IMUNOCITOQUÍMICA, USANDO REAÇÃO DE
IMUNOPEROXIDASE
Este protocolo descreve a marcação de células, estimuladas com diversos agentes, através do uso combinado de um anticorpo primário que reconhece a proteína nuclear de interesse, um anticorpo secundário biotinilado e uma peroxidase associada a avidina, resultando numa reação de imunoperoxidação altamente específica e que pode ser quantificada contando-se as células com os núcleos
II – MATERIAIS E MÉTODOS 74
marcados pelo acúmulo localizado do produto da reação de peroxidação. Este protocolo foi realizado com células parentais e clones transfectantes mantidos em cultura em meio DME/soro 10%, com ou sem G418, na ordem que se segue abaixo: 1. Após tripsinização e suspensão das células cultivadas, plaquear 40µl em lamínulas de vidro circulares com cerca de 1,5cm de diâmetro. Deixar na estufa por 30min em meio DME/soro 10% para aderência das células, em placas de 6 poços (35mm diâmetro), contendo duplicatas de lamínulas em cada poço. A seguir adicionar 2 ml deste meio e deixar ao menos 24h em cultura, atingindo assim confluências variáveis para cada tipo celular e necessidade experimental.
2. Retirar o meio, lavar 2x com PBS, 2x com DME, adicionar meio DME/soro 0,5% e deixar em estufa por 24h para carenciamento.
3. Estimular as células carenciadas com as drogas ou substâncias de intesse por adição ao meio de cultura das placas.
4. Retirar o meio das placas com as lamínulas e lavar 1x com PBS. 5. Acrescentar 2 ml de formaldeído 3,7% em PBS fresco por 20 min.
6. Retirar o fixador, lavar 3x com PBS e deixar as lamínulas em PBS na geladeira até o dia da imunoperoxidação (não excedendo 3 dias).
7. Retirar da geladeira e deixar as lamínulas atingirem a temperatura ambiente. Enquanto isso preparar uma tampa de placa com 24 poços, marcando as condições de tratamento e colocando um parafilme bem esticado. Esse parafilme deverá ser mudado cada vez que for necessário. Sobre o parafilme colocar, em cada local referente a um poço, 40µl de NP40 1% em PBS e, com uma pinça, pegar cada lamínula e colocar sobre a gota com as células voltadas para baixo; incubar por 20min nas condições ambiente.
8. Voltar as lamínulas para as placas devidamente marcadas contendo PBSA e lavar com PBSA por 3x (as lavagens são sempre com o material das lamínulas voltado para cima). No parafilme colocar 40µl do soro normalizador 5% em PBSA contendo Triton 0,3% por 1h a temperatura ambiente (um soro de animal onde foram feitos os anticorpos secundários que vem no kit usado).
9. Voltar as lamínulas para as placas e lavar com PBSA 3x por 10min cada. Colocar sobre o parafilme 40µl do anticorpo primário desejado, na concentração previamente titulada, diluída em PBSA + 0,3% de Triton e BSA 1mg/ml. Deixar durante a noite na geladeira, em caixa plástica com tampa cujo fundo contenha uma espuma de borracha embebida com água. É importante homogeneizar em Vortex o frasco do anticorpo antes e depois de diluído.
10. Voltar as lamínulas para as placas e lavar com PBSA 3x por 10min cada.
11. Colocar sobre o parafilme 40µl de anticorpo secundário biotinilado diluído em PBSA + 0,3% Triton e incubar por 1h nas condições ambiente. Este anticorpo secundário é diluído 1:800 (v/v) em PBSA + 0,3% Triton com 15µl do soro normal (1,5%) e 5µl (0,5%) de anticorpo secundário. Nesta fase já preparar o complexo ABC (980 µl do PBSA + 0,3% de Triton com 10µl do reagente A e 10µl do reagente B), pois é necessário deixá-lo descansando por no mínimo 30min antes do uso.
12. Voltar as lamínulas para as placas e lavar 3x com PBSA por 10 min cada.
13. Colocar sobre o parafilme 40µl do complexo ABC e incubar por 1h. Retirar as pastilhas de DAB e de peróxido de amônia do freezer.
14. Voltar as lamínulas para as placas e lavar 3x com PBSA por 10min. Preparar o DAB, dissolvendo uma pastilha de cada em 15ml de água deionizada.
II – MATERIAIS E MÉTODOS 76
15. Retirar, com pipeta Pasteur, o PBSA das placas contendo as lamínulas e adicionar o DAB por ~1min (trabalhar em capela de fluxo e com luvas porque o DAB é suspeito de ser carcinogênico). Retirar o DAB e lavar as lamínulas 2x com água. 16. Deixar em água até montar a lâmina. A lâmina dever ser previamente lavada, limpa e marcada com as indicações dos diferentes tratamentos. O lado sem células da lamínula é seco com papel e então ela é colada com “entellan” com as células voltadas para cima e deixada secar por alguns minutos. Em nenhuma outra ocasião dos procedimentos anteriores este material (células) pode ficar seco.
17. Contracorar as células da seguinte forma: a) mergulhar a lâmina em solução etanólica de hematoxilina por 1min; b) lavar bem em água corrente e por último lavar uma vez em água destilada; c) mergulhar a lâmina em solução saturada de LiCO3; d)
lavar bem em água corrente e a última vez com água destilada e e) deixar secar por várias horas ou durante a noite, à temperatura ambiente.
18. Montar, depois de seca, com uma gota de óleo mineral sobre uma lamínula de 18x18mm. Nas extremidades da lamínula quadrada colocar pequenas gotas de esmalte para não deixar a lamínula se deslocar.
19. Analisar em microscópio de luz, contando um total de ~500 células de cada lamínula, verificando as que possuem núcleo marcado ou não comparando-as com o contrôle negativo (células não tratadas). Fotografar no mesmo microscópio com filtros e aumentos adequados para comprovação e registro dos resultados. Cada experimento refere-se a média das duas lamínulas e os resultados apresentados referem-se a médias de 2 ou 3 experimentos independentes ± desvio padrão.