Determinação da Massa Molecular

2.2.1. Electroforese em Gel de Poliacrilamida em Condições Desnaturantes

A electroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes permite-nos verificar o número de subunidades diferentes que compõem a proteína, bem como a sua massa molecular aparente. Verificou-se a presença de apenas uma banda, num gel de 15% de poliacrilamida na presença de 0.1% SDS, com uma massa molecular de aproximadamente 37 kDa (ver figura I.2.10, do Capítulo 2). Assim, à semelhança das restantes CCP’s bacterianas [2-5], a CCP de Ps. stutzeri é constituída por apenas um tipo de subunidade.

2.2.2. Espectrometria de Massa

Da análise da CCP de Ps. stutzeri por Espectrometria de Massa, obteve-se um peso molecular de (36 248.5 ± 8.5) Da. Este valor é bastante semelhante aos dos pesos moleculares das outras CCP’s conhecidas, indicados na tabela I.I.2 do Capítulo 1.

2.2.3. Cromatografia de Exclusão Molecular

2.2.3.1. Equilíbrio Dímero-Monómero

A cromatografia de exclusão molecular, não pode ser usada como uma medida muito exacta da massa molecular de proteínas que não sejam esféricas, como é o caso da CCP. No entanto, pode fornecer indicações sobre o seu estado de agregação.

No Capítulo 1 foi referido que a CCP de Pa. denitrificans, no seu estado nativo, se encontra num equilíbrio dímero-monómero. Este, pode ser verificado em cromatografia de exclusão molecular, se forem aplicadas na coluna diferentes concentrações da enzima. No caso da CCP de Pa. denitrificans são obtidas diferentes massas moleculares, dependendo da concentração aplicada [6].

A injecção da CCP de Ps. stutzeri numa coluna Superdex 75 (Amersham Biosciences 1×30 cm), calibrada com padrões de pesos moleculares (ver tabelas I.3.2, e I.3.3 e figura I.3.1),

revelou uma massa de aproximadamente 60 kDa. Este resultado é praticamente

Tabela I.3.3. Efeito da concentração da CCP de Ps. stutzeri no Rf em cromatografia de exclusão molecular.

[CCP] (µM) Rf 1 Peso Molecular

(kDa) 6 1.198 59.5 15 1.193 60.4 22 1.189 61.1 Tabela I.3.2. Calibração da coluna de exclusão molecular, Superdex-75.

Padrão Peso Molecular (Da) Rf 1

BSA 66 000 1.19 Ovalbumina 45 000 1.29 Anidrase Carbónica 29 000 1.45 Quimotripsina A 20 200 1.54 Citocromo c de cavalo 12 400 1.70 Aprotinina 6 500 2.00

Tendo em conta o peso molecular de 36.2 kDa, obtido por espectrometria de massa, no estado nativo a CCP de

Ps. stutzeri deverá apresentar uma constituição homodimérica. A sua estrutura quaternária é do tipo α2.

No entanto, o pico da CCP eluída desta coluna apresenta um padrão complexo, parecendo haver um arrastamento (uma “cauda”), que poderá ser devido a uma monomerização parcial ao percorrer a coluna.

1 _{O coeficiente de retenção, Rf, é determinado pela razão entre os tempos de retenção do pico da} proteína e do pico do azul de dextrano (ver Apêndice B).

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3.7 4.2 4.7 log(Peso Molecular) Rf

Figura I.3.1. Recta de Calibração da Coluna de Exclusão Molecular, Superdex-75. Equação da recta: Rf=-0.80×log(PM)+5.01.

2.2.3.1. Outras Formas de Agregação

A injecção da CCP nativa numa outra coluna de exclusão molecular, Sephadex G150-50, originou resultados semelhantes, apenas se obtendo uma massa molecular aparente ligeiramente diferente: 67 kDa (ver tabela I.3.4. e figura I.3.2).

0.1 0.2 0.3 0.4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0.1 0.2 0.3 0.4 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 A B C D A410 A410 A410 A410 Número da Fracção

Figura I.3.2. Cromatografia de exclusão molecular da CCP de Ps. stutzeri na Sephadex G150-50. A. 175 nmol de CCP em 2 ml de tampão de eluição (ver Apêndice B), contendo 2 mM CaCl2. B.

30 nmol de CCP em 2 ml de tampão de eluição, contendo 2 mM CaCl2. C. 30 nmol de CCP em

A adição de EGTA a uma enzima tem como intuito quelar todo o cálcio que esta possa possuir ligado.

Se na columa Sephadex G150-50 se adicionar EGTA ao tampão de eluição, a massa molecular aparente obtida para a CCP de Ps. stutzeri é de 51 kDa. De acordo com o modelo proposto para a CCP de Pa. denitrificans [7], na ausência de cálcio, a enzima encontra-se numa forma monomérica. Assim sendo, a massa de 51 kDa deverá reflectir o estado monomérico da CCP de Ps. stutzeri. A discrepância entre este valor e a massa obtida por espectrometria de massa, será muito provavelmente devida à forma alongada do monómero de CCP, que faz com que esta seja eluída da coluna com um tempo de retenção inferior ao esperado. O valor da massa molecular aparente da CCP de Pa. denitrificans determinado nestas mesmas condições foi idêntico (ver tabela I.3.4. e figura I.3.3.).

Tabela I.3.4. Cromatografia de exclusão molecular das CCP’s de Ps. stutzeri e Pa. denitrificans na coluna Sephadex G150-50. Eluição com um gradiente isocrático de 20 mM Tris-HCl pH=8, 100 mM NaCl. Nos casos especificados na tabela adicionou-se EGTA ou cálcio ao tampão de eluição.

Peso Molecular (kDa) Condições de Eluição

CCP Ps. stutzeri CCP Pa. denitrificans [8]

Nativa 67  Com EGTA 1 mM 51 51 Com CaCl2 2 mM 80-87 74 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 0 20 30 40 50 60 70 80 90 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 A B A410 Número da Fracção A410 10

Figura I.3.3. Cromatografia de exclusão molecular da CCP de Pa. denitrificans - Sephadex G150-50. A. 30 nmol de CCP em 2 ml de tampão de eluição, contendo 2 mM CaCl2.. B. 30 nmol de CCP em

A presença de cálcio no tampão de eluição, faz com que massa molecular aparente obtida para a CCP seja mais elevada, cerca de 80-87 kDa (ver figura I.3.2), o que deverá corresponder a outras formas de agregação. Isto não acontece com a CCP de Pa. denitrificans, a qual nestas mesmas condições apresenta uma massa molecular aparente de 74 kDa, valor coincidente com o previsto para o dímero (figura I.3.3).

2.2.3. Ultracentrifugação

Os perfis de velocidade de sedimentação da CCP de Ps. stutzeri foram analisados segundo o método de DCDT+ (ver Apêndice B), obtendo-se as distribuições gaussianas de coeficientes de sedimentação apresentadas na figura I.3.4. Na tabela I.3.5 são apresentados os valores dos coeficientes de sedimentação obtidos para a CCP de Ps. stutzeri, em comparação com os valores recentemente publicados para a CCP de Pa. denitrificans [9].

0 0.1 0.2 0 2 4 6 8 10 g(s*) s* (20,w) (svedbergs) EGTA Cálcio Nativa

Figura I.3.4. Distribuição gaussiana de coeficientes de sedimentação dos resultados de ultracentrifugação da CCP nativa na presença de 1 mM EGTA e na presença de 2 mM CaCl2.

Tabela I.3.5. Coeficientes de sedimentação, s20,w, para as CCP’s de Ps. stutzeri e Pa. denitrificans

em diferentes condições experimentais.

Coeficiente de sedimentação, s20,w

(Svedbergs) Condições Experimentais

CCP Ps. stutzeri CCP Pa. denitrificans [9]

Nativa 4.67 2.69

Com EGTA 1 mM 2.83 2.54

Com CaCl2 2 mM 5.58 4.78

O valor do coeficiente de sedimentação obtido para a CCP nativa de Ps. stutzeri é muito semelhante ao obtido para a CCP de Pa. denitrificans na presença de cálcio, condição que nesta enzima é reconhecidamente favorecedora da existência do dímero. Assim sendo, e tendo em conta os resultados já apresentados de cromatografia de exclusão molecular, podemos concluir que a CCP de Ps. stutzeri no seu estado nativo, se apresenta sob a forma de dímero, sem necessitar da adição de cálcio.

A adição de EGTA dá origem à monomerização de ambas as CCP’s, o que se encontra reflectido nos valores semelhantes de coeficiente de sedimentação, consistentes com o menor peso molecular do monómero.

A sedimentação da CCP de Ps. stutzeri na presença de cálcio, revelou um resultado surpreendente, mas coerente com as observações de cromatografia de exclusão molecular. A adição de cálcio provoca um maior estado de agregação (superior ao dímero) e os resultados obtidos não podem ser explicados pela presença de uma única espécie. Este fenómeno nunca foi observado na CCP de Pa. denitrificans.

3. Caracterização Espectroscópica