reservas disponíveis para o crescimento, efeito adverso no conteúdo de água do solo, principalmente por reduzir a infiltração e elevar as perdas e a evapotranspiração, aumento de perdas por erosão, principalmente em terrenos declivosos, perdas de nitrogênio orgânico e matéria orgânica, eliminação de insetos que são inimigos naturais de pragas e ocorrência de incêndios pelo uso não controlado do fogo (RODRIGUES et al., 2002).
Dentro deste contexto e sob a ótica da sustentabilidade, a investigação das propriedades bioativas de E. muticus poderiam redirecionar as atuais estratégias de queimada e conferir maior aplicabilidade à esta espécie. Silva e colaboradores (2009) demonstraram o potencial antimicrobiano do óleo essencial de E. muticus, o qual apresentou forte inibição para
a levedura C. albicans. Sabini e colaboradores (2006) comprovaram o efeito fungicida de três quimiotipos desse óleo, ou seja, acorenona, citral e geranial sobre seis diferentes linhagens de Candida spp.
3.2.2.3. Tetradenia riparia
Tetradenia riparia (Hochstetter) Codd, é um arbusto herbáceo que ocorre em toda a África tropical. A espécie tem sido tradicionalmente utilizada no tratamento da tosse, diarréia, febre, dores de cabeça, malária e dor de dente (GAIROLA, et al., 2009). O óleo essencial de T. riparia é uma mistura complexa de monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos e exibe propriedades inseticida, acaricida, antimalárica e antimicrobiana (CARDOSO, et al., 2015). No Brasil, T. riparia foi introduzida como planta ornamental exótica e é cultivada principalmente em parques, jardins e pomares domésticos. Ela é popularmente conhecida como incenso, lavândula, limonete, pluma-de-névoa ou falsa mirra e é usada principalmente como planta ornamental (GAZIM et al., 2010).
3.2.2.4. Vetiveria zizanioides
A espécie Vetiveria zizanioides (L.) Nash é uma espécie nativa do subcontinente indiano introduzida em muitos outros países. As raízes são usadas como estimulantes, diurético, antiespasmódico, para o controle de febres, inflamações e irritabilidade do estômago. O óleo de vetiver tem extensas aplicações na indústria de cosméticos, perfumaria e aromaterapia e também possui propriedades antimicrobianas e antifúngicas na indústria farmacêutica (BHUIYAN et al., 2008).
3.3. Atividade antiproliferativa dos óleos essenciais
As pesquisas envolvendo produtos naturais e o tratamento de doenças tem gerado expectativas promissoras para a comunidade científica, inclusive nas terapias contra o câncer. Produtos vegetais possuem uma longa história de uso nesta área e podem fornecer informações importantes para o desenvolvimento de drogas antineoplásicas (KHAZIR, et al.,2014).
Alguns óleos essenciais têm sido citados por suas propriedades anticancerígenas. Constatou-se que os compostos α-mirceno, α-limoneno e geraniol, presentes no C. citratus possuem atividade antitumoral contra vários tipos de células, incluindo as mamárias, hepáticas
e intestinais (EKPENYONG, et al., 2015). Também tem sido observado que em paralelo aos seus efeitos antineoplásicos encontram-se os seus efeitos tóxicos (VANDEBROEK, et al., 2004). Estes que podem ser imediatos, e facilmente correlacionados a sua ingestão, ou de longo prazo e assintomáticos (SIMÕES, et al., 2007).
Ensaios de citotoxicidade in vitro, realizados em cultura de células tumorais, são importantes para a avaliação de agentes anticâncer, principalmente durante a fase de triagem reduzindo a experimentação em animais (CINGI, et al., 1991). Sistemas de cultura de células in vitro não só podem imitar o estado fisiopatológico de várias doenças, como também podem fornecer informações úteis sobre a boa previsibilidade de compostos bioativos in vivo, bem como nos perfis de toxicidade (RAUSCH, 2006), além de ser possível a avaliação de um maior número de substâncias em um menor tempo (SUGGITT; BIBBY, 2005). Geralmente esses ensaios citotóxicos fundamentam-se em comparar a taxa de proliferação de uma linhagem celular, na presença e ausência de uma substância teste. Nesses ensaios, diferentes linhagens de células podem ser usadas, inclusive células não neoplásicas a fim de avaliar uma possível seletividade (HOUGHTON, et al., 2007).
É consenso geral que a aplicação clínica das substâncias bioativas vegetais deve ser precedida por testes de toxicidade (DEVIENNE ET AL., 2004; FONTE ET AL., 2004). É necessário esclarecer os mecanismos e as condições que mediaram o efeito biológico, antes que as plantas, ou substâncias obtidas destas, sejam consideradas agentes terapêuticos (VARANDA, 2006). Nesta perspectiva de investigação, os testes de citotoxicidade in vitro em cultura de células tem ganho cada vez mais importância (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991; CINGI et al.,1991).
3.4. Ocorrência de sinergismo e antagonismo entre diferentes óleos essenciais
Alguns pesquisadores avaliam também a ocorrência de sinergismo ou antagonismo entre diferentes óleos essencias. A interação entre óleos essenciais pode representar uma alternativa para potencialidade da ação dos mesmos, porém, muito ainda precisa ser esclarecido. Estudos de Harris (2002) ao examinarem a combinação efetiva entre óleos de Melaleuca (Melaleuca alternifolia e M. quinquenervia) e a fração polar de Manuka (Leptospermum scoparium), observaram um efeito bactericida superior àquele observado nos óleos estudados individualmente.
Dias e colaboradores (2011c) avaliaram a atividade antibactericida da combinação dos óleos de O. vulgare (orégano), C. citratus (capim limão) T. vulgaris (tomilho branco) sobre
Clostridium perfringens tipo A. Ao analisarem o sinergismo dos óleos essenciais de orégano, tomilho e capim-limão os autores observaram o efeito antibactericida aumentando à medida que havia maior concentração de óleo de orégano na MIC na solução e menor quantidade de óleo de capim-limão. Em outro trabalho os autores avaliaram o sinergismo da combinação dos óleos essenciais de O. vulgare (orégano), Syrygium aromaticum (cravo da índia) e T. vulgaris (tomilho branco), sobre C. perfringens tipo A. Ao analisarem a combinação dos óleos de orégano, cravo e tomilho, os autores observaram maior zona de inibição quando o óleo de orégano estava mais próximo da sua MIC, tendo menor zona de inibição com a associação aos demais óleos, não observando sinergismo nas combinações dos três óleos essenciais (DIAS et al., 2011b)
Outro estudo avaliou efeito antimicrobiano da combinação dos óleos de tomilho (T. vulgaris), cravo-da-índia (S. aromaticum) e capim-limão (C. citratus) sobre C. perfringens tipo A. A combinação dos óleos de tomilho, capim-limão e cravo demonstraram um aumento dos halos de inibição à medida que havia menores quantidades de capim-limão (DIAS, et al., 2011a).
Assim, destaca-se a importância da avaliação de possíveis interações entre diferentes óleos essenciais, seja esta sinérgica ou antagônica. As interações podem potencializar o efeito, podendo ser úteis para a indústria e para a medicina clínica, ou podem inibir os efeitos e por isso devem ser evitadas. Este tipo de estudo torna-se, portanto, uma ferramenta importante no desenvolvimento de novas estratégias de controle e combate a infecções.
3.5. Fatores interferentes na ação antimicrobiana dos óleos essenciais
Considerando o crescente interesse por compostos naturais com potencial antimicrobiano, tem se tornado cada vez mais necessárias investigações sobre quais variáveis seriam capazes de interferir nos ensaios biológicos (NASCIMENTO et al. 2007). É sabido que a composição e atividade dos óleos voláteis podem ser modificadas tanto por fatores próprios da planta como por fatores do ambiente (LUZ; EHLERT; INNECCO, 2009). Volatilidade, insolubilidade em água e métodos de extração podem afetar significativamente os resultados encontrados nos bioensaios (VALGAS et al., 2007; TRIPOLI et al., 2007).
Assim, muitos autores concordam com o fato de que a comparação entre os estudos que investiguem a suscetibilidade microbiana aos produtos naturais deve levar em consideração muitos aspectos, incluindo a técnica usada, o meio de cultura empregado, o micro-organismo e
